CN106117369A - 融合蛋白sHA1‑Fc及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了融合蛋白sHA1‑Fc及应用，本发明利用Bacto‑Bac表达系统表达了高致病性禽流感病毒H5N1 HA1与鸡IgY Fc片段的融合蛋白sHA1‑Fc，该融合蛋白具有类似IgY的分子结构，可以利用上皮细胞中表达的FcRy转运而跨越鸡的呼吸道粘膜屏障进入体内中。sHA1‑Fc融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示。该融合蛋白辅以粘膜佐剂通过滴鼻接种鸡，既能激发机体产生有效的粘膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫。使机体获得抗禽流感病毒的局部特异性和全身性免疫力，其免疫效果优于商品化的全病毒灭活疫苗，为家禽禽流感和其他传染病新型粘膜疫苗的研制提供一种新的策略。

Description

融合蛋白sHA1-Fc及应用
技术领域
本发明属于动物基因工程疫苗制备技术领域，涉及动物分子生物学、免疫学、生物技术等相关领域。具体涉及融合蛋白sHA1-Fc及应用。
背景技术
禽流感(Avian influenza)是禽流行性感冒的简称，由甲型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，它不仅能引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽和猪、狗、虎等哺乳类动物的感染，也能感染人，甚至引起死亡，严重危害人类的健康，是一种人畜共患的传染病，因此被国际兽疫局确定为I类传染病。自19世纪发现以来，全球每年约有20％的儿童和5％的成年人有感染的症状，平均每个世纪发生3-4次大规模疫情，已经给世界带来了巨大的损失和危害，引起了世界极大的关注。禽流感病毒是一种单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科的甲型流感病毒属。根据病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的糖蛋白不同，将其分为18个H亚型(H1～H18)和9个N亚型(N1～N9)。其中可以感染人的禽流感病毒亚型主要有H5N1、H9N2、H7N7，H5、H7两种亚型的病毒株是高致病性病毒，引起了国内外高度关注。H5N1高致病性禽流感病毒在最近几年有不断扩散的趋势，而且在中国和越南还出现了H5N1变种病毒，使现有疫苗失去作用。由于H5病毒不断发生变化，因此我们必须研发新的疫苗来应对。禽流感病毒主要通过呼吸道或消化道等粘膜感染动物，在预防病原入侵机体时，滴鼻或者口服接种的途径与其他免疫途径相比可以诱导机体产生局部的粘膜免疫和全身性的免疫应答，阻止病原微生物入侵机体抵抗早期的病毒感染。
目前在预防禽流感暴发的众多方法中，最有效的方法是疫苗接种。然而禽流感病毒的持续变异性、传播的迅速性决定了传统疫苗在保护力上无法达到理想的效果。随着分子生物学和生物技术的发展，疫苗技术也获得了飞速的发展。现在世界上研制出的禽流感疫苗主要有灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、重组载体疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等。我国用的禽流感疫苗主要是针对H2、H5和H7亚型的疫苗，其中较多的是灭活疫苗。灭活疫苗虽然安全性较好，且各亚型之间不会产生免疫干扰，但却不能抵抗异源毒株的感染。因此在这种情况下需要加快禽流感疫苗的研制和开发，从而加强对动物机体的免疫保护。
禽流感主要通过动物机体的呼吸道粘膜部位感染动物。理想的疫苗不仅能引起全身的体液免疫和细胞免疫，还能引起机体产生粘膜免疫应答。然而，大多数疫苗是通过肌肉或皮下注射途径，虽然注射可诱导强烈的系免疫反应，但是只产生极弱的粘膜免疫应答。因此阻止病原体侵入粘膜是现在疫苗研究的一个方向，其中最理想的免疫方式就是通过滴鼻免疫途径，这种方式模拟病毒的自然感染，不仅可以引起全身性的系统免疫，而且在粘膜局部引起相应的粘膜免疫，对病毒早期的感染和增殖起到有效的免疫效果。粘膜免疫系统是机体的第一道防线，如果能在禽流感病毒感染机体的“源头”将病毒消灭或将病毒的致病力减弱，那是最为理想的方法。因此，我们尝试研制一种新型的粘膜免疫亚单位疫苗。
针对上述问题，申请人将禽流感病毒H5N1的HA1抗原与鸡IgY Fc片段融合，将该融合蛋白辅以粘膜佐剂通过滴鼻免疫鸡，发现FcRy能介导IgY Fc融合蛋白跨越粘膜屏障进入体内，并能有效激发机体的局部粘膜免疫和全身性免疫反应，为家禽禽流感及其它传染病的新型粘膜疫苗研制提供一种新的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种融合蛋白sHA1-Fc，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该融合蛋白是通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了鸡IgY Fc片段与禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白。
本发明的另一个目的在于提供了融合蛋白sHA1-Fc的应用，包括用于制备成预防禽流感的疫苗，或用于制备提高鸡免疫力的生物制剂。
本发明的最后一个目的在于提供了融合蛋白sHA1-Fc的制备方法，方法简单，适用于大规模生产。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
融合蛋白sHA1-Fc的制备方法，包括：
1.鸡IgY Fc基因的扩增：按常规方案提取鸡脾脏组织RNA并进行反转录，获得CDNA，再以CDNA为模板，利用Fc-up(含42bp Linker序列)与Fc-down引物进行PCR扩增(两步法RT-PCR)得到Linker-Fc基因片段；
Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜体划线部分为Linker。
Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜体划线部分为XhoI。
2.禽流感病毒H5N1HA1的扩增：pFAST HTb-sHA1-Linker-wFc重组质粒为模板，利用sHA1-up与sHA1-down(含42bp Linker序列)引物，用PCR扩增得到sHA1-Linker基因片段；
Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜体划线部分为Linker。
Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜体划线部分为XhoI酶切位点。
3.sHA1-Fc融合基因的扩增：以回收的sHA1-Linker和Linker-Fc片段为模板，利用sHA1-up与Fc-down引物，用重叠PCR扩增得到sHA1-Linker-Fc基因片段，简称sHA1-Fc基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4.重组质粒pFastBac HTB-sHA1-Fc的构建：将回收的sHA1-Linker-Fc基因片段插入到真核表达载体pFastBac HTB的XbaI和XhoI酶切位点之间，获得的重组质粒命名为pFastBac HTB-sHA1-Fc；
5.杆粒Bacmid的获得：pFastBac HTB-sHA1-Fc转化感受态DH10Bac，挑取阳性菌落，提取阳性杆粒Bacmid进行PCR鉴定，获得重组阳性杆粒Bacmid。
6.利用重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞，收获感染的SF9细胞，经纯化后获得融合蛋白sHA1-Fc，其序列为SEQ ID NO.2所示。
融合蛋白sHA1-Fc在制备预防禽流感疫苗中的应用，包括以融合蛋白sHA1-Fc为主效成分或是主效成分之一制备成禽流感疫苗，或是制备成提高鸡免疫力的生物制剂，或是制备成提高鸡HI抗体的生物制剂。
优选的，所述的禽流感疫苗或生物制剂的剂型为滴鼻制剂或注射制剂。
以上方案中，优选的，制备成所述的滴鼻制剂时，融合蛋白sHA1-Fc的佐剂为CpG-OD N 2006粘膜佐剂。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了鸡IgY Fc片段与禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白(sHA1-Fc)。表达的该融合蛋白具有类似鸡IgY的分子结构，可以利用鸡呼吸道上皮细胞中表达的鸡免疫球蛋白IgY转运受体(FcRy)主动转运而跨越粘膜屏障进入体内。而文献报道已表达的抗原基因其他形式的融合蛋白通过滴鼻方式不能有效地跨越鸡的呼吸道粘膜屏障而转运进入体内。同时由于sHA1-Fc具有FcγRI结合位点更有利于抗原递呈细胞对其的识别与摄取。
2.将鸡IgY Fc片段与禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白(sHA1-Fc)辅以CpG-ODN2006粘膜佐剂滴鼻接种鸡，模拟禽流感病毒的自然感染途径，能诱导有效的局部粘膜免疫反应和全身性免疫反应，从而保护动物机体。
3.可通过滴鼻或喷雾等方式接种，其操作简单快速，既能激发机体产生有效的粘膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫。其免疫效果优于商品化的全病毒灭活疫苗，从而为家禽新型粘膜疫苗的研制提供一种新的策略。
附图说明
图1为本发明的总体技术路线图。
图2为本发明中重组pFastBac HTB-sHA1-Fc质粒的鉴定示意图。
图2中A：重组pFastBac HTB-sHA1-Fc质粒酶切鉴定结果，泳道1，2：用XhoI和Xb aI酶切pFastBac HTB-sHA1-Fc质粒图，M：DL15000DNA Marker；
图2中B：重组pFastBac HTB-sHA1-Fc质粒PCR鉴定结果，泳道1，2：sHA1-Fc基因的PCR产物，M：DL2000DNA Marker。
图3为本发明中重组Bacmid病毒杆粒的鉴定示意图。
图3中A：重组Bacmid病毒杆粒PCR鉴定结果，泳道1：sHA1-Fc基因的PCR产物，M：DL2000DNA Marker。
图3中B：重组Bamid病毒杆粒PCR鉴定结果，泳道1：M13引物扩增的含sHA1-Fc基因的PCR产物，M：DL15000DNA Marker。
图4为sHA1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE检测和Western blot鉴定示意图。
图4中A：sHA1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE检测。
图4中B：sHA1-Fc融合蛋白的Western blot鉴定。
图4中C：在非还原性条件下sHA1-Fc融合蛋白的Western blot鉴定。
图5为HA1融合蛋白跨越鸡呼吸道粘膜屏障进入血液的检测示意图。
图6为ELISA检测免疫鸡血清中抗禽流感病毒H5N1HA1的特异性IgY抗体效价示意图。
图7为免疫鸡血清特异性抗体的HI效价检测示意图。
图8为二免后14d鸡血清中抗禽流感病毒H5N1HA1特异性抗体的HI效价检测示意图。
图9为ELISA检测免疫鸡气管与肺脏冲洗液中的特异性IgY和sIgA抗体水平示意图。
图10为免疫鸡血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量检测示意图。
图11为免疫鸡脾淋巴细胞增殖实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1：
融合蛋白sHA1-Fc的表达
1.按常规方案提取鸡脾脏组织RNA并反转录获得CDNA。
2.引物设计
根据实验室保存的重组质粒pFastBac HTB-sHA1-Linker-wFc(党威，2014)，设计一对引物，其中sHA1上游引物(sHA1-up)引入XbaI酶切位点，sHA1下游引物(sHA1-down)含42bp的Linker序列扩增sHA1序列。
sHA1-up：5'-CTAGTCTAGAATGGAGAAAATAGTGCTTC-3'，斜体划线部分为XbaI。
sHA1-down：5'-AGATCCCGAGCCACCTCCTCCGGACCCACCCCCGCCTGATCCTCTTTTTCTTCTTCTCT-3'，斜体划线部分为Linker。
根据GenBank收录的鸡重链序列(GenBank:X07174)设计一对引物，其中Fc上游引物(Fc-up)引入42bp的Linker序列，Fc下游引物(Fc-down)引入XhoI酶切位点。
Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜体划线部分为Linker。
Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜体划线部分为XhoI。
检测重组阳性杆粒的M13/pUC测序引物为：
M13上游(M13-up)：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
M13下游(M13-down)：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3
3.禽流感病毒H5N1HA1、鸡IgY Fc基因的扩增
PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min。
根据表1反应体系和上述反应条件，以本室保存的pFastBac HTB-sHA1-Linker-wFc重组质粒为模板，利用sHA1-up与sHA1-down(含42bp Linker序列)引物，用PCR扩增得到sHA1-Linker基因片段；以鸡的脾脏组织CDNA为模板，再利用Fc-up(含42bp Linker序列)与Fc-down引物，进行PCR扩增得到Linker-Fc基因片段。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大小分别为1020bp和1074bp，与预期的目的片段大小一致。
表1PCR反应组成成分
4.sHA1-Fc融合基因的扩增
PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min50s，30个循环，72℃延伸10min。
根据表2反应体系和上述反应条件，以回收的sHA1-Linker和Linker-Fc片段为模板，利用sHA1-up与Fc-down引物，用重叠PCR扩增得到sHA1-Linker-Fc基因片段，简称sHA1-Fc基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，大小为2094bp，与预期的目的片段大小一致，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。
表2重叠PCR反应组成成分
5.重组质粒pFastBac HTB-sHA1-Fc的构建
将回收的sHA1-Linker-Fc基因片段和真核表达载体pFastBac HTB分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别回收sHA1-Fc片段与pFastBac HTB片段，将回收的sHA1-Fc片段与pFastBac HTB片段进行连接，连接反应体系见表3，转化到E.coli DH5α中并进行鉴定，用XbaI和XhoI进行双酶切，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小分别为2094bp和4857bp，片段大小与预期的目的片段一致。筛选出阳性克隆后，送武汉擎科创新生物科技有限公司测序，测序结果在线Blast分析，获得的重组质粒命名为pFastBac HTB-sHA1-Fc。BL ASTn比对同源性达99％。
表3 sHA1-Fc基因与pFastBac HTB连接反应体系
6.重组质粒pFastBac HTB-sHA1-Fc转座
重组质粒的转座步骤：
(1)制备KGTIX LB琼脂平板
(2)转化：取100μL DH10Bac感受态细胞，冰上融化15min；加入1μLpFAST HTB-sHA1-Fc阳性重组质粒于感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min；42℃水浴热击45s，再迅速移出置冰上2min；加入900μL预热的SOC培养基，37℃225rpm/min振荡培养4h；用SOC培养基10倍梯度稀释：10-1、10-2、10-3，在避光条件下，每个稀释度分别取100μL涂KGTIX LB平板，涂布均匀后，将平板避光正放于37℃温箱5min，表面液体被琼脂吸收后，再避光倒放继续培养24-48h；避光下挑取白色菌落。
7.杆粒Bacmid的提取与鉴定
阳性杆粒Bacmid的筛选
在黑色背景下用灭菌枪头挑取白色菌落，于5mL LB培养基(含终浓度为50μg/mL卡那霉素、10μg/mL四环素、7μg/mL庆大霉素)，37℃摇床250rpm/min培养24-48h；取3mL菌液提取质粒，PCR鉴定正确的菌液，避光在KGTIX LB琼脂平板上划线，然后再挑取白色菌落，连续鉴定三次为阳性的菌液，可提取阳性杆粒Bacmid。
杆粒Bacmid的鉴定
(1)pUC/M13通用引物检测：
PCR扩增条件：94℃预变性5min；95℃1min，55℃1min，72℃5min，30个循环；72°C延伸10min。
根据上述反应条件，以获得的重组Bacmid杆粒为模板，利用pUC/M13通用引物(M13-up和M13-down)进行PCR检测，PCR产物用0.6％的琼脂糖凝胶电泳检测，大小为4534bp，与预期的目的片段大小一致，说明重组Bacmid病毒杆粒构建成功。
(2)特异性引物检测：
PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min50s，30个循环，72℃延伸10min。
根据上述反应条件，以获得的重组Bacmid杆粒为模板，利用目的基因特异性引物(sHA1-up和Fc-down)进行PCR检测，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，大小为2094bp，与预期的目的片段大小一致。
8.重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞
提取阳性杆粒后，使用分光光度计测其浓度，并且按照每次1μg的用量计算转染所需体积，使用Reagent(Invitrogen)进行转染。
9.重组阳性杆状病毒的扩增
转染后的6-7d，出现晚期感染迹象，此时，收六孔板中的细胞培养上清到一离心管中，500×g离心5min去除细胞碎片，将离心后上清转移到新的离心管中4℃避光保存。制备P2病毒贮液方法如下：a.在六孔板中接种对数生长期Sf9细胞2×106个细胞/2mL/孔，贴壁生长至少1h；b.加入病毒悬液，感染复数为MOI＝0.01-0.1，27℃孵育48-72h；c.根据细胞病变情况收集各孔中病毒上清液，4℃500×g离心5min，去除细胞和碎片，上清即为P2病毒贮液，4℃避光保存或分装于-80℃长期保存；d.制备了高效价P2病毒液后，按上述方法扩增P3、P4贮液用于高效表达。
10.重组蛋白的制备及鉴定
(1)当Sf9细胞长满整个细胞瓶的80％左右时细胞处于对数期。
(2)弃掉细胞瓶中的培养液，加入新培养液。
(3)每孔加入适量的P4代病毒，MOI＝2。
(4)72h后，弃掉培养上清，加入PBS溶液，洗两遍，用细胞刮刮取细胞。
(5)1000rpm/min离心5min，弃掉PBS溶液，将细胞冻起来。
(6)用20μL RIPA裂解液裂解细胞(用前加入终浓度为1mmol/L PMSF的PMSF)，12000rpm/min 4℃离心10min后取上清于另一干净的离心管中，待检。
经SDS-PAGE电泳检测，其蛋白大小为82KD(图4中A)，应用Western Blot分别对该融合蛋白的sHA1和Fc片段进行检测，结果显示该蛋白已成功表达(图4中B)，在非还原条件下检测蛋白大小约为160KD(图4中C)，说明该融合蛋白以二聚体的形式存在，具有类似IgY的分子结构。
11.sHA1-Fc融合蛋白的纯化
离心收集接毒72h后的细胞，用预冷的Binding Buffer(加入终浓度为1mmol/LPMS F)重悬；压力细胞破碎仪破碎细胞直至透亮；4℃12000rpm离心30min，收集上清；将上清用0.45μm滤膜过滤后，用HisTrap FF crude(柱体积1mL)亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
平衡柱：用10mL Binding buffer缓慢流过柱子；
上样：将过滤后的细胞裂解上清加到平衡好的柱子中；
洗柱：用至少10-15mL Binding buffer洗柱子，洗去未结合的成分以及一些杂蛋白；
洗脱：用5mL的Elution buffer洗脱目的蛋白，弃最初3滴，1mL/管，分5管收集，并分别从收集的5个离心管中取出10μL SDS-PAGE电泳检测。
用核酸蛋白仪测定各管洗脱液中蛋白的浓度，蛋白浓度约为1mg/mL，分装小管，冻存于-80℃备用。
实施例2：
sHA1-Fc融合蛋白的应用：
sHA1-Fc融合蛋白跨越鸡呼吸道粘膜屏障的检测
分别将生物素标记的sHA1-Fc融合蛋白、GST-HA1融合蛋白和鸡IgY滴鼻接种10日龄海兰灰蛋鸡鸡苗，8h后经ELISA检测发现血清中sHA1-Fc含量远高于GST-HA1，二者差异极显著(P<0.01)，而与阳性对照IgY相比差异不显著。这说明在体内sHA1-Fc融合蛋白可以借助鸡呼吸道粘膜上皮细胞中表达的FcRy跨越粘膜屏障特异性转运进入血液(图5)。
滴鼻和皮下接种鸡的免疫效果检测
175只7日龄海兰灰蛋鸡鸡苗随机分为7组，每组25只，分组情况和免疫剂量如表4和表5。7日龄首免，间隔两周(21日龄)加强免疫1次，免疫时间及采血时间如表6。第二次免疫后10d每组随机抓取5只，断颈处死后，分别采取气管或肺脏的冲洗液、血清和脾脏。GST-HA1融合蛋白在包涵体中表达(党威，2014)，采用包涵体纯化的方法对融合蛋白进行纯化。
表4滴鼻接种免疫剂量
表5皮下接种免疫剂量
表6粘膜免疫及采血时间
血清特异性IgY ELISA抗体效价检测
(1)包被：用包被液将纯化后的GST-HA1或His-HA1蛋白包被到96孔酶标板上，经过摸索，抗原的最终稀释浓度定为3μg/mL(GST-HA1)或4μg/mL(His-HA1)，4℃包被过夜。
(2)洗涤：弃孔中溶液，拍干，每孔加入洗涤液200μL，洗3次，每次3min，弃去洗涤液，在吸水纸上将酶标板拍干。
(3)封闭：每孔加入100μL封闭液，37℃孵育lh。
(4)洗涤：弃溶液，拍干，每孔加入洗涤液200μL，洗3次，每次3min，弃去洗涤液，在吸水纸上将酶标板拍干。
(5)加待测血清：将待检血清稀释25倍。先在每孔加入100μL洗涤液，在第一横行加入100μL稀释血清，由上向下(纵向)倍比稀释，终浓度为1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1:3200、1：6400和1：12800，同时设PBS阴性对照，37℃孵育1h。
(6)洗涤：弃溶液，拍干，每孔加入洗涤液200μL，洗3次，每次3min，弃去洗涤液，在吸水纸上将酶标板拍干。
(7)加酶标二抗：用洗涤液1∶7000稀释羊抗鸡IgG(IgY)酶标抗体，100μL/孔，37℃温育30-45min。
(8)洗涤：弃溶液，拍干，每孔加入洗涤液200μL，洗3次，每次3min，弃去洗涤液，在吸水纸上将酶标板拍干。
(9)加底物混合溶液显色：加入底物液，每孔100μL，37℃避光孵育15min，取出。
(10)终止反应：每孔加50μL 2mol/LH2SO4终止液终止反应。
(11)测定：放在酶标仪上测定450nm各孔的吸光值(A)，即OD450nm值。
(12)结果判断：实验孔A值/阴性对照A值≥2.1者，判为阳性。呈阳性时，血清的最大稀释倍数就是该血清的效价。
结果表明，一免后14d各免疫组均能产生特异性的抗体，二免后各免疫组诱导产生的特异性抗体水平呈明显的上升趋势，到一免后28d时达到最高值，随后开始下降。在28d时，sHA1-Fc滴鼻免疫组血清中特异性抗体IgY的ELISA抗体效价达到1：5680，与GST-HA1滴鼻免疫组(1：1080)相比差异极显著(P<0.01)，与灭活疫苗组(1：3280)相比差异显著(P<0.05)(图6)。
HI试验
(1)取U型微量血凝板，每孔加入50μL生理盐水，在第一排加入鸡血清50μL，从1-11孔依次倍比稀释，第11孔做阳性对照，第12孔做红细胞阴性对照，随后向各孔依次加入50μL4单位抗原，混合均匀后，室温作用30min或37℃15min；在各反应孔内分别加入50μL 1％鸡红细胞悬液，室温静置30min或37℃15min。
(2)在红细胞对照出现完全沉淀、阳性对照出现完全凝集的情况下，将U型微量血凝板45度倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清HI效价。
按《高致病性禽流感疫情处置规范(试行)》血凝抑制(HI)试验技术进行结果判定，若血清的血凝抑制滴度≥24(1：16)，判断为免疫合格，抗体合格率≥70％为群体免疫合格。
HI效价检测结果表明二免后14d各个免疫组血清中特异性抗体的HI效价都达到最高值，其中sHA1-Fc滴鼻免疫组最高，达到1：103.97，GST-HA1滴鼻免疫组、sHA1-Fc皮下免疫组和灭活苗组的HI抗体效价为1：10.92、1：61.82和1：66.26，滴鼻组中sHA1-Fc与GST-HA1相比差异显著(P<0.05)，随后开始下降(图7)。二免后14d sHA1-Fc滴鼻和皮下免疫组的免疫合格率均为95％(19/20)，而GST-HA1滴鼻免疫组的免疫合格率仅为40％(8/20)，GST-HA1皮下免疫组的免疫合格率为75％(15/20)，灭活疫苗免疫组的免疫合格率为100％(图8)。一免后42d sHA1-Fc滴鼻免疫组与灭活疫苗免疫组的免疫合格率均为65％(13/20)，二者的HI平均效价分别为1：14.93和1：12.99，sHA1-Fc滴鼻免疫组的HI效价略高于灭活疫苗免疫组。
呼吸道局部特异性抗体SIgA和IgY冲洗液的制备
(1)二免后10d每组各取5只，各组提前禁食禁水8h后将鸡处死，置75％的酒精中浸泡3-5min，全身消毒。仰卧，无菌眼科剪和眼科镊剪开颈部皮肤，暴露气管并分离气管，喉头下方插入气管内，用1ml灭菌的PBS分三次洗涤鸡气管，获得的冲洗液经10000rpm/min离心5min，取上清即为气管洗液，-20℃冻存。
(2)分离肺脏，放入7mL离心管中，加入1.5mL灭菌PBS(PH7.4)，用剪刀将肺脏剪碎，10000rpm/min离心5min，上清即为肺洗液，-20℃冻存。
(3)将气管灌洗液与肺脏上清液样品按1：5稀释，每孔100μL，做间接ELISA，方法同上。
检测结果显示sHA1-Fc滴鼻免疫组气管和肺脏冲洗液中的特异性IgY抗体的ELISA抗体效价分别为1：128和1：488，且显著高于其他免疫组。sHA1-Fc滴鼻免疫组气管和肺脏冲洗液中的特异性sIgA抗体的ELISA抗体效价分别为1:192和1:36，且显著高于其他免疫组(图9)。
细胞因子的检测
(1)使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。
(2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都应做复孔。
(3)加样：100μL/孔加入稀释后的细胞因子标准品至标准品孔，100μL/孔加入样品至样品孔，设置空白孔，用稀释缓冲液(1×)代替样本和标准品。
(4)加检测抗体：50μL/孔加入稀释后的生物素标记抗体。混匀后，盖上封板膜，37°C温育90min。
(5)洗板：扣去孔内液体，300μL/孔加入洗涤液；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。
(6)加酶：100μL/孔加入稀释后的亲和素。盖上封板膜，37℃温育30min。
(7)洗板：重复步骤(5)。
(8)显色：100μL/孔加入TMB，37℃避光温育5-30min之间，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20min可以达到很好的效果。
(9)终止反应：100μL/孔迅速加入终止液终止反应。
结果表明二免后第10d，sHA1-Fc滴鼻免疫组血清中IFN-γ和IL-2含量均最高，分别为243.32pg/mL、341.55pg/mL，与GST-HA1滴鼻免疫组中IFN-γ含量(160.85pg/mL)相比二者差异极显著(P<0.01)，sHA1-Fc皮下免疫组和灭活苗组的IFN-γ含量分别为242.46pg/mL和215.85pg/mL，且与sHA1-Fc滴鼻免疫组相比无显著性差异。GST-HA1滴鼻免疫组、sHA1-Fc皮下免疫组和灭活苗组中IL-2的含量分别为229.73pg/mL、259.05pg/mL和248.02pg/mL，sHA1-Fc滴鼻免疫组与其他各免疫组相比差异极显著(P<0.01)。sHA1-Fc滴鼻免疫组血清中IL-4含量为185.36pg/mL且与各组相比差异不显著(图10)。
MTT法测脾淋巴细胞增殖
(1)二免后10d每组取5只将其处死，置75％的酒精中浸泡3-5min，全身消毒。
(2)将其仰卧位放入超净台中，消毒腹部皮肤，无菌眼科剪和眼科镊剪开腹腔，打开腹腔后换套剪刀镊子，无菌取出脾脏，剥离干净，将脾脏在匀浆器中磨碎。
(3)利用鸡脾脏组织淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
(4)以2mL完全培养液(RPMI-1640)悬浮细胞，取0.1mL在细胞计数板上计数，调整细胞浓度为4×106/mL。
(5)于96孔细胞培养板中各孔中加入上述细胞悬液(细胞浓度为4×106/mL)，90μL/孔，然后加入10μL HA1(终浓度为5μg/mL)作为刺激原，每个样品重复3孔，同时设立不加MTT的阴性对照和不加KG-HA1的空白对照孔，均重复3孔。
(6)混匀，37℃5％CO2培养箱中培养48h。
(7)加入MTT之前，吸弃各孔的的上清，每孔加入100μL基础RPMI-1640，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT，混匀后继续培养4h。
(8)每孔中加入100μL DMSO，微型震荡器震荡5min后，37℃放置30min；
(9)用自动酶标测定仪测OD570nm值。以刺激指数(Stimulation Index,SI)判断淋巴细胞增殖滴度。
结果显示sHA1-Fc滴鼻免疫组刺激指数为2.92，GST-HA1滴鼻免疫组、sHA1-Fc皮下免疫组和灭活苗组的刺激指数分别为1.32、2.16和2.74，sHA1-Fc滴鼻免疫组与GST-HA1滴鼻免疫组和sHA1-Fc皮下免疫组相比均差异极显著(P<0.01)(图11)。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 融合蛋白sHA1-Fc及应用
<130> 融合蛋白sHA1-Fc及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gccagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120
actgctacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acggaaagct ctgcgacctt 180
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt 300
ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaaattc ttggtccaat 420
catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc tgggaaagcc ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540
aataatacca accaagaaga tcttttggtg ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600
gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg aacatcaaca 660
ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720
aggatggagt tcttctggac aattttgaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gccaaactcc aatgggggcg 900
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgct actgggctca gaaatagccc tcaaggagag 1020
agaagaagaa aaagaggatc aggcgggggt gggtccggag gaggtggctc gggatctcag 1080
gtctgccggg tagatcccgt accgcctgta gccccagagg tgcaggtcct ccacccctcc 1140
tcctgcaccc cgagccaatc cgagtcggtg gagctgttgt gtttggtgac ggggttctcc 1200
ccggcgtcgg cggaggtcga atggttggtg gacggagtgg ggggactttt ggtggcctcc 1260
caaagcccgg cggtccgcag cggatccacc tacagcctga gcagccgcgt caacgtcagc 1320
ggcaccgatt ggagggaagg gaagagttac agctgtaggg tgaggcaccc cgcaaccaac 1380
accgtggtgg aggatcacgt caagggatgc ccggacggcg ctcagagctg cagccccatc 1440
cagctgtacg ccatcccacc cagcccgggc gagctgtaca tcagcttaga cgccaaactg 1500
aggtgcctgg tggtcaacct gcccagcgat tccagcctca gcgtcacctg gaccagggag 1560
aagagtggga acctccggcc cgacccgatg gtcctccaag aacacttcaa cggcacctac 1620
agcgccagca gcgccgtccc cgtcagcacc caggattggt tatccgggga gaggttcacc 1680
tgcaccgtgc agcacgagga gctgcccctg ccgctcagca agagcgtcta caggaacacg 1740
ggacccacca ccccacctct gatctacccc ttcgcccccc acccggaaga gctgtccctc 1800
tcccgcgtca ccctgagctg cctggtccgc ggcttccgcc cacgtgacat cgagatccgg 1860
tggctccgcg accaccgcgc cgttcccgcc accgaattcg tcaccaccgc cgtcctcccg 1920
gaagagagaa ccgcaaacgg cgccggcggt gacggcgaca ccttcttcgt gtacagtaag 1980
atgagcgtgg agaccgccaa gtggaacggc gggacggtgt tcgcctgcat ggcggtgcac 2040
gaggcgctgc ccatgcgctt cagccagcgc acgctgcaga aacaggctgg taaataa 2097
<210> 2
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Ala Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Ala Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser
130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Lys Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Gly Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gln Val Cys Arg Val Asp Pro Val Pro
355 360 365
Pro Val Ala Pro Glu Val Gln Val Leu His Pro Ser Ser Cys Thr Pro
370 375 380
Ser Gln Ser Glu Ser Val Glu Leu Leu Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser
385 390 395 400
Pro Ala Ser Ala Glu Val Glu Trp Leu Val Asp Gly Val Gly Gly Leu
405 410 415
Leu Val Ala Ser Gln Ser Pro Ala Val Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Ser
420 425 430
Leu Ser Ser Arg Val Asn Val Ser Gly Thr Asp Trp Arg Glu Gly Lys
435 440 445
Ser Tyr Ser Cys Arg Val Arg His Pro Ala Thr Asn Thr Val Val Glu
450 455 460
Asp His Val Lys Gly Cys Pro Asp Gly Ala Gln Ser Cys Ser Pro Ile
465 470 475 480
Gln Leu Tyr Ala Ile Pro Pro Ser Pro Gly Glu Leu Tyr Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Ala Lys Leu Arg Cys Leu Val Val Asn Leu Pro Ser Asp Ser Ser
500 505 510
Leu Ser Val Thr Trp Thr Arg Glu Lys Ser Gly Asn Leu Arg Pro Asp
515 520 525
Pro Met Val Leu Gln Glu His Phe Asn Gly Thr Tyr Ser Ala Ser Ser
530 535 540
Ala Val Pro Val Ser Thr Gln Asp Trp Leu Ser Gly Glu Arg Phe Thr
545 550 555 560
Cys Thr Val Gln His Glu Glu Leu Pro Leu Pro Leu Ser Lys Ser Val
565 570 575
Tyr Arg Asn Thr Gly Pro Thr Thr Pro Pro Leu Ile Tyr Pro Phe Ala
580 585 590
Pro His Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Arg Val Thr Leu Ser Cys Leu
595 600 605
Val Arg Gly Phe Arg Pro Arg Asp Ile Glu Ile Arg Trp Leu Arg Asp
610 615 620
His Arg Ala Val Pro Ala Thr Glu Phe Val Thr Thr Ala Val Leu Pro
625 630 635 640
Glu Glu Arg Thr Ala Asn Gly Ala Gly Gly Asp Gly Asp Thr Phe Phe
645 650 655
Val Tyr Ser Lys Met Ser Val Glu Thr Ala Lys Trp Asn Gly Gly Thr
660 665 670
Val Phe Ala Cys Met Ala Val His Glu Ala Leu Pro Met Arg Phe Ser
675 680 685
Gln Arg Thr Leu Gln Lys Gln Ala Gly Lys
690 695

Claims (8)

1.融合蛋白sHA1-Fc，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述融合蛋白对应的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的基因在制备禽流感疫苗中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，所述的禽流感疫苗为禽流感H5N1疫苗。
6.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的基因在制备提高鸡免疫力的生物制剂中的应用。
7.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的基因在制备提高鸡HI抗体的生物制剂中的应用。
8.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，包括：
1）. 鸡IgY Fc基因的扩增：按常规方案提取鸡脾脏组织RNA并进行反转录，获得CDNA，再以CDNA为模板，利用Fc-up（含42bp Linker序列）与Fc-down引物进行PCR扩增得到Linker-Fc基因片段；
Fc-up：5'- GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCT CAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜体划线部分为Linker；
Fc-down：5'-CCG CTCGAG TTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜体划线部分为XhoІ；
2）. 禽流感病毒H5N1 HA1的扩增：pFAST HTb-sHA1-Linker-wFc重组质粒为模板，利用sHA1-up与sHA1-down（含42bp Linker序列）引物，用PCR扩增得到sHA1-Linker 基因片段；
Fc-up：5'- GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGG
GATCT CAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜体划线部分为Linker；
Fc-down：5'-CCG CTCGAG TTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜体划线部分为XhoІ酶切位点；
3）. sHA1-Fc融合基因的扩增：以回收的sHA1-Linker和Linker-Fc片段为模板，利用sHA1-up与Fc-down引物，用重叠PCR扩增得到sHA1-Linker-Fc基因片段，简称sHA1-Fc基因，其序列为SEQ ID NO.1所示；
4). 重组质粒pFastBac HTB-sHA1-Fc的构建：将回收的sHA1-Linker-Fc基因片段插入到真核表达载体pFastBac HTB的XbaІ和XhoІ酶切位点之间，获得的重组质粒命名为pFastBac HTB-sHA1-Fc；
5）. 杆粒Bacmid的获得：pFastBac HTB-sHA1-Fc转化感受态DH10Bac，挑取阳性菌落，提取阳性杆粒Bacmid进行PCR鉴定，获得重组阳性杆粒Bacmid；
6）. 利用重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞，收获感染的SF9细胞，经纯化后获得融合蛋白sHA1-Fc，其序列为SEQ ID NO.2所示。
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