CN102690327A

CN102690327A - 肠道病毒71型的中和表位多肽及其用途

Info

Publication number: CN102690327A
Application number: CN2011103579949A
Authority: CN
Inventors: 葛胜祥; 徐飞海; 翁祖星; 程通; 何德磊; 陈毅歆; 陈自敏; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Current assignee: XIAMEN WANTAI KAIRUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2031-11-11
Also published as: CN102690327B

Abstract

本发明涉及肠道病毒71型的中和表位多肽及其用途。具体而言，本发明提供了肠道病毒71型中和表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，其融合蛋白或耦联物，及应用该多肽于预防或诊断的用途，本发明还提供特异识别该中和表位多肽的单克隆抗体，及其用于诊断或治疗手足口病的用途。

Description

肠道病毒71型的中和表位多肽及其用途

发明领域

本发明涉及人肠道病毒71型中和表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，及应用该多肽或保守变异体或活性片段于预防或诊断的用途。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。早期发现的手足口病的病原体主要为柯萨奇病毒A16型(以下简称CA16)，肠道病毒71型(以下简称EV71)最早是在1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离获得，但一直到1974年EV71才被鉴定并命名。此后EV71与CA16交替出现，成为手足口病的主要病原体。EV71传染性强，易引起暴发或流行。自病毒发现以来在全世界已至少造成十多次爆发流行，波及到美洲、欧洲、澳洲和亚洲的四十多个国家和地区。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始东亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共有2628人发病，4-6月有29例病人死亡。1998年，我国台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，监测哨点共报告129106例病例，80％有手足口病和中枢神经症状。其中重症病人405例，死亡78例。

我国大陆地区自1995年武汉病毒研究所首次从手足口病人中分离出EV71病毒以来，全国很多地区均有报道。2008年3月在安徽阜阳地区流行的也是EV71。由于疫情的严重性和社会的广泛关注，卫生部已经将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病，并紧急成立了防控组。

近年来，EV71引起的手足口病，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此开发快速的诊断试剂与安全有效的预防和治疗性疫苗具有重大意义。本实验室利用不同时间、不同地点分离到的EV71不同的代表株免疫小鼠，进行单克隆抗体的制备，已制备出557株对EV71有特异性反应的单抗。并利用基于ELISPOT的EV71高通量中和实验方法对上述单抗的中和活性进行鉴定，发现有6株单抗对目前所用的EV71各代表株均有中和活性，说明EV71病毒可能存在高保守性的中和位点，为EV71的中和表位鉴定提供了突破口。

ELISPOT是近年来新兴起来的一种检测T细胞应答的方法。它最早出现于上世纪80年代应用于抗体分泌细胞的研究；1988年首次应用于细胞因子分泌的检测。随着该技术的不断改进和发展，目前已较为成熟和完善，在世界上各大实验室、临床检验上广泛应用，大有完全取代以前种种研究T细胞免疫应答旧方法的趋势。本中心成功建立了基于酶联免疫斑点法(ELISPOT)的EV71、CA16快速中和试验，并申请专利“快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒”一项(专利申请号：200910143481.0)。与传统中和试验相比，耗时短(从7天以上缩短为30个小时左右)、通量高、稳定、客观。该方法的基本原理是将待测样品与EV71或CA16病毒混匀孵育一段时间后加到细胞培养板中感染细胞，随后固定细胞，通过EV71或CA16特异性酶标抗体与EV71或CA16病毒特异性结合，而后在TMB显色条件下，被EV71病毒感染的RD细胞出现肉眼可见的蓝色斑点，而未被感染的细胞则无斑点。

发明内容

在第一方面，本发明提供了肠道病毒71型VP1蛋白中位于215-218位氨基酸的中和表位多肽，其氨基酸序列为：KQEK(SEQ ID NO：1)。本发明还提供分离的中和表位多肽，其氨基酸序列为：KQEK。

在第二方面，本发明还提供了上述多肽免疫获得的血清，具有中和肠道病毒71型的能力。

在第三方面，本发明提供了本发明上述多肽的变异体。

本发明提供了分离的中和表位多肽，其选自：

(a)中和表位多肽，它是肠道病毒71型VP1蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5-10个氨基酸)，并具有诱导中和抗体产生的能力；

(b)中和表位多肽，它是在氨基酸序列KQEK的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换而得到的，仍具有诱导中和抗体产生的能力；

(c)中和表位多肽，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比不同在于它具有一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换，仍具有诱导中和抗体产生的能力。

在一个实施方案中，提供中和表位多肽，它是肠道病毒71型VP1蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5-10个氨基酸)，并在氨基酸序列KQEK的基础上经一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸而得到的，仍具有诱导中和抗体产生的能力。

在另一个实施方案中，提供中和表位多肽，它是肠道病毒71型VP1蛋白的、含有氨基酸序列KQEK的片段(其长度可以是5-20个氨基酸，例如5-15个、5-10个氨基酸)，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比具有一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸，仍具有诱导中和抗体产生的能力。

在另一个实施方案中，提供中和表位多肽，氨基酸序列是TFGEHKQEKDLEYG(SEQ ID NO：2)或者是FGEHKQEKDLEY(SEQID NO：3)或者是GEHKQEKDLE(SEQ ID NO：4)，更优选地是EHKQEKDL(SEQ ID NO：5)或者是HKQEKD(SEQ ID NO：6)或者是HKQEK(SEQ ID NO：7)或者是KQEKD(SEQ ID NO：8)。

在另一个实施方案中，所述中和表位多肽包含HKQEKD或者HKQEK或者KQEKD。

上述多肽，经一个或者几个氨基酸的延伸、替换而得到的变异体，仍具有诱导中和抗体产生的能力，其氨基酸序列优选地是TFGEHKQEKDLEYG或者是FGEHKQEKDLEY或者是GEHKQEKDLE，更优选地是EHKQEKDL或者是HKQEKD或者是HKQEK或者是KQEKD。

在第四方面，本发明还提供了包含上述所有任一中和表位多肽的融合蛋白，或所述中和表位多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述中和表位多肽的类病毒颗粒。

本发明还提供了包含上述所有任一中和表位多肽和其它多肽的融合蛋白。所述中和表位多肽和所述其它多肽任选通过连接序列连接。本发明还提供了由上述所有任一中和表位多肽、其它多肽以及连接所述中和表位多肽和所述其它多肽的任选的连接序列组成的融合蛋白。其中作为融合蛋白一部分的所述其它多肽可以是肠道病毒71型可能暴露于表面的肽段，例如：EV71病毒VP1蛋白上的208-232aa区段，其氨基酸序列是YPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGT(SEQ ID NO：9)。连接序列可以是任意可用的限制性内切酶的酶切序列：例如BamH I的酶切序列GGATCC、EcoR I的酶切序列GAATTC等。

本发明还提供所述中和表位多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物。所述偶联可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白等蛋白类载体，另有重组载体可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。

本发明还提供展示上述中和表位多肽的类病毒颗粒。所述中和表位多肽典型地通过与载体蛋白融合，经过蛋白纯化和组装后可形成类病毒颗粒，并将所述中和表位多肽展示在类病毒颗粒表面，使其仍保持诱导中和抗体产生的能力，其中所述载体蛋白优选地为HBcAg。

在第五方面，本发明提供了编码上述任何多肽，和所有融合蛋白或类病毒颗粒的核酸序列或包含该核酸序列的核酸构建体或核酸载体。

在第六方面，本发明还提供了上述任何核酸载体转化的宿主细胞，例如微生物宿主细胞如大肠杆菌宿主细胞。

在第七方面，本发明还提供了上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒用于制备预防手足口病的疫苗的用途。

本发明还提供了上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，用于预防手足口病。

本发明还提供疫苗，其包含上述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体如佐剂。

本发明还提供预防手足口病的方法，包括给予动物或者人免疫有效量的上述疫苗或者任何中和表位多肽或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒。

在第八方面，本发明还提供了上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒在制备用于诊断手足口病的组合物或者诊断剂中的用途。

本发明还提供了上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，用于诊断手足口病。

本发明还提供了诊断手足口病的方法，包括用上述所述任何中和表位多肽，或任何融合蛋白或复合物或类病毒颗粒和来自患者的生物样品接触，并检测中和表位多肽或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒与样品中可能存在的抗体之间形成的特异性免疫结合物。

本发明还提供组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含本发明任何中和表位多肽，或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体。

本发明还提供抗本发明任何中和表位多肽，或融合蛋白或复合物或类病毒颗粒的抗血清，其具有中和肠道病毒71型的能力。

在第九方面，本发明还提供了一种抗体(它可以优选是单克隆抗体或中和抗体)，特异识别上述的任何一种多肽。所述抗体可为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。

在一个优选实施方案种，本发明所述的抗体是广谱中和单克隆抗体，对多种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15种)EV71型病毒具有中和能力。所述广谱中和单克隆抗体的优选例子有例如单抗H3B10和K8G2，产生单抗H3B10和K8G2的小鼠杂交瘤细胞株已于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，位于武汉的武汉大学)进行保藏，保藏日是2011年11月08日，H3B10的保藏号是CCTCC-C2011106，K8G2的保藏号是CCTCC-C2011105。

本发明还提供特异识别上述的任何一种多肽的抗体(它可以优选是单克隆抗体或中和抗体)，用于诊断手足口病或者治疗手足口病。

在第十方面，本发明还提供了上述抗体在制备用于诊断手足口病的组合物中的用途。

在第十一方面，本发明还提供了上述抗体在制备用于治疗手足口病的药物组合物中的用途。

本发明还提供组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含任何上述抗体，和任选的可药用载体。

本发明还提供诊断手足口病的方法，包括将本发明的抗体和来自患者的生物学样品接触，并检测该抗体和样品中可能存在的抗原之间形成的特异性免疫结合物。

本发明还提供治疗手足口病的方法，包括给患者(动物或者人)给予本发明的抗体。

附图说明

图1为pTO-T7-C149的质粒示意图。

图2为pTO-T7-C149-208-232aa的质粒示意图。

图3为融合蛋白EV71-C149-4纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中1：表达EV71-C149-4的大肠杆菌(E.coli)全部溶胞产物；2：EV71-C149-4之超声溶胞产物的上清；3：EV71-C149-4超声上清65℃水浴中热变性30min后离心后上清；4：C149蛋白对照。

图4为EV71-C149-4重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图(放大25000倍)。

图5为显示EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5与各种单抗之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度雷达图。

图6为显示合成肽EV71-7、8、9、10、11、12、13、14与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图7为显示合成肽EV71-CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG、CH、CI、CJ、CK、CL、CM、CN、CO、CP与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图8为显示合成肽EV71-CRA、CRB、CRC、CRD、CRE、CRF、CRG、CRH、CRI、CRJ、CRK、CRL、CRM、CRN、CRO、CRP与广谱中和抗体K8G2和H3B10之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图9为显示EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6与不同稀释度的广谱中和抗体K8G2之间的亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的强度矩形图。

图10为实施例9所述单抗K8G2的EV71感染保护动物试验中感染后小鼠体重测量结果。横坐标表示感染后天数，纵坐标表示小鼠体重(单位g)。结果显示，在EV71感染新生鼠模型中广谱中和单抗K8G2可有效保护EV71感染鼠免于发病。其中感染组体重增长缓慢，平均每日增长不足1g，体型瘦弱；K8G2保护组平均体重增长接近阴性对照组，体型健康同阴性对照组。

图11为在EV71感染新生鼠保护实验中各实验组代表性小鼠的体征图像(实验见实施例9)。A图和B图均为实验开始后第5天的体征，A图左侧鼠为阴性组，右侧鼠为EV71感染组；B图左侧鼠为EV71感染组，右侧鼠为K8G2保护组。

具体实施方式

除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。

实施例1 广谱中和单抗的鉴定

利用基于ELISPOT的EV71高通量中和实验方法(参见200910143481.0)对本中心制备的557株EV71特异性单抗的中和活性进行鉴定，结果显示其中64株对JS06-52-3毒株具有中和活性。随机选取其中的22株中和单抗，考察其对不同亚型的12株代表性EV71毒株的中和活性。结果见表1，表1数值所表示为各单抗针对不同毒株EV71病毒的中和活性滴度。由表1可知，6株单抗对各代表株均有中和活性，其中H3B10(保藏号CCTCC-C2011106)和K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)为广谱高中和活性单抗，其余16株单抗对3株B4亚型、1株B5亚型和1株C4亚型的EV71毒株均无中和活性。

实施例2 EV71-VP1表面多肽与HBV cAg蛋白融合表达

软件分析

通过DS Visualizer软件分析推测EV71病毒VP1结构蛋白(其氨基酸序列见GenBankNo.ACM47545.1)暴露在颗粒表面的5个可能片段，分别为92-111aa(其氨基酸序列为：EIDLPLKGTTNPNGYANWDI(SEQID NO：10))、136-147aa(其氨基酸序列为：TFVACTPTGEVV(SEQ IDNO：11))、155-168aa(其氨基酸序列为：FVPPGAPKPDSRES(SEQ IDNO：12)、208-232aa(其氨基酸序列为：YPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGT(SEQ ID NO：13))和240-249aa(其氨基酸序列为：TSKSKYPLVV(SEQ ID NO：14))肽段。

融合表达载体的构建

利用HBcAg的1-149aa(其氨基酸序列为：GenBank No.AF233235)在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本实验室将该149氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7(也可以使用大肠杆菌表达载体)中，并以连接子(其氨基酸序列为GGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGG(SEQ ID NO：15))替代HBcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸(其对应氨基酸为PA)，并在265nt-270nt处引入GGATCC，274nt-279nt处引入GAATTC(相对pTO-T7-C149)以引入两个限制性内切酶识别位点(BamH I和EcoR I)构建了突变型HBc表达质粒pTO-T7-C149。(该质粒中C149的氨基酸序列为：HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQ IDNO：16)，核苷酸序列为：catATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTTTGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA(SEQ IDNO：17)，外源蛋白在C149第93个氨基酸处插入。)。HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayorimmunodominant region，78-83aa)的融合不会改变其颗粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于颗粒表面。

将从某EV71毒株中提取的RNA进行反转录后得到的产物回收、纯化、鉴定后作为模板，分别应用表2所列引物(该引物合成由上海博亚公司进行)进行PCR扩增，扩增出的序列经BamH I和EcoR I(均购自日本TAKARA公司)双酶切后回收纯化得到片段。同时以BamH I和EcoR I双酶切载体pTO-T7-C149，回收载体后与片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566进行表达鉴定及质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒即插入所需的目的片段，分别命名为C149-136-147、C149-92-111、C149-155-168、C149-208-232、C149-240-249。构建质粒图如图1、图2所示(图2仅以C149-208-232为例，该融合蛋白的氨基酸序列为：HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQ ID NO：18)，斜体为插入的片段)。

融合蛋白的表达及纯化

将C149-136-147、C149-92-111、C149-155-168、C149-208-232、C149-240-249表达质粒表达出来的融合蛋白分别称为EV71-C149-1、EV71-C149-2、EV71-C149-3、EV71-C149-4、EV71-C149-5。分别将含有上述五种表达质粒之一的ER2566菌种，接种于4mL含有硫酸卡那霉素(购自AMRESCO公司)的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1∶1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有硫酸卡那霉素)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，25℃诱导6h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件为：工作时间：3min/瓶；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：60％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白均为上清表达。

由于表达上清中含有很多杂蛋白，所以我们采用以下方式进行纯化并促进蛋白自发组装形成颗粒：将超声离心后得到上清至于65℃水浴中热变性30min，12000rpm离心10min，上清样品进行SDS-PAGE鉴定纯度，见图3(仅以EV71-C149-4为代表，其他融合蛋白与此类似)。然后将纯化后的蛋白在20mM PB6.0含0.3M NaCI的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒，再进行电镜观察，组装成功的颗粒呈均匀的空心球体，见图4(仅以EV71-C149-4为代表，其他融合蛋白与此类似)。

表2 EV71-VP1表面多肽融合蛋白克隆引物序列

实施例3 融合蛋白EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5的活性鉴定

将实施例2所述五种融合蛋白分别以1μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。每孔加入84株酶标抗体稀释液(稀释液配方同封闭液)(1∶1000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。结果见图5。由图5的结果可知，在所选的84株不同代表性的EV71单克隆抗体中，有11株单抗对EV71-C149-4有较高的反应性，其中8株单抗均有中和活性，尤其H3B10和K8G2为广谱中和抗体。这提示在EV71-VP1中208-232aa这段多肽中可能存在广谱中和位点。

实施例4 EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白的免疫原性分析

将实施例2所述经过纯化并组装的五种融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma)，共加强三针，在第三针加强后的第11天采血，并采用ELISPOT的EV71高通量中和实验方法进行EV71中和检测。结果见表3(表中数值代表中和滴度)。由表3可知，EV71-C149-4展示肽免疫的5只小鼠血清对EV71毒株(JS06-52-3)具有一定的中和活性，中和滴度在1/32-1/256之间，而其它四个展示肽免疫的鼠血清均无中和活性。

表3：EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白免疫鼠血清对EV71毒株的中和活性

免疫原	鼠1	鼠2	鼠3	鼠4	鼠5
						EV71-C149-1	0	0	0	0	0
EV71-C149-2	0	0	0	0	0
						EV71-C149-3	0	0	0	0	0
EV71-C149-4	64	64	32	128	256
						EV71-C149-5	0	0	0	0	0

同时，我们从各实验组中分别选取1只小鼠血清对C2、C4和B5等不同亚型的EV71毒株进行中和检测(采用ELISPOT的EV71高通量中和实验方法)。结果见表4(表中数值代表中和滴度)。由表4可知，C149-208-232aa展示肽对6株代表性EV71毒株的均具有一定的中和活性，且不存在亚型差异，而其它4种展示肽对不同EV71毒株仍然无中和活性。这再一次证明EV71病毒VP1的208-232aa区段存在一个中和表位，且具有一定的广谱性。

表4：EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白免疫鼠血清对不同EV71毒株的中和活性

实施例5在合成肽库中筛选识别广谱中和抗体的多肽

根据EV71-VP1的氨基酸序列，设计合成了横跨208-232aa肽段的8条合成肽(表5)，编号为：EV71-7、EV71-8、EV71-9、EV71-10、EV71-11、EV71-12、EV71-13、EV71-14(该合成肽合成由上海博亚公司进行)。将上述合成肽分别以1上述合成肽的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。将广谱中和抗体酶标记物(K8G2-HRP和H3B10-HRP)1∶1000稀释(稀释液配方同封闭液)后加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值，结果见图6。由图6的结果可知，所有肽段中仅EV71-8(VP1：208-222aa)和EV71-9(VP1：213-227aa)能识别上述两株广谱中和单抗，说明该广谱中和表位存在于EV71病毒VP1的208-227aa区段，该区段的序列为：YPTFGEHKQEKDLEYGACPN。

表5：EV71-7、8、9、10、11、12、13、14合成肽氨基酸序列

实施例6多肽库与HBV cAg蛋白的融合表达及活性鉴定

以EV71病毒VP1的208-227aa区段为母区段，分别从N端和C端递减一个氨基酸，设计了32条多肽(表6)，用以鉴定中和表位的关键氨基酸。该32条多肽分别插入HBcAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为EV71-CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG、CH、CI、CJ、CK、CL、CM、CN、CO、CP和CRA、CRB、CRC、CRD、CRE、CRF、CRG、CRH、CRI、CRJ、CRK、CRL、CRM、CRN、CRO、CRP。上述融合蛋白的表达载体的构建方法与EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白表达载体的构建方法相同，所用引物如表7。通过PCR产物双酶切回收纯化后，连接构建的载体pTO-T7-C149，构建成表达质粒(具体方法详见实施例2)。

表6：EV71-CA至EV71-CRP融合蛋白在HBc载体上插入的目的肽段氨基酸序列

表7 EV71-CA至EV71-CRP融合蛋白克隆引物序列

上述构建的32融合蛋白表达和纯化与EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白的表达、纯化方法相同(具体方法详见实施例2)。

ELISA法检测EV71-CA等32个融合蛋白活性

将上述32条展示多肽分别以1μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。将广谱中和抗体酶标记物(K8G2-HRP和H3B10-HRP)1∶1000稀释后(稀释液配方同封闭液)加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值，结果见图7和8。由图7结果可知，EV71-CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG、CH对H3B10(保藏号CCTCC-C2011106)和K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)有很好的反应性，而EV71-CI、CJ、CK、CL、CM、CN、CO、CP则不能识别K8G2和H3B10，所以活性的临界片段为EV71-CH(215-227aa)，说明在EV71病毒VP1的208-227区段所存在的中和表位的N端关键氨基酸为215位的氨基酸。同样，由图8的结果可知，EV71-CRA、CRB、CRC、CRD、CRE、CRF、CRG、CRH、CRI、CRJ对H3B10(保藏号CCTCC-C2011106)和K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)均有反应，其中EV71-CRJ反应相对较弱，而EV71-CRK、CRL、CRM、CRN、CRO、CRP则不能识别该单抗，所以临界片段为EV71-CRJ(208-218aa)，说明在EV71病毒VP1的208-227区段所存在的中和表位的C端关键氨基酸为218位的氨基酸。

实施例7中和表位多肽与HBV cAg蛋白的融合表达及活性鉴定

以EV71病毒VP1的215-218aa区段为母区段，分别从N端和C端同时递增一个氨基酸，设计了6条多肽(表8)，用以鉴定中和表位的活性序列。该6条多肽分别插入HBcAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6。上述融合蛋白的表达载体的构建方法与EV71-C149-1、C149-2、C149-3、C149-4、C149-5融合蛋白表达载体的构建方法相同，所用引物如表9。通过PCR产物双酶切回收纯化后，连接构建的载体pTO-T7-C149，构建成表达质粒(具体方法详见实施例2)。

表8：EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白在HBc载体上插入的目的肽段氨基酸序列

肽编号	区段	氨基酸序列	SEQ ID NO：
				EV71-F1	VP1-215-218aa	KQEK	133
EV71-F2	VP1-214-219aa	HKQEKD	134
				EV71-F3	VP1-213-220aa	EHKQEKDL	135
EV71-F4	VP1-212-221aa	GEHKQEKDLE	136
				EV71-F5	VP1-211-222aa	FGEHKQEKDLEY	137
EV71-F6	VP1-210-223aa	TFGEHKQEKDLEYG	138

表9：EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白克隆引物序列

ELISA法检测EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白活性

将上述6条展示多肽分别以1μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150Mm NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃2h后抽干。将广谱中和抗体酶标记物(K8G2-HRP和H3B10-HRP)以1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四个10倍梯度稀释后(稀释液配方同封闭液)各加100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值，结果见图9。由图9(以K8G2-HRP为例)结果可知，融合蛋白EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6对K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)均有很好的反应性，其中EV71-F1对K8G2-HRP稀释度为1∶100000的稀释液反应性明显减弱，而EV71-F2、F3、F4、F5、F6则在K8G2-HRP的稀释度达到1∶1000000时才减弱。说明所展示的EV71中和表位多肽中，最短的活性中和表位为EV71-F1(215-218aa序列为：KQEK)，而最短的高活性中和表位为EV71-F2(214-219aa，序列为：HKQEKD)，也有可能介于EV71-F1和EV71-F2之间(即215-219aa或214-218aa，序列分别为：KQEKD和HKQEK)。

实施例8EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白的免疫原性分析

将实施例7述经过纯化并组装的六种融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫4只(以EV71-F1多肽为例，小鼠编号为：F11、F12、F13、F14)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂，共加强三针，在每次加强前均对小鼠采血(编号为S1-S4)，并在第三针加强后的第11天采血进行EV71中和检测(采用ELISPOT的EV71高通量中和实验方法)，结果见表10。由表10可知，EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6中和表位多肽所免疫小鼠，均能产生针对EV71毒株(JS06-52-3)的中和抗体，其中除EV71-F1的小鼠血清产生的中和抗体滴度较低(最高≤1∶32)外，其他5个片段EV71-F2、F3、F4、F5、F6均能刺激小鼠产生较高的中和滴度(最高≥1∶512)。该结果与实施例7中的多肽活性检测相类似，再一次说明了最短的活性中和表位为EV71-F1(215-218aa序列为：KQEK)，而最短的高活性中和表位为EV71-F2(214-219aa，序列为：HKQEKD)，也有可能介于EV71-F1和EV71-F2之间(即215-219aa或214-218aa，序列分别为：KQEKD和HKQEK)。

表10：EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白免疫鼠血清对EV71毒株的中和活性

同时，我们从各实验组中分别选取每只小鼠最后一份血清S4，对C2、C4和B5等不同亚型的EV71毒株进行中和检测，结果见表11。由表11可知，EV71-F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白免疫鼠血清对5株代表性EV71毒株均具有一定的中和活性，且不存在亚型差异。

表11：EV71-F1、F2、F3、F4、F5、F6融合蛋白免疫鼠血清对不同EV71毒株的中和活性

实施例9特异性识别上述EV71中和表位的广谱高中和活性单抗K8G2的EV71感染保护动物试验分析

实施例1所述的广谱高中和活性单抗K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)对EV71各基因型代表株均有中和活性，将其用于单抗治疗EV71感染动物模型试验中可以有保护EV71感染鼠免于发病。

实验新生鼠分组如下：阴性对照组、EV71感染组、K8G2保护组。新生鼠饥饿4小时后，对EV71感染组和K8G2保护组的新生鼠灌胃感染EV71病毒(具体形式为：经EV71病毒感染36小时后的RD细胞的细胞裂解液上清)，对阴性对照组的新生鼠灌胃接种无EV71病毒的RD细胞裂解液上清(具体形式为：未经EV71病毒感染的对照RD细胞的细胞裂解液上清)，攻毒剂量为1.0×10⁷CCID50；保护组在攻毒后2小时，对其腹腔注射K8G2(保藏号CCTCC-C2011105)单抗，剂量为150μg/只(新生鼠平均体重约5.0g)；以上动物均连续称重和观察14天。

实验结果(见图10、图11)：EV71灌胃攻毒3日后，感染组实验鼠开始出现发育迟缓，体型消瘦、轻微震颤、肢体无力等症状。攻毒后7天开始出现死亡(大多被母鼠吃掉)，而阴性对照组体重每日稳定增长，未见消瘦、肢体无力等症状。K8G2保护组体症状况同阴性对照组，未见异常。比较各组平均体重增长情况，感染组体重增长缓慢，平均每日增长不足1g，体型瘦弱；K8G2保护组平均平均体重增长接近阴性对照组，体型健康同阴性对照组。

Claims

1.分离的中和表位多肽，其氨基酸序列为：KQEK。

2.分离的中和表位多肽，其选自：

(c)中和表位多肽，它的氨基酸序列与氨基酸序列KQEK相比相差一个或者几个(例如1-5个、1-10个或1-15个)氨基酸的延伸和/或替换，仍具有诱导中和抗体产生的能力。

3.权利要求2所述的多肽，其中所述中和表位多肽包含HKQEKD或者HKQEK或者KQEKD。

4.权利要求2所述的多肽，其氨基酸序列是TFGEHKQEKDLEYG或者是FGEHKQEKDLEY或者是GEHKQEKDLE，更优选地是EHKQEKDL或者是HKQEKD或者是HKQEK或者是KQEKD。

5.包含权利要求1-4任一项所述多肽的融合蛋白，或所述多肽与其他蛋白或毒素或脂类等载体(如大分子载体或重组载体)偶联或融合而得到的复合物，或者展示上述多肽的类病毒颗粒。

6.编码权利要求1-4任一项所述多肽，权利要求5中所述融合蛋白或类病毒颗粒的核酸序列或包含该核酸序列的核酸构建体或核酸载体。

7.权利要求5中所述核酸载体转化的宿主细胞。

8.权利要求1-4任一项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒用于制备预防手足口病的疫苗的用途。

9.权利要求1-4任一项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒在制备用于诊断手足口病的组合物或诊断剂中的用途。

10.组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含权利要求1-4任一项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒，和任选的可药用载体。

11.抗权利要求1-4任一项所述多肽，或权利要求5所述融合蛋白或复合物或类病毒颗粒的抗血清，具有中和肠道病毒71型的能力。

12.抗体(所述抗体可以是例如单克隆抗体或者中和抗体)，特异识别权利要求1-4任一项所述的多肽。

13.权利要求12所述抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。

14.权利要求13所述的抗体，其是广谱中和单克隆抗体，对多种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15种)EV71型病毒具有中和能力，优选例如单抗H3B10和K8G2，产生单抗H3B10和K8G2的小鼠杂交瘤细胞株已于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，位于武汉的武汉大学)进行保藏，H3B10的保藏号是CCTCC-C2011106，K8G2的保藏号是CCTCC-C2011105。

15.权利要求12或13或14所述抗体在制备用于诊断手足口病的组合物或诊断剂中的用途。

16.权利要求12或13或14所述抗体在制备用于治疗手足口病的药物组合物中的用途。

17.组合物(如药物组合物或诊断组合物)，包含权利要求12或13或14所述抗体，和任选的可药用载体。