CN109402070A - 一种重组h7n9亚型禽流感病毒株、灭活标记疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种重组h7n9亚型禽流感病毒株、灭活标记疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、标记疫苗及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。重组H7N9亚型禽流感病毒株，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCC NO.V201862。通过测定HA效价、EID50、TCID50，结果显示拯救的病毒株保持了母本病毒株相似的生物学特性，具有较高的HA效价和EID50，经灭活乳化后制备的标记疫苗免疫鸡群产生的抗体水平较高，且该抗体能与鸡自然感染H7N9亚型禽流感病毒后产生的抗体相区别。

Description

一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、灭活标记疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明属于动物疫苗技术领域，具体涉及一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、标记疫苗及其制备方法。
背景技术
H7N9亚型禽流感病毒是一种新出现的人兽共患病病原，自从2013年首次在我国报道以来，在人类已引起5波流行。早期的H7N9亚型禽流感病毒对家禽为低致病性的，家禽感染后无明显症状，人类感染与接触感染家禽或污染的活禽交易市场有关。至2017年初，H7N9亚型禽流感病毒由于在HA裂解位点插入4个氨基酸使其具有连续的碱性氨基酸而变为高致病性的病毒，对鸡有很高的致死率。
为了控制H7N9亚型禽流感病毒在家禽中的传播，降低人因接触感染家禽及污染环境而导致感染的风险，我国已批准使用H7亚型重组禽流感病毒灭活疫苗，并取得了较好的防控效果。但是重组禽流感病毒灭活疫苗免疫后不能区分疫苗免疫和自然感染动物，无法通过血清学方法确认感染鸡群，从而对感染鸡群采取扑杀措施。因此，迫切需要研制出H7亚型禽流感区分自然感染和疫苗免疫动物(DIVA)疫苗，满足H7亚型禽流感净化扑灭的技术需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、标记疫苗及其制备方法，所述标记疫苗不仅能准确区分疫苗免疫和自然感染动物，而且能用于H7N9亚型禽流感的有效防控和净化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组H7N9亚型禽流感病毒株，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；
所述H3亚型的氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.1；
所述JD/17病毒株中的HA蛋白中氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.2；
所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCC NO.V201862。
本发明提供了所述的重组H7N9亚型禽流感病毒株的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用引物对KS-H7-1和JDH7H3-1-R扩增HA-1基因片段，用引物对JDH7H3-2-F和KS-H7-2扩增HA-2基因片段；
所述KS-H7-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
所述JDH7H3-1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述JDH7H3-2-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；
所述KS-H7-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；
(3)以步骤(2)得到的HA-1基因片段和HA-2的基因片段为模板进行重叠PCR扩增，得到序列替换的HA基因片段；
(4)将所述步骤(3)中序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI酶进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染，拯救得到重组H7N9亚型禽流感病毒株。
优选的，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增程序独立为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增体系独立为：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL25mM上游引物，0.5μL 25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μLDNA模板和18.5μL超纯水。
优选的，所述重叠PCR扩增的程序为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min40s，35个循环；72℃延伸10min。
本发明提供的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗的制备方法，包括以下步骤：
A.将所述重组H7N9亚型禽流感病毒株或所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒株接种SPF鸡胚，孵育，得到病毒尿囊液；
B.将所述病毒尿囊液和甲醛溶液混合，得到的混合液转移4℃的条件下震摇灭活24h，得到灭活病毒尿囊液；
C.当所述灭活病毒尿囊液的血凝效价>4log2时，将所述灭活病毒尿囊液依次与吐温80和白油混合，得到灭活病毒尿囊液混合物；
D.将所述灭活病毒尿囊液混合物乳化，得到重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
优选的，所述甲醛溶液的体积浓度为4％。
优选的，所述病毒尿囊液和甲醛溶液的体积比为43:7。
优选的，所述灭活病毒尿囊液、吐温80和白油的体积比为24:1:75。
本发明提供了所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
本发明提供了一种重组H7N9亚型禽流感病毒株，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；所述H3亚型的氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.1；所述JD/17病毒株中的HA蛋白中氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.2；所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCCNO.V201862。本发明在全病毒的基础上，对禽流感病毒的主要表面糖蛋白之一的HA蛋白进行改造，将HA蛋白的特异性表面抗原表位替换为H3亚型相应序列，实现病毒成功拯救。同时本发明提供的重组H7N9亚型禽流感病毒株，通过测定HA效价、EID50、TCID50，结果显示拯救的病毒株保持了母本毒株相似的生物学特性，具有较高的HA效价和EID50，且经灭活乳化后免疫鸡群产生的抗体水平较高，且该抗体能与H7N9亚型禽流感病毒感染鸡后产生的抗体相区别，适合作为标记疫苗的候选株。
同时，本发明提供的重组H7N9亚型禽流感病毒株选择在HA2蛋白进行改造，由于HA2蛋白本身比较保守，又不易发生嵌合性重组，重组后的HA蛋白中的抗原表位不易发生变异，保证后续制备的新疫苗来长期稳定保持疫苗效果。
本发明提供了所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗，是在上述方案所述的重组H7N9亚型禽流感病毒株的基础上灭活得到，经攻毒保护试验表明：免疫组在高致病性和低致病性H7N9亚型毒株攻毒后，在第1、3、5和7天，均未在喉头或泄殖腔棉拭中检测出病毒，保护率为100％，而母本毒株(JD/17病毒株)也仅在第1天和第3天检测出了对高致病性毒株或低致病性毒株的排毒，保护率为90％；这表明本发明提供的灭活标记疫苗免疫保护效果不低于母本毒株制备的疫苗，且无论对高致病性H7N9亚型AIV还是低致病性H7N9亚型AIV均有非常好的保护率。
生物保藏信息
H7N9禽流感病毒株(OrthomyxoviridaeAlphainfluenza virus)，H7N9禽流感病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年10月23日。地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，中国武汉大学，单位简称，CCTCC，生物保藏编号为CCTCC NO.V201862，菌株编号为JD/17。
附图说明
图1为本发明提供的标记疫苗的实验流程；
图2为蛋白芯片点样信息的示意图；
图3为各个HA亚型禽流感血清对H7-12肽的响应情况柱状图；
图4为间接免疫荧光试验验证多肽-偶联物免疫鸡血清的特异性结果图；
图5为疫苗株构建序列替换方案；
图6为疫苗候选株和母本毒株血清对H7-12的响应情况柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种重组H7N9亚型禽流感病毒株，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；
所述H3亚型的氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.1；
所述JD/17病毒株中的HA蛋白中氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.2；
所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCC NO.V201862。
在本发明中，所述重组H7N9亚型禽流感病毒株的构建思路如下：通过多肽芯片方法鉴定出JD/17病毒株的HA2特异性抗原表位，通过反向遗传技术缺失或修饰HA2抗原表位，具体是采用除H7亚型外与其同源性低的任何一种亚型流感病毒的相应序列替换HA2特异性抗原表位，由于采用除H3亚型之外的其他同源性低的亚型流感病毒的氨基酸序列不能成功实现病毒拯救，故选择H3亚型流感病毒的同源氨基酸序列替换JD/17病毒株的HA2特异性抗原表位，从而研制出H7N9亚型禽流感DIVA疫苗及其配套的检测技术，通过血清学检测方法能有效地区分疫苗免疫和自然感染动物，用于H7N9亚型禽流感的防控和净化。
在本发明中，所述JD/17病毒株的HA2特异性抗原表位的鉴定方法，优选包括以下步骤：
①将JD/17病毒株进行全基因组序列测定，得到HA蛋白的编码基因；
②将所述HA蛋白的编码基因的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，将所述氨基酸序列从5’端为起始位点，截取得到第一条含20个氨基酸的多肽，从5’端的第11位氨基酸为起始位点，截取得到第二条含20个氨基酸的多肽，如此重复合成多条多肽，使每相邻的2条多肽之间重叠10个氨基酸，直至得到第三条含20个氨基酸的多肽..........和第N条含20个氨基酸的多肽；
③将得到N条多肽制备多肽微阵列芯片；
④将不同亚型禽流感病毒血清抗体在所述多肽微阵列芯片上微量点样，根据荧光结果筛选仅能与H7N9亚型禽流感病毒抗体结合的多肽，得到的多肽微阵列芯片上多肽序列(SEQ ID No.2)为JD/17病毒株的HA2特异性抗原表位。
在本发明中，所述不同亚型禽流感病毒的种类没有特殊限制，采用本领域常见的禽流感病毒亚型即可。所述不同亚型禽流感病毒血清抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的血清抗体的制备方案即可。
本发明提供了所述的重组H7N9亚型禽流感病毒株的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用引物对KS-H7-1和JDH7H3-1-R扩增HA-1基因片段，用引物对JDH7H3-2-F和KS-H7-2扩增HA-2基因片段；
所述KS-H7-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
所述JDH7H3-1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述JDH7H3-2-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；
所述KS-H7-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；
(3)以步骤(2)得到的HA-1基因片段和HA-2的基因片段为模板进行重叠PCR扩增，得到序列替换的HA基因片段；
(4)将所述步骤(3)中序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI酶进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染，拯救得到重组H7N9亚型禽流感病毒株。
本发明提取H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的总RNA，反转录，得到cDNA。
本发明对所述总RNA的提取方法和反转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂盒的方法即可。
得到cDNA后，本发明以所述cDNA为模板，用引物对KS-H7-1和JDH7H3-1-R扩增HA-1基因片段，用引物对JDH7H3-2-F和KS-H7-2扩增HA-2基因片段；所述KS-H7-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
所述JDH7H3-1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述JDH7H3-2-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；
所述KS-H7-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。
在本发明中，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增程序独立优选为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增体系独立为：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL25mM上游引物，0.5μL 25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μLDNA模板和18.5μL超纯水。
得到HA-1基因片段和HA-2的基因片段后优选先进行质量检测。所述质量检测为经琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小正确后，切胶并用胶回收试剂盒回收(步骤详见说明书)，测浓度和纯度，检测结果OD260/OD280为1.8～2.0合格，用于后续实验。
得到HA-1基因片段和HA-2的基因片段后，本发明以步骤(2)得到的HA-1基因片段和HA-2的基因片段为模板进行重叠PCR扩增，得到序列替换的HA基因片段。
在本发明中，所述重叠PCR扩增时所用的引物为KS-H7-1和KS-H7-2。
在本发明中，所述重叠PCR扩增的程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min40s，35个循环；72℃延伸10min。
在本发明中，所述重叠PCR扩增的体系优选为25μL，除了DNA模板为4μL(上下段基因各2μL)，超纯水减到16.5μL，其它和上述PCR扩增体系中一样。
得到序列替换的HA基因片段后，本发明将所述序列替换的HA质粒与JD/17病毒株的其他7个基因表达质粒进行转染，拯救出重组H7N9亚型禽流感病毒株。
在本发明中，序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI酶进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染。所述其他7个基因的种类包括PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS。将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建重组质粒的方法具体步骤参见如下文献：卢建红,龙进学,邵卫星,等.用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重组流感病毒[J].微生物学报,2005,45:53-57.
在本发明中，所述病毒拯救的方法，包括以下步骤：转染前一天，将293T和MDCK细胞等量混合后铺入6孔细胞培养板(约6×105个细胞/孔)，待细胞覆盖面积达80％时进行转染。转染步骤参照Polyjet转染试剂说明书，每个转染体系中均包含8个片段的转录/表达质粒(300ng/质粒，HA片段为序列替换后的HA，其余为JD/17的7个片段)。转染后48-72h，反复冻融3次，收集转染上清，接种10日龄SPF鸡胚，0.3mL/胚。接种的鸡胚用血凝试验(HA)测定效价，验证病毒是否拯救成功。阳性鸡胚尿囊液提取病毒总RNA，PCR扩增8个片段进行测序，序列正确无误则将病毒尿囊液置于-70℃冰箱保存备用。
为了验证DIVA特性，将得到的重组H7N9亚型禽流感病毒株和原始病毒毒株采用多肽微阵列芯片检测各自血清，结果发现原始病毒株JD/17的血清对H7-12肽有较高的阳性响应(6.39±0.13)，而重组H7N9亚型禽流感病毒株的血清则均为阴性响应(0.44±0.14)。这表明该疫苗候选株已失去了H7-12这个抗原表位，DIVA策略成功。
对重组H7N9亚型禽流感病毒株测定了HA效价、EID50、TCID50，结果显示拯救的病毒株的生物学特性与母本毒株相似。
本发明提供的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗的制备方法，包括以下步骤：
A.将所述重组H7N9亚型禽流感病毒株或所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒株接种SPF鸡胚，孵育，得到病毒尿囊液；
B.将所述病毒尿囊液和甲醛溶液混合，得到的混合液转移4℃的条件下震摇灭活24h，得到灭活病毒尿囊液；
C.当所述灭活病毒尿囊液的血凝效价>4log2时，将所述灭活病毒尿囊液依次与吐温80和白油混合，得到灭活病毒尿囊液混合物；
D.将所述灭活病毒尿囊液混合物乳化，得到重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
在本发明中，所述甲醛溶液的体积浓度优选为4％。
在本发明中，所述病毒尿囊液和甲醛溶液的体积比优选为43:7。
在本发明中，所述灭活病毒尿囊液、吐温80和白油的体积比优选为24:1:75。
本发明提供了所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
经攻毒保护实验表明，制备的灭活标记疫苗免疫保护效果不低于母本毒株制备的疫苗，且无论对高致病性H7N9亚型AIV还是低致病性H7N9亚型AIV均有非常好的保护率，经过替换后未改变其生物学特性。
下面结合实施例对本发明提供的一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、标记疫苗及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
H7N9亚型禽流感病毒分离鉴定
1.1病毒分离
(1)在采集活禽交易市场的棉拭样品时，用灭菌的棉拭子采集家禽的泄殖腔和喉头样品，泄殖腔棉拭应尽量带有粪便，而喉头棉拭应尽量带有粘液，然后将棉拭子折断存储于装有1mL运输液的2mL指形管中，采集的样品置冰盒中运输。
(2)病料组织样品处理：在超净台中将病料组织剪碎置于加有4mL四抗PBS 5mL的研磨管；用生物样品匀质器以6500rpm的匀质速度匀浆20s后暂停10s循环2次进行研磨；将研磨管放置于-70℃冰箱，10min后取出融化，如此反复冻融3次；将冻融后的病料以8000rpm离心10min，取上清分装于指行管备用。
(3)应用鸡胚尿囊腔接种法进行病毒的分离和传代培养，将上述得到的上清接种后，每隔12h照胚一次，死亡鸡胚于4℃冰箱放置4h后收获其尿囊液。连续照胚5天后将所有未死亡鸡胚置于4℃冰箱放置4h至死亡，按如下方法测定HA效价，阳性样品无菌收获尿囊液-70℃保存备用，阴性样品无菌收集一定量尿囊液，用SPF鸡胚传代一次确定是否为血凝阳性。将尿囊液中的病毒定义为病毒株JD/17并进行生物保藏。
(4)血凝(HA)试验：
①在96孔血凝板中每孔加入25μL PBS。
②在96孔血凝板的第一列孔中加入25μL上述尿囊液，从左至右倍比稀释至第11孔，弃掉25μL。第12孔为阴性对照。
③每孔补加25μL PBS。
④在每孔中均加入25μL 1％红细胞，每孔中最后液体体积为75μL，轻轻震荡血凝板使孔内液体混匀，将血凝板放置室温(20℃)40min。
⑤放置规定时间后，将V形血凝板倾斜，使阴性对照孔红细胞挂线。然后观察其它实验孔，取红细胞完全不挂线的稀释度为该病毒的HA效价。
1.2病毒鉴定
用血凝抑制(HI)试验鉴定病毒亚型，具体方法如下：
(1)在做血凝抑制实验前先做血凝实验，确定当时待测病毒的HA效价。
(2)在96孔血凝板每孔中均加入25μL PBS。
(3)在96孔血凝板的第一列孔中分别加入25μL禽流感H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11或新城疫病毒或减蛋综合征病毒标准阳性血清，从左至右倍比稀释至第10孔，弃掉25μL。第11孔为病毒阳性对照，第12孔为PBS阴性对照。
(4)在96孔血凝板的前11列孔中加入现配的4单位病毒，轻轻震荡混匀，将血凝板放置室温(25℃)40min，或4℃环境60min，使血清和抗原充分反应。
(5)之后每孔加入25μL 1％的鸡红细胞，震荡混匀放置在室温(25℃)。
(6)将血凝板倾斜，观察红细胞挂线情况。挂线说明血清和病毒充分反应，表示为阳性。读数到完全挂线的血清稀释度为该血清针对该病毒的血凝抑制价，即HI效价，效价为4以上记为有效，根据HI效价鉴定病毒。第11孔病毒阳性对照不挂线，第12孔PBS阴性对照挂线。
1.3鸡胚半数感染量(50％egg infectious dose，EID50)测定
病毒尿囊液用四抗(青霉素、链霉素、卡那霉素及庆大霉素)PBS做连续10倍倍比稀释，取6个稀释度(10-5～10-10)接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5个胚，0.2mL/胚。接种的鸡胚在35℃条件下培养，每12h照胚一次，直至72h，最后根据Reed-Muench方法计算EID50。
1.4免疫血清制备和效价测定
(1)取JD/17病毒株以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价。
(2)病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛水溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，振摇灭活24h。
(3)取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4log2时满足要求)。
(4)在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗。
(5)用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.3mL/只，每组注射5只SPF鸡。
(6)免疫后，于14天和21天采集鸡血，分离血清，测定HI效价。
1.5分离和鉴定结果
通过病毒分离，HA和HI效价测定及病毒全基因组序列测定，从2017年的某鸡场中分离到了一株低致病性H7N9亚型禽流感毒株A/Chicken/Huadong/JD/17(H7N9)(JD/17)，8个片段的基因序列见补充材料。生物学特性测定结果发现(表1)，该毒株具有较高的HA效价和EID50，且经灭活乳化后免疫鸡群产生的抗体水平较高，故适合作为疫苗候选株。
检测结果见表1。
表1 JD/17病毒株生物学特性测定
实施例2
全基因序列测定
Trizol法提取JD/17病毒尿囊液总RNA，随后用反转录PCR(RT-PCR)分别扩增病毒的8个基因片段，扩增引物见表2。
表2全基因组序列测定扩增引物
以上述8个基因片段的引物进行PCR扩增，配置25μL PCR体系:2.5μL10×PCR缓冲液，0.5μLdNTP(10mM)，0.5μL 25mM上游引物，0.5μL25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μLDNA模板和18.5μL超纯水。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。
用1％浓度的琼脂糖对PCR产物进行电泳，电泳完毕后对目的条带进行回收，按DNAGel ExtractionKit的说明书进行。对回收的PCR产物用分光光度计测定DNA浓度，当浓度达到≥50ng/μL符合测序要求时，将PCR回收产物连同引物送公司进行双向测序；若回收的PCR产物浓度较低，则将回收产物连接到T3EasyVector并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，具体方法参见T3EasyVector说明书。在IPTG+、X-gal+和Amp+LB平板上挑取白色菌落，以常规方法小提质粒，质粒经EcoRI酶切鉴定正确后，阳性质粒送公司测序，得到8个基因片段的核苷酸序列。
实施例3
不同HA亚型禽流感鸡免疫血清的制备
利用实验室现有的不同HA亚型的禽流感毒株，具体信息见表3。经灭活乳化后免疫3周龄SPF鸡(步骤同上)，制备不同HA亚型禽流感病毒的鸡免疫血清，用于H7亚型禽流感病毒的特异性抗原表位的筛选。
表3.制备免疫血清的不同HA亚型禽流感病毒信息
标号 病毒 亚型 血凝效价(HAlog2)
H1 A/Duck/EasternChina/103/03 H1N1 7
H3 A/Duck/EasternChina/852/03 H3N2 6
H4 A/Duck/EasternChina/160/02 H4N6 5
H5-1 A/Mallard/Huadong/S/2005 H5N1 7
H5-2 A/Chicken/Huadong/1111/16 H5N6 7
H5-3 A/Chicken/Huadong/ZJ0104/16 H5N2 6
H6 A/Duck/EasternChina/58/03 H6N2 7
H9-1 A/Chicken/Shanghai/F/98 H9N2 9
H9-2 A/Chicken/Fujian/SN/14 H9N2 6
H10 A/Chicken/Huadong/RD5/13 H10N9 6
H11 A/Duck/EasternChina/906/02 H11N2 7
H7-1 A/Chicken/Jiangsu/JT/13 H7N9 8
H7-2 A/Chicken/Jiangsu/JX05/14 H7N9 8
H7-3 A/Chicken/Jiangsu/W1-8/15 H7N9 7
H7-4 A/Chicken/Huadong/JD/17 H7N9 10
实施例4
多肽合成
改性硅胶模(iPDMS)购自SJ Biomaterisls公司，多肽由GL Biochem(中国上海)公司合成。将H7N9亚型禽流感病毒JD/17株的HA2蛋白按照推导出的氨基酸序列合成重叠的多肽(每相邻2条肽之间重叠10个氨基酸)，点样在改性硅胶模上，总共合成了13条多肽(表4)(其中阳性质控点为羊抗鸡IgY；阴性质控点为点样缓冲液)，制备多肽芯片，微阵列点样信息见表5和图2。
表4 13条H7亚型HA2多肽及其序列
Peptides 序列编号 序列
H7-1 SEQ ID No.31 GLFGAIAGFIENGWEGLIDG
H7-2 SEQ ID No.32 ENGWEGLIDGWYGFRHQNAQ
H7-3 SEQ ID No.33 WYGFRHQNAQGEGTAADYKS
H7-4 SEQ ID No.34 GEGTAADYKSTQSAIDQITG
H7-6 SEQ ID No.35 KLNRLIAKTNQQFELIDNEF
H7-7 SEQ ID No.36 QQFELIDNEFNEVEKQIGNV
H7-8 SEQ ID No.37 NEVEKQIGNVINWTRDSITE
H7-9 SEQ ID No.38 INWTRDSITEVWSYNAELLV
H7-10 SEQ ID No.39 VWSYNAELLVAMENQHTIDL
H7-12 SEQ ID No.2 ADSEMDKLYERVKRQLRENA
H7-13 SEQ ID No.40 RVKRQLRENAEEDGTGCFEI
H7-14 SEQ ID No.41 EEDGTGCFEIFHKCDDDCMA
H7-15 SEQ ID No.42 FHKCDDDCMASIRNNTYDHR
表5蛋白芯片点样信息
PC H7-1 H7-2 NC
H7-3 H7-4 H7-6 H7-7
H7-8 H7-9 H7-10 H7-12
H7-13 H7-14 H7-15 PC
实施例5
H7亚型禽流感病毒HA2蛋白特异性抗原表位的鉴定
利用实验2制备的不同亚型禽流感病毒血清抗体与多肽芯片进行结合筛选，获得仅能与H7N9亚型禽流感病毒抗体结合的抗原表位。具体操作步骤如下：
(1)首先将血清样品在血清稀释缓冲液中以1：100稀释，并且在每个微阵列中加入200μL，在振荡器上孵育2h(150r/min，4℃)。
(2)然后用TBST(20mM Tris-HCl，pH 6.8,137mM NaCl，0.1％Tween20)冲洗微阵列三次，加入200μL1:25000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgY孵育1h，然后进行与上述相同的洗涤步骤。
(3)将15μL化学发光底物加入到微阵列中，并使用LAS4000成像系统(GE，USA)通过CCD相机捕获化学发光信号，用于获取微阵列的每个点的信号。
(4)最后将信号保存为TIFF格式的图像，然后使用GenePix Pro 6.0软件处理每个肽点的化学发光强度和635nm波长的背景值。将化学发光强度转换为信噪比(SNR)。SNR＝(信号强度-背景强度)/背景强度，并将SNR≥2判断为阳性响应。
图3为各个HA亚型禽流感血清对H7-12肽的响应情况。结果显示，仅有H7亚型禽流感血清抗体对H7-12肽有特异性的阳性响应(SNR>2)，而其他HA亚型血清抗体对H7-12肽均呈阴性响应(SNR<2)(图3)(P<0.01)，表明H7-12肽为仅能与H7N9亚型禽流感血清抗体特异性结合的抗原表位；而各个HA亚型血清抗体对除了H7-12肽之外的多肽呈现出不同程度的响应(表6)。
实施例6
H7-12肽免疫血清制备和表位的验证
1.H7-12肽免疫血清制备
将筛选到的H7-12肽与BSA进行偶联，得到H7-12-BSA偶联物，将该偶联物制备免疫抗原并免疫SPF鸡制备多抗血清。免疫程序如下：
(1)初次免疫，取50μg多肽-BSA偶联物(溶于250μLPBS)，加入等量的弗氏完全佐剂，进行反复乳化，直至水乳相不再分层。在鸡的颈部皮下进行多点注射免疫。
(2)初次免疫3周后进行再次免疫，取同样剂量的多肽-BSA偶联物，加入等量的弗氏不完全佐剂进行反复乳化，在鸡的颈部皮下进行多点注射免疫。
(3)3周后采集免疫鸡血清。
2.间接免疫荧光试验
(1)在96孔板培养CEF细胞，待细胞长至80％后，弃去培养基，用PBS洗3次。
(2)用无抗无血DMEM将各个HA亚型的AIV(H1，H3，H4，H5，H6，H7，H9，H10)进行稀释，将稀释好的病毒加入细胞孔中，每孔100μL。
(3)同时设未接毒的正常CEF细胞作为空白对照。
(4)培养12h后，弃去培养基，用PBST洗涤3遍，每次5min，再用预冷的甲醇4℃固定15min；用PBST洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干。
(5)将鸡血清进行1:1000倍稀释，加入96孔板中，200μL/孔，37℃作用1.5h。并加入H7单抗和阴性血清，分别作为阳性对照和阴性对照。
(6)用PBST洗涤3次，每次5min，避光加入1:500稀释的羊抗鸡FITC-IgG,50μL/孔，作用1h。
(7)用PBST洗涤3次，每次5min，在荧光显微镜下观察，出现特异性的亮绿色荧光孔为阳性，反之为阴性。
结果：结果显示，该多肽-偶联物制备的鸡血清仅对H7亚型的禽流感出现了特异性荧光，对其他亚型病毒样品均未出现特异性荧光，表明该多肽表位为H7亚型禽流感病毒特异性抗原表位，结果见图4。
实施例7
HA2蛋白抗原表位修饰的H7N9亚型重组禽流感病毒构建
抗原表位替换
以筛选出的疫苗候选株JD/17为骨架，对其HA中HA2-12肽进行替换，将JD/17毒株的H7-12肽区域的氨基酸(ADSEMDKLYERVKRQLRENA)利用Overlap-PCR技术(引物见表7)替换为H3亚型的序列(ADSEMNKLFEKTKKQLRENA)，如图5所示。
表7 Overlap PCR引物
以JD/17的cDNA为模板，PCR进行扩增目的片段。配置25μL体系:2.5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL dNTP(10mM)，0.5μL25mM上游引物，0.5μL25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μLDNA模板和18.5μL超纯水。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物HA-1和HA-2通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带正确后，切胶并用胶回收试剂盒回收(步骤详见说明书)，测浓度和纯度(OD260/OD280为1.8～2.0)，然后以HA基因上下两段的胶回收产物为模板，进行Overlap-PCR，体系仍为25μL，除了DNA模板为4μL(上下段基因2μL)，超纯水减16.5μL，其它和上述PCR体系中一样，扩增程序72℃延伸改为1min40s，其它和上述PCR扩增程序一样。
序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI酶进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染。所述其他7个基因的种类包括PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS。
病毒拯救方法：转染前一天，将293T和MDCK细胞等量混合后铺入6孔细胞培养板(约6×105个细胞/孔)，待细胞覆盖面积达80％时进行转染。转染步骤参照Polyjet转染试剂说明书，每个转染体系中均包含8个片段的转录/表达质粒(300ng/质粒，HA片段为序列替换后的HA基因片段，其余为JD/17的7个片段)。转染后48～72h，反复冻融3次，收集转染上清，接种10日龄SPF鸡胚，0.3mL/胚。接种的鸡胚用血凝试验(HA)测定效价，验证病毒是否拯救成功。阳性鸡胚尿囊液提取病毒总RNA，PCR扩增8个片段进行测序，序列正确无误则将病毒尿囊液置于-70℃冰箱保存备用。
实施例8
利用反向遗传技术拯救重组DIVA疫苗候选株
(1)先将293T和MDCK细胞置于35mm培养皿中长至70-80％丰度。
(2)按照Polyfect操作指南进行转染，6h后吸弃转染液，并向培养皿中添加细胞维持液(含1％胎牛血清、2μg/mLTPCK-胰酶的DMEM培养基)。
(3)于转染后48h取出转染培养皿冻融3次后吹匀，取悬液接种10日龄SPF鸡胚，0.3mL/胚。
(4)接种72h后收集胚液并通过血凝试验(HA)检测病毒效价，若有效价初步判定为拯救成功，命名为cHAH7/H3。
(5)对重组的疫苗候选株经鸡胚传5代后，对病毒基因组进行测序分析，以验证重组病毒的基因遗传稳定性。
(6)组织培养物半数感染量(50％tissue culture infectious dose，TCID50)
接种前一天将CEF细胞铺至96孔细胞培养板中，待细胞形成单层，吸弃培养上清并用无菌PBS洗涤3次，随后将连续10倍倍比稀释的病毒尿囊液接种至细胞表面，接种的稀释度为10-4～10-9，每个稀释度接种4个孔，0.1mL/孔。感染后的细胞在37℃，5％CO2条件下继续培养，72h后用血凝试验统计阳性感染孔数，根据Reed-Muench方法计算TCID50。
实施例9
DIVA疫苗候选株cHAH7/H3的生物学特性测定
对cHAH7/H3测定了HA效价、EID50、TCID50，结果显示拯救的疫苗候选株cHAH7/H3的生物学特性与母本毒株相似，经过替换后未改变其生物学特性(表8)。
表8.疫苗候选株及其母本毒株的生物学特性测定
实施例10
重组疫苗候选株DIVA特性的验证
1.试验设计
(1)用获得的重组病毒免疫SPF鸡制备血清，同时用野生型毒株JD/17作为对照，血清制备方法步骤同上。
(2)在一次免疫后的21天采集免疫鸡血清。
(3)用上述蛋白芯片对制备的血清进行测定，方法步骤同上。
2.试验结果
结果显示，野生型毒株JD/17的血清对H7-12肽有较高的阳性响应(6.39±0.13)，而疫苗候选株的血清则均为阴性响应(0.44±0.14)，见图6。这表明该疫苗候选株已失去了H7-12这个抗原表位，DIVA策略成功。
实施例11
灭活标记疫苗的制备
(1)取疫苗候选株cHAH7/H3以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价。
(2)病毒尿囊液和体积浓度4％的甲醛溶液按43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h。
(3)取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4log2时满足要求)。
(4)在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备得到疫苗。
实施例12
攻毒保护试验
1.试验设计和免疫保护测定
(1)将21日龄SPF鸡随机分为7组，10只/组，其中4个免疫组，2个攻毒对照组和1组健康对照组。
(2)将母本毒株JD/17和疫苗候选株cHAH7/H3按相同EID50剂量进行乳化，方法步骤同上。
(3)经颈部皮下以0.3mL/只的剂量注射油乳剂灭活疫苗。
(4)于免疫后的14天和21天采集鸡血清，测定HI效价。
(5)在免疫后21天，将106EID50的低致病性毒株JD/17(H7N9)和高致病性毒株XT/17(H7N9)病毒经滴鼻点眼途径对免疫组和攻毒对照组进行攻毒。
(6)攻毒后每天观察记录各组鸡的发病和死亡情况，连续观察14天，计算各组鸡的存活率。
(7)在攻毒后的第1、3、5和7天采集所有试验鸡的泄殖腔和喉头拭子。
(8)棉拭样品经处理后接种2枚10日龄SPF鸡胚，测定各组鸡的排毒情况。
2.试验结果
HI试验结果显示(表9)，一次免疫后21天，针对低致病性H7N9亚型毒株JD/17，其HI效价可达8.8±0.4～9.2±0.6；针对高致病性H7N9亚型毒株XT/17，其HI效价可达4.5±1.3～5.2±0.7。在免疫后21天后攻毒，在攻毒的第2天，高致病性毒株XT/17攻毒对照组开始出现精神沉郁现象，并出现部分死亡；在攻毒后的第3天全部死亡。而低致病性毒株攻毒对照组和4组免疫组在攻毒后均未出现发病现象，且精神状态良好。
检测各组试验鸡在攻毒后的排毒情况(表9)，低致病性毒株攻毒对照组在第1天开始排毒，在第3天和第5天达到高峰；高致病性毒株攻毒对照组也在第1天开始排毒，在第3天全部死亡。cHA H7/H3免疫组在低致病性和高致病性H7N9亚型毒株攻毒后，在第1、3、5和7天，均未在喉头或泄殖腔棉拭中检测出病毒，保护率为100％；而母本免疫组毒株也仅在第1天和第3天检测出了对高致病性或低致病性AIV的排毒。
表9免疫攻毒后各组鸡的排毒和存活情况
a针对毒本毒株的HI；b针对XT/17毒株的HI效价；C无存活。
以上结果表明，该疫苗候选株cHA H7/H3制备的灭活疫苗免疫保护效果不低于母本毒株制备的疫苗，且无论对强毒H7N9亚型AIV还是弱毒H7N9亚型AIV均有非常好的保护率。
实施例13
多肽芯片对自然感染鸡血清的检测
1.试验设计
(1)准备5只3周龄的SPF鸡，并做好脚标，同时设置3只SPF鸡作为对照组。
(2)测定野生型毒株JD/17的EID50，并用106EID50的剂量以滴鼻点眼的方式对5只SPF鸡进行攻毒。
(3)在攻毒后的第3天，5天，7天，14天，21天和28天分别采集这5只SPF鸡和对照组的血清，置于-20℃保存备用。
(4)对自然感染的鸡血清进行血凝抑制试验(HI)，测定其HI效价。
(5)用上述多肽芯片对自然感染的鸡血清进行检测，并计算SNR值。
2.试验结果
HI试验结果显示，在感染病毒后第7天，成功检测出HI效价(4.6±0.5)；多肽芯片结果显示，在感染病毒的第3天，测定的SNR值表明已经出现阳性响应(SNR＝2.33±0.15)，随着感染时间增加，SNR值越来越大，具体结果见表10。
表10.HI试验和多肽芯片检测不同感染时间段的SPF鸡血清
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、灭活标记疫苗及其制备方法
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Orthomyxoviridae Alphainfluenza virus
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Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu
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20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Orthomyxoviridae Alphainfluenza virus
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1 5 10 15
Arg Glu Asn Ala
20
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<212> DNA
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tattcgtctc agggagcgaa agcaggtac 29
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<210> 23
<211> 2482
<212> DNA
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<400> 23
atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgattgg atcgcccttt attggtctca 60
gggagcgaaa gcaggtcaaa tatattcaat atggagagaa taaaagaact aagagatcta 120
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atcaagaaat acacatcagg aagacaagaa aagaaccctg ccctcaaaat gaaatggatg 240
atggcaatga aatatccaat cacagcagac aagagaataa tggagatgat ccctgaacgg 300
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gtgtctcccc tagctgtgac ttggtggaac aggaatggac cgacaacaag tacagtccat 420
tatccaaagg tttacaaaac atactttgag aaggttgaaa ggttaaaaca tggaaccttt 480
ggtcccgtcc atttccgaaa ccaagttaaa atacgccgcc gagtggatat aaacccgggc 540
catgcagatc tcagtgctaa agaagcacaa gatgttatca tggaggttgt tttcccaaat 600
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atgcatcagc tattgaggca cttccaaaaa gatgcaaaag tgctgtttca gaactgggga 1440
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caatacagtg ggtttgtgag aacacttttc caacaaatgc gtgatgttct ggggacgttt 1920
gatactgttc aaataataaa gctgctacca tttgcagcag ccccaccgga acaaagcaga 1980
atgcagtttt cttctctaac tgtgaatgtg agaggttcag gaatgagaat actcgtgagg 2040
ggcaactccc ccgtgttcaa ctacaacaag gcaactaaaa ggcttacagt cctcgggaag 2100
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<210> 24
<211> 2398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtaccag tgcaaaatgc tataagtacc 60
acattccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa cagggacagg atacaccatg 120
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actggagcac cccaactcaa cccgattgat ggaccactac ctgaggataa tgagcccagt 240
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gggatctttg aaaactcgtg tcttgaaacg atggaaattg ttcaacaaac aagagtggat 360
aaactgaccc aaggtcgcca gacttatgac tggacattga atagaaacca accggctgca 420
actgctttgg ccaacactat agaaatcttc agatcgaacg gtctgacagc aaatgaatcg 480
ggacggctaa tagatttcct caaggatgtg atggaatcaa tggataagga agaaatggag 540
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gcactgacac tgaacacaat gacaaaagat gcagaaagag gcaaattgaa gaggcgagca 720
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agtatctgtg agaaacttga gcaatctgga ctcccagtcg gagggaatga gaagaaagct 840
aaattggcaa acgtcgtgag gaagatgatg accaactcac aggatactga actctccttt 900
acaattactg gggacaatac caaatggaat gagaatcaga atcctaggat gtttctggca 960
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cctataatgt tctcaaacaa gatggcgaga ttaggaaaag gatacatgtt cgaaagtaag 1080
agcatgaagt tacgaacaca aataccagca gaaatgcttg caaacattga tcttaaatac 1140
ttcaatgaat taacgaaaaa gaaaattgag aaaataagac ctctattaat agatggtgca 1200
gcctcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaaca tgctgagtac agtcctagga 1260
gtctcaatcc tgaatcttgg acagaaaagg tacaccaaaa ccacatattg gtgggacgga 1320
ctccaatcct ctgatgattt cgctctcatc gtaaatgcac cgaatcatga gggaatacaa 1380
gcaggagtgg ataggtttta taggacttgt aaactagttg gaatcaatat gagcaagaag 1440
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tttgtagcca atttcagtat ggagctgccc agttttggag tgtctggaat taatgaatcg 1560
gccgacatga gcattggtgt tacagtgata aagaacaata tgataaacaa cgaccttggg 1620
ccagcaacag ctcagatggc tcttcagcta ttcatcaagg actacagata cacataccga 1680
tgccacagag gggatacgca aatccaaacg aggagatcat tcgagctgaa gaagctatgg 1740
gagcaaaccc gttcaaaagc aggactgttg gtttcagatg gaggaccaaa cctatacaat 1800
atccgaaatc tccatattcc tgaggtctgc ttgaaatggg aattgatgga tgaagattac 1860
caaggcagac tgtgcaatcc tctgaatcca ttcgtcagcc ataaggaaat tgaatctgtc 1920
aacaatgcta tagtaatgcc agctcatggt ccggccaaga gtatggaata tgatgccgtt 1980
gcaactacac attcatggat ccctaaaagg aatcgttcca ttctcaatac gagtcaaagg 2040
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cccagcagtt catatcggag gccagttgga atttccagca tggtggaggc catggtgtct 2160
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<210> 25
<211> 2287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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ggagtgacac gaagggaagt tcatacatac tatctggaga aagccaacaa gataaaatcc 420
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tacacccttg atgaagagag cagggcgaga attaaaacca ggctgttcac cataagacag 540
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atgaggcgat gccttcttca atcccttcaa caaattgaaa gcatgattga agccgagtct 1800
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<400> 26
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ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300
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tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140
caatcggcaa ttgatcaaat aacaggaaaa ttaaaccggc ttatagaaaa aaccaaccaa 1200
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tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560
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<400> 27
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atacagatgt gtacagaact caaactcagt gacaatgaag ggaggctgat tcagaacagt 180
ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctggaa 240
gagcacccca gtgcaggaaa ggaccctaag aaaactggag gtccaattta caggagaaga 300
gacggaaaat gggtgagaga gctgatcctg tatgacaaag aggaaatcag gagaatttgg 360
cgacaagcga acaatggaga ggatgcaact gctggtctta cccatctgat gatatggcat 420
tccaacctga atgatgctac ctatcagaga acgagagctc tcgtgcgtac tggaatggat 480
ccccggatgt gctctctgat gcaaggatca actctcccga ggagatctgg agctgcaggt 540
gcagcagtga aggggatagg gacaatggtg atggaactga ttcggatgat aaaacgaggg 600
atcaacgacc ggaatttctg gagaggcgaa aatggaagaa ggacaagaat tgcatatgag 660
agaatgtgca acatcctcaa agggaaattc caaacagcag cacaaagggc aatgatggat 720
caagtgcgag agagcagaaa tcctgggaat gctgaaatag aagatctcat ttttctggca 780
aggtctgcac tcatcctgag aggatcagtg gcccataaat cctgcttgcc tgcttgtgtg 840
tacggacttg cagtggctag tggatatgac tttgagagag aagggtactc cttggttgga 900
atagatcctt tccgtctgct tcaaaacagc caggtcttta gtctcattag accaaatgag 960
aacccagcac ataagagcca actagtgtgg atggcatgcc actctgcagc gtttgaggac 1020
cttagggtct caagtttcat tagagggaca agaatggtcc caagaggaca gctatccact 1080
agaggggttc aaattgcttc aaatgagaac atggaagcaa tggactccaa tactcttgaa 1140
ctgagaagta gatattgggc tataagaacc agaagcggag ggaacaccaa ccaacagagg 1200
gcatctgcag gacaggtcag cgttcaaccc actttctcag tacagagaaa ccttcctttc 1260
gaaagagcaa ccattatggc agcatttaca ggaaatactg agggtagaac gtctgacatg 1320
aggactgaga tcataagaat gatggaaagt gccagaccag aagatgtgtc attccagggg 1380
cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440
atgaataatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtatga caattga 1497
<210> 28
<211> 1663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgaatccaa atcagaagat tctatgcact tcagccactg ctatcataat aggcgcaatc 60
gcagtactca ttggaatagc aaacctagga ttgaacatag gactgcatct aaaaccgggc 120
tgcaattgct cacactcaca acctgaaaca accaacacaa gccaaacaat aataaacaac 180
tattataatg aaacaaacat caccaacatc caaatggaag agagaacaag caggaatttc 240
aataacttaa ctaaagggct ctgtactata aattcatggc acatatatgg gaaagacaat 300
gcagtaagaa ttggagagag ctcggatgtt ttagtcacaa gagaacccta tgtttcatgc 360
gacccagatg aatgcaggtt ctatgctctc agccaaggaa caacaatcag agggaaacac 420
tcaaacggaa caatacacga taggtcccag tatcgcgccc tgataagctg gccactatca 480
tcaccgccca cagtgtacaa cagcagggtg gaatgcattg ggtggtcaag cactagttgc 540
catgatggca aatccaggat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600
gtagtgtggt acaacagaag gcctgttgca gaaattaaca catgggcccg aaacatacta 660
agaacacagg aatctgaatg tgtatgccac aatggcatat gcccaatagt gttcaccgat 720
gggtctgcca ctggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780
aaatgggagt ctctgactgg aactgctaag catattgaag aatgctcatg ttacggggaa 840
cgaacaggaa ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900
cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgttcttaca 960
gacactcccc gaccgaatga cccaaatata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020
aacaacaatg gagtcaaggg gttctcatac ctggatgggg ctaacacttg gctagggagg 1080
acaataagca cagcctcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca 1140
gatgatagat caaagcccat tcaaggtcag acaattgtat taaacgctga ctggagtggt 1200
tacagtggat ctttcatgga ctattgggct gaaggggact gctatcgagc gtgtttttat 1260
gtggagttga tacgaggaag acccaaggag gataaagtgt ggtggaccag caatagtata 1320
gtatcgatgt gttccagtac agaattcctg ggacaatgga actggcctga tggggctaga 1380
atagagtact tcctctaaga tgaagaaaaa gacccttgtt tctactaata acccggcggc 1440
ccaaaatgcc gactcggagc gaaagatata cctcccccgg ggccgggagg tcgcgtcacc 1500
gaccacgccg ccggcccagg cgacgcgcga cacggacacc tgtccccaaa aacgccacca 1560
tcgcagccac acacggagcg cccggggccc tctggtcaac cccaggacac acgcgggagc 1620
agcgccgggc cggggacgcc ctcccggcgg tcacctaaat gca 1663
<210> 29
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgtttaaag atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcattccatc 60
aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacgc 120
agatctcgag gctctcatgg agtggataaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa 180
ggggatttta gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag 240
acggtttgtc caaaccgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acaaggcagt 300
taaattatac aagaaactga agagggaaat gacatttcat ggagcaaagg aagttgcact 360
cagttactca actggtgcgc ttgccagctg catgggtctc atatacaaca ggatggggac 420
agtaactgca gaaggggctc ttggattggt atgtgccact tgtgagcaga ttgctgatgc 480
acaacatcgg tcccacaggc agatggcaac tattaccaac ccactaatta ggcatgagaa 540
tagaatggta ctagccagta ctacggctaa ggctatggag cagatggctg ggtcaagtga 600
acaggcagcg gaagccatgg aagtcgcaag ccaggctagg caaatggtgc aggctatgag 660
gacagtcggg actcacccta actccagtac aggtctaaag gatgatctta ttgaaaattt 720
gcaggcttac cagaaccgga tgggagtgca actgcagcgg ttcaagtgac cctctcgttg 780
ttgcagctaa cattgttggg atattgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct 840
tcaaatgcat ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggaa 900
tgcctgagtc tatgagggaa gaatatcggc aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg 960
atggtcattt tgtcaacata gagctgaagt aaaaaactac cttgtttcta ctaataaccc 1020
ggcggcccaa aatgccgact cggagcgaaa gatatacctc ccccggggcc gggaggtcgc 1080
gtcaccgacc acgccgccgg cccaggcgac gcgcgacacg gacacctgtc cccaaaaacg 1140
ccaccatcgc agccacacac ggagcgcccg gggccctctg gtcaacccca ggacacacgc 1200
gggagcagcg ccgggccggg gacg 1224
<210> 30
<211> 1099
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atggattcca acactgtgtc aagcttccag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cggtttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattcctag accggcttcg ccgggatcag 120
aagtccctga gaggaagaag cagcactctt ggtctggaca tcagaaccgc aactcgtgaa 180
ggaaaacata tagtggagcg aattttggag gaagagtcag acgaagcatt taaaatgact 240
attgcttcag tgccagctcc acgctatctc actgacatga ctcttgaaga aatgtcaaga 300
gattggttaa tgctcattcc caaacagaaa gtgacagggt ccctttgcat tagaatggac 360
caagcaatag tggacaaaaa catcacattg aaagcaaatt tcagtgtgat tttcaatcga 420
ctggaagccc taatactact tagagctttt acggatgaag gagcaatagt gggcgaaatc 480
tcaccattac cttctcttcc aggacatact gacaaggatg tcaagaatgc aattggggtc 540
ctcatcggag gatttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600
ttcgcttgga gaagcagcaa tgaggatggg agacctccac tctctccaaa gtaggaacgg 660
gaaatggaga gaacaattaa gccagaagtt cgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 720
acgacatagg ttaaagatta cagagaatag ctttgaacaa ataactttta tgcaagcctt 780
acaactattg cttgaagtgg agcaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaata 840
ataaaaaaca cccttgtttc tactaataac ccggcggccc aaaatgccga ctcggagcga 900
aagatatacc tcccccgggg ccgggaggtc gcgtcaccga ccacgccgcc ggcccaggcg 960
acgcgcgaca cggacacctg tccccaaaaa cgccaccatc gcagccacac acggagcgcc 1020
cggggccctc tggtcaaccc caggacacac gcgggagcag cgccgggccg gggacgccct 1080
cccggcgtca cctaatgca 1099
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ile Asp Gly
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His
1 5 10 15
Gln Asn Ala Gln
20
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Ser
20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp
1 5 10 15
Gln Ile Thr Gly
20
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Lys Leu Asn Arg Leu Ile Ala Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile
1 5 10 15
Asp Asn Glu Phe
20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln
1 5 10 15
Ile Gly Asn Val
20
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp
1 5 10 15
Ser Ile Thr Glu
20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val
20
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His
1 5 10 15
Thr Ile Asp Leu
20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly
1 5 10 15
Cys Phe Glu Ile
20
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp
1 5 10 15
Asp Cys Met Ala
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr
1 5 10 15
Tyr Asp His Arg
20

Claims (10)

1.一种重组H7N9亚型禽流感病毒株，其特征在于，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；
所述H3亚型的氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.1；
所述JD/17病毒株中的HA蛋白中氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.2；
所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCC NO.V201862。
2.权利要求1所述的重组H7N9亚型禽流感病毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用引物对KS-H7-1和JDH7H3-1-R扩增HA-1基因片段，用引物对JDH7H3-2-F和KS-H7-2扩增HA-2基因片段；
所述KS-H7-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
所述JDH7H3-1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述JDH7H3-2-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；
所述KS-H7-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；
(3)以步骤(2)得到的HA-1基因片段和HA-2的基因片段为模板进行重叠PCR扩增，得到序列替换的HA基因片段；
(4)将所述步骤(3)中序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染，拯救得到重组H7N9亚型禽流感病毒株。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增程序独立为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增体系独立为：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL25mM上游引物，0.5μL 25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μL DNA模板和18.5μL超纯水。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述重叠PCR扩增的程序为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min40s，35个循环；72℃延伸10min。
6.一种重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将权利要求1所述重组H7N9亚型禽流感病毒株或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒株接种SPF鸡胚，孵育，得到病毒尿囊液；
B.将所述病毒尿囊液和甲醛溶液混合，得到的混合液转移4℃的条件下振摇灭活24h，得到灭活病毒尿囊液；
C.当所述灭活病毒尿囊液的血凝效价>4log2时，将所述灭活病毒尿囊液依次与吐温80和白油混合，得到灭活病毒尿囊液混合物；
D.将所述灭活病毒尿囊液混合物乳化，得到重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甲醛溶液的体积浓度为4％。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒尿囊液和甲醛溶液的体积比为43:7。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活病毒尿囊液、吐温80和白油的体积比为24:1:75。
10.权利要求6～9任意一项所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。
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