CN104830882A - 表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其应用，其是利用禽流感病毒H9N2亚型的HA1基因片段和鸡IgY分子Fc基因片段构建得到融合基因，并将融合基因转染到和缓艾美耳球虫中得到转基因球虫，通过口服方式接种转基因球虫来提高鸡群针对禽流感特异性抗原的免疫反应。该应用使用简单，成本低廉，应用前景广阔。

Description

表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的融合基因及其应用。

背景技术

黏膜是大部分病原入侵宿主的主要部位，因此将外源抗原打靶到黏膜部位，从而激发特异性的黏膜免疫应答是抵抗病原入侵的一种重要策略。但是黏膜表面上皮细胞间的紧密连接使分子很难渗入，其中的一个解决方法是将黏膜抗原靶向肠上皮细胞中的M细胞——黏膜表面和外界环境交界处摄取抗原的一种特殊上皮细胞。抗原一旦被M细胞摄取即可快速移行至上皮细胞的基底部，与集合淋巴结相互作用。但是黏膜上皮细胞中M细胞比例极低（1千万个上皮细胞中只有1个M细胞），使M细胞摄取抗原的总体效率较低，必须采取新策略增加黏膜疫苗的高效性。

最新研究表明，新生儿IgG Fc受体(FcRn)介导母体IgG通过胎盘或肠道运输给胎儿，还可以高效运输抗原至黏膜表面，激发宿主产生较高的特异性免疫应答。研究表明，IgG2a的Fc片段与HSV-2的gD蛋白融合表达后经滴鼻免疫，此融合蛋白可以激发产生很强的CD8+T细胞免疫应答；HIV病毒的Gag蛋白与IgG的Fc片段融合后滴鼻免疫同样可以在鼠的生殖道部位产生高水平的记忆性细胞免疫应答。相似地，在禽类也有抗体IgY（相当于哺乳动物的IgG）的Fc片段受体，CHIR-AB1和FcRY，其中CHIR-AB1分布于鸡的专业抗原递呈细胞如Dc细胞，B细胞以及巨噬细胞表面，而且可以和鸡IgY高亲和性结合；另一类Fc受体FcRY具有与哺乳动物FcRn-IgG相似的结合特性，另外，FcRY可以介导鸡IgY抗体的胞吞，从而介导母源抗体进入鸡胚体内。

因此，基于在哺乳动物模型中的上述策略，我们对禽FcRY免疫功能提出一个新的应用：将鸡IgY Fc片段与禽流感病毒抗原在球虫中融合表达，得到稳定虫株后免疫鸡群，检测其对球虫和病毒抗原特异性的免疫应答，并检测攻毒后的病毒载量。若鸡IgY分子Fc片段与其受体相互作用后确实有如哺乳动物Fc高效运输抗原的免疫功能，那么这种转基因球虫的免疫则可以抵抗流感病毒的感染，在禽流感的预防有广阔前景。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是克服现有黏膜疫苗运输抗原的障碍，以表达鸡IgY分子Fc片段的转基因球虫为载体，提供一种新的抗禽流感免疫策略。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原蛋白（HA、NA、M2、NP）的融合基因。

作为优选，所述禽流感病毒抗原蛋白为禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1。

进一步地，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含有前述融合基因的载体。

进一步地，所述载体的构建方法为：利用传统的Trizol法分别提取禽流感病毒H9N2和鸡的总RNA；设计引物分别扩增得到禽流感病毒H9N2亚型的HA1基因片段和鸡IgY分子Fc基因片段；用搭桥PCR方法将HA1基因和Fc基因片段连接形成融合基因HA1-Fc；亚克隆至克隆载体后对测序鉴定正确的HA1-Fc基因用限制性内切酶AgeI、SacII酶切，将其连接至球虫表达载体，得到载体pchFcRn，载体pchFcRn的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，所述球虫表达载体为pMDEAAssA。

本发明还提供了一种转基因球虫的构建方法，其是将前述载体转染和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）子孢子，接种至鸡后利用抗球虫药物乙胺嘧啶对表达二氢叶酸还原酶突变基因（DHFR-TS3m）的重组子进行压力筛选并连续传代得到稳定表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1的转基因虫株。

本发明还提供了根据所述构建方法得到的转基因球虫。

本发明还提供了前述融合基因在增强禽流感抗原在宿主鸡肠道粘膜内运输效率上的应用。

本发明还提供了前述融合基因在禽类抗禽流感病毒上的应用。

本发明还提供了前述转基因球虫在禽类抗禽流感病毒上的应用。

本发明的有益效果在于：

（一）本发明首次将鸡IgY分子Fc片段与禽流感蛋白融合表达于鸡球虫中，并利用转基因球虫实现了禽流感抗原在宿主鸡肠道粘膜的高效运输，进而实现了抗禽流感预防功能。

（二）本发明所获得的表达鸡IgY分子Fc片段及禽流感病毒相应抗原的转基因球虫使用简单，成本低廉，应用前景广阔。

本发明利用表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原的重组球虫免疫鸡，通过鸡IgY分子Fc片段介导的抗原运送作用，增强粘膜免疫系统对禽流感的应答。

附图说明

图1为本发明融合表达H9N2禽流感病毒HA1与鸡IgY Fc片段的转基因和缓艾美耳球虫的构建与鉴定。

其中：（A）含有鸡IgY分子Fc片段和H9N2禽流感病毒H9N2亚型HA1蛋白融合基因的球虫表达载体pchFcRn的构造图；（B）所获得的转基因球虫表达的报告基因黄色荧光蛋白，bar=10μm；（C）转基因球虫的基因组鉴定及蛋白表达情况,a为用抗HA1多抗鉴定，b为用抗鸡IgY分子Fc抗体鉴定；（D）转基因球虫的间接免疫荧光鉴定图，分别在穿膜和不穿膜的处理方式下用抗HA1多抗和抗鸡IgY分子Fc抗体鉴定；（E）转基因球虫的免疫组化鉴定。

图2为本发明融合表达H9N2禽流感病毒HA1与鸡IgY Fc片段的转基因和缓艾美耳球虫免疫SPF鸡后的体液免疫和细胞免疫反应。

其中：（A）三次免疫后血清中针对流感病毒HA1的ELISA反应；（B）第三次免疫后血清中产生的中和抗体滴度；中和抗体以能保护50%组织培养细胞免于被感染的，能中和100个TCID50病毒血清稀释度的倒数的log2值表示；（C）第三次免疫后10天外周血中分泌IFN的淋巴细胞的数量。

图3为本发明转基因球虫免疫SPF和攻毒后第3天咽喉拭子的病毒载量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

本实施例以和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis)为载体，融合表达鸡IgY分子Fc片段与禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1，得到的转基因球虫免疫鸡群后可以显著提高鸡群针对禽流感特异性抗原的免疫反应，并可以将感染鸡只的禽流感病毒滴度减少81%。

1、载体构建

利用传统的Trizol法分别提取鸡和禽流感病毒H9N2（分离自某养禽场有禽流感症状的病鸡）的总RNA，设计相应的引物来扩增禽流感病毒H9N2亚型的HA1基因片段和鸡IgY分子Fc片段。进一步地，用搭桥PCR方法将HA1基因和Fc基因片段连接形成融合基因HA1-Fc，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。之后，亚克隆HA1-Fc至克隆载体上，对测序鉴定正确的HA1-Fc基因用限制性内切酶AgeI、SacII酶切，将其连接至球虫表达载体pMDEAAssA（由发明人所在实验室基于pBR322载体构建而成，含有柔嫩艾美耳球虫的mic2启动子、药物筛选基因DHFR-TS3m、报告基因黄色荧光蛋白EYFP、柔嫩艾美耳球虫的actin启动子及3’调控序列、刚地弓形虫致密颗粒蛋白8的信号肽序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示）而得到本发明所用的载体pchFcRn（核苷酸序列如SEQ ID No.2所示），如图1A所示。

2、和缓艾美耳球虫转染与转基因球虫筛选

将球虫表达载体pchFcRn用SnaBI进行酶切，然后回收线性化的载体。取1×10⁷个和缓艾美耳球虫子孢子、5-10g的线性化的pchFcRn质粒、5L SnaBⅠ限制性内切酶和100L的核转染缓冲液于核转仪NucleofectorⅡ中使用U-033程序进行转染。将转染后的球虫接种至1日龄AA肉鸡，接种后18小时饲喂含有180ppm乙胺嘧啶药的饲料，收集5-8天粪便中的卵囊，孢子化后在荧光显微镜下观察虫体发光情况。将收取的后代卵囊再接种鸡，并重复进行乙胺嘧啶压力筛选，传代至第5次左右即可获得稳定表达融合的鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒H9N2的HA1基因的转基因球虫，转基因球虫（同时表达黄色荧光蛋白）如图1B所示。

3、转基因和缓艾美耳球虫的Western blot鉴定

取转基因球虫卵囊2×10⁷个加入等体积玻璃珠，用涡旋振荡器振荡20min，取上清用液氮反复冻融3至5次，上清加入蛋白酶抑制剂置于冰上超声裂解。取超声裂解产物上清加入上样缓冲液煮沸后进行SDS-PAGE电泳然后转膜，用5%脱脂奶粉室温预封闭1h，用5%脱脂奶粉按1:1000稀释鼠源针对HA1的多克隆抗体，加入膜上室温孵育1h。用5％脱脂奶粉按1:1000稀释辣根过氧化酶标记的抗鼠二抗，室温孵育1h。膜洗涤3次后用1:1混合的ECL A液和B液浸泡1min，然后在暗室中进行X光片曝光，结果如图1C所示。

4、转基因和缓艾美耳球虫的免疫学实验

将42只3周龄SPF鸡随机分成7组，免疫程序与剂量参照表1，每次免疫间隔两周，第三次免疫后两周进行攻毒，每组攻毒3只，同居感染3只，测定每次免疫后ELISA抗体，第三次免疫后的中和抗体，利用ELISPOT检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数量及攻毒后3d,5d检测咽喉和泄殖腔棉拭子中的病毒载量，结果见图2和图3。

表1Emi.HA1chFc的免疫保护性实验设计

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒抗原蛋白的融合基因。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述禽流感病毒抗原蛋白为禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求1-3任一项所述融合基因的载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体的构建方法为：利用传统的Trizol法分别提取禽流感病毒H9N2和鸡的总RNA；设计引物分别扩增得到禽流感病毒H9N2亚型的HA1基因片段和鸡IgY分子Fc基因片段；用搭桥PCR方法将HA1基因和Fc基因片段连接形成融合基因HA1-Fc；亚克隆至克隆载体后对测序鉴定正确的HA1-Fc基因用限制性内切酶AgeI、SacII酶切，将其连接至球虫表达载体，得到载体pchFcRn。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述球虫表达载体为pMDEAAssA。

7.一种转基因球虫的构建方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的载体转染和缓艾美耳球虫子孢子，接种至鸡后利用乙胺嘧啶药物进行压力筛选并连续传代得到稳定表达鸡IgY分子Fc片段和禽流感病毒H9N2囊膜蛋白HA1的转基因球虫。

8.根据权利要求7所述的构建方法得到的转基因球虫。

9.权利要求1-3任一项所述的融合基因在禽类抗禽流感病毒上的应用。

10.权利要求8所述的转基因球虫在禽类抗禽流感病毒上的应用。