CN106222192B - 一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母表达系统中的诱导表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒、构建方法、表达及其应用，属于基因工程技术领域，以禽波氏杆菌DNA及以鸡脾脏mRNA为模版合成的cDNA为模版，通过PCR分别获得ompA‑linker基因和鸡IgY‑Fc‑linker基因，再将两份PCR产物进行SOE‑PCR得到ompA‑linker‑Fc融合基因，将融合基因连接至PMD18‑T克隆质粒，连接转化后对重组质粒进行测序，双酶切并连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转化子，获得pPIC9‑ompA‑Fc融合质粒。本发明成功克隆禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc，并将两种基因成功融合至表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，成本低廉，增强了融合蛋白的活性。

Description

一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母表达系 统中的诱导表达及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用。

背景技术

禽波氏杆菌(Bordetella avium,B.avium)引起的禽波氏杆菌病，是一种高度接触性，可水平传播也可垂直传播的，以孵化率降低，死雏率升高和成年鸡上呼吸道症状为特征的疾病。禽波氏杆菌共表达5种外膜蛋白，分别为95、92、91.5、84和51kDa大小。在6株禽波氏杆菌中均发现了相似分子量的铁反应性外膜蛋白(FeRPs)，其中的5种至少为多数禽波氏杆菌外膜中所共有的组分(Terry D et al 1998)。

近年来，由禽波氏杆菌所引起的家禽疫病在世界范围内常有发生，流行病学调查显示禽波氏杆菌已广泛存在并且在不同地区的感染率为10％-45％之间(周东顺等，2004)，常与大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等共同引发细菌多重感染，或者继发于鸡传染性贫血病毒，禽网状内皮增殖症病毒(Jackwood M W et al，1985)，鸡白血病病毒等免疫抑制性病毒，其耐药性不断增加，给养禽业造成的损失越来越大。

胡晓娜等(2007)研究发现，禽波氏杆菌OMP能够刺激机体产生高滴度的抗体水平，足以保护禽免受强毒侵袭；刘冠华等人提取了禽波氏杆菌的总外膜蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备的单克隆抗体，用于检测禽波氏杆菌，发现与其他分子生物学，病原学和血清学检测方法重合率接近100％。Gentry-Weeks Claudia R(1998)等人研究发现禽波氏杆菌的ompA相比其他的omp结构，能够刺激机体产生高水平的抗体，可以作为一种保护性抗原。

然而目前由于某些抗原在体内存留半衰期短的因素，使得其在动物体内发挥免疫原性的时间得以限制。此外，单纯的抗原蛋白仅能够有限的刺激机体的免疫系统。因此，从分子生物学方面延长抗原的半衰期提高抗原的免疫原性是疫苗研究的新的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒构建方法、在毕赤酵母表达系统中的诱导表达及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒，所述pPIC9-ompA-Fc重组质粒是通过分别提取禽波氏杆菌DNA及鸡脾脏RNA，并通过PCR及RT-PCR方法扩增禽波氏杆菌ompA基因及鸡IgY Fc基因，并在基因扩增时通过引物设计插入linker连接子，再以SOE-PCR方法扩增融合的ompA-Fc基因，以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9表达质粒为载体，在pPIC9质粒的限制性酶切位点Xho I和Not I之间插入ompA-Fc基因，构建的一种含ompA-Fc基因和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9-ompA-Fc重组质粒。

为了实现上述目的，本发明还提供了所述pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)从NCBI中查找禽波氏杆菌标准株ompA基因及鸡IgY Fc基因的核苷酸序列，并与pPIC9质粒谱图信息相比较，从而确定引物设计时需要引入的双酶切位点为Xho I和Not I；

2)pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建，主要包括以下步骤：

①禽波氏杆菌ompA-linker基因的PCR扩增：

以禽波氏杆菌P5株DNA为模板进行PCR扩增得到ompA-linker基因；

鸡IgY Fc-linker基因的PCR扩增：

提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增得到鸡IgY Fc-linker基因；

分别胶回收ompA-linker及Fc-linker基因，以Primer 1(如SEQ ID NO：4所示)和Primer 4(如SEQ ID NO：7所示)特异性引物进行SOE-PCR扩增得到ompA-Fc融合基因；

②将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒；

③将双酶切重组质粒PMD18-T-ompA-Fc得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接转化，对酶切，测序正确的重组质粒命名为：pPIC9-ompA-Fc。

其中，禽波氏杆菌ompA-linker基因的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、模板DNA1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积为25μL；其PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为56.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II条件为72.0℃，10min。

其中，鸡IgY Fc-linker基因的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、鸡脾脏cDNA 1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II条件为72.0℃，10min。

其中，融合基因ompA-Fc的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、鸡IgY Fc模板0.5μL、禽波氏杆菌ompA模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II条件为72.0℃，10min。

其中，PMD18-T-ompA-Fc重组质粒的连接反应体系：ompA-Fc基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，Solution I 5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h；

双酶切PMD18-T-ompA-Fc反应体系：PMD18-T-ompA-Fc质粒1μg，Not I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

pPIC9-ompA-Fc重组质粒的连接反应体系：10×反应缓冲液1.0μL，ompA-Fc基因2.0μL，双酶切后pPIC9质粒6.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；

双酶切pPIC9-ompA-Fc反应体系如下：pPIC9-ompA-Fc质粒1μg，Not I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h。

为了达到上述目的，本发明还提供了所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒在毕 赤酵母的表达：

1)OmpA-Fc融合蛋白在毕赤酵母的表达：

①将构建的pPIC9-ompA-Fc重组质粒及pPIC9空质粒用Sal I内切酶酶切线性化后，去磷酸化处理，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；将线性化回收的质粒分别用LiCl法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布RDB平板，培养3-5d后鉴定。

②阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，利用通用引物AOX5和AOX3进行PCR扩增毕赤酵母的Aox1基因(外源基因ompA-Fc被插入该基因中)，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴、阳性转化子的PCR产物均出现两条带，出现一条2200bp及490bp条带者为空质粒转化子，出现一条2200bp及1777bp条带者为阳性转化子，其中1777bp长度代表质粒上490bp的基因片段与ompA-Fc融合基因1287bp(不含酶切位点)的长度之和。

③将筛选出的阳性重组子接种至20ml BMGY培养基中，30℃,250rpm震荡培养至OD600＝2-6，离心收集菌体。若为阳性转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为阴性转化子，则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；30℃,250rpm震荡培养96h，每隔24h补加甲醇至1％，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h取1ml培养基，离心取上清后分析表达水平，以确定最佳收菌时间；

2)OmpA-Fc融合蛋白表达产物的鉴定

重组子经过甲醇诱导后，收集培养基，离心取上清液，将上清液与上样缓冲液1:4比例混匀后煮沸，进行SDS-PAGE电泳；Western-blotting鉴定ompA-Fc融合蛋白在毕赤酵母表达的免疫原性。

为了达到上述目的，本发明还提供了所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒的应用，主要为在治疗雏鸡群禽波氏杆菌疫苗中的应用，将所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒溶于水或者TE等缓冲液配成溶液，或用冷冻干燥法制成干粉以备用。

本研究中引入鸡IgY重链稳定区，使融合蛋白的半衰期明显延长，更有利于融合蛋白的后期应用；IgY Fc结构域可形成多聚体，可使重组蛋白更好地表达其生物活性；便于蛋白亲和纯化。鸡IgY与哺乳动物IgG相类似，IgG属哺乳动物体内的多功能免疫球蛋白，也是再次免疫应答的主要抗体。而免疫球蛋白Y(IgY)是鸟类和爬行动物血清中主要的抗体。IgY通过Fc段与表面具有Fc γR的吞噬细胞、NK细胞结合，介导一系列生物学效应，包括中和毒素作用、亲和细胞而导致吞噬调理作用、胞外杀伤及免疫炎症、ADCC作用、激活补体途径等。抗体本身的抗原性，主要取决于抗体重链的Fc段。

本发明带来的有益效果是：本发明成功克隆禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc，并将两种基因成功连接转化至表达质粒，实现了pPIC9-ompA-Fc重组质粒在毕赤酵母表达系统的高效表达，构建的表达质粒以甲醇为诱导剂，成本低廉，并增强了融合蛋白的活性；连接的鸡IgY Fc促进了巨噬细胞功能并延长蛋白的半衰期；该重组质粒可溶于水或者TE等缓冲液配成溶液，或用冷冻干燥法制成干粉；该重组质粒在毕赤酵母表达系统表达的蛋白能在体液及细胞水平上抑制雏鸡禽波氏杆菌的增殖和迁移能力，并可促进雏鸡体内抗体的水平及延长免疫时间，其次可增强鸡体内巨噬细胞的吞噬能力；为雏鸡禽波氏杆菌的治疗提供新的治疗思路，推动养禽业的发展。

附图说明

图1为禽波氏杆菌ompA-linker基因PCR反应结果显示图。

图中M为DL2000Marker，1-3泳道为鸡IgY Fc DNA。bp为碱基对单位。

图2为鸡IgY Fc–linker基因PCR反应结果显示图。

图中M为DL2000Marker，1-6泳道为鸡IgY Fc DNA。bp为碱基对单位。

图3为ompA-Fc融合基因PCR反应结果显示图。

图中M为DL5000Marker，1-4泳道为ompA-Fc DNA。bp为碱基对单位。

图4为PMD-18-T-ompA-Fc重组质粒双酶切显示图。

图中M为DL2000Marker，1-2泳道为酶切后重组克隆质粒PMD-18-T-ompA-Fc。bp为碱基对单位。

图5为pPIC9-ompA-Fc重组质粒双酶切显示图。

图中M为DL8000Marker，1泳道为双酶切后的重组表达质粒pPIC9-ompA-Fc。bp为碱基对单位。

图6为毕赤酵母阳性转化子PCR反应结果显示图。

图中M为DL10000Marker，1-2泳道为阳性显示图，3为阴性显示图。bp为碱基对单位。

图7为SWISS-MODEL软件分析预测融合蛋白空间折叠状态显示图。

图8为SDS-PAGE显示图。

图中M为Blue Plus Protein Marker，5泳道为空质粒阴性对照，1-4泳道分别为第96h、72h、48h、24h诱导后上清样。KDa为蛋白质分子质量单位。

图9为蛋白纯化图。

图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道为纯化蛋白样品。KDa为蛋白质分子质量单位。

图10为Western-blotting显示图。

图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道为对照，2泳道为蛋白样品。试验中一抗分别为鼠抗His标签单抗，大鼠抗omp及HRP标记羊抗小鼠IgY。KDa为蛋白质分子质量单位。

图11为融合蛋白及TPPPS对鸡腹腔巨噬细胞活力影响显示图。

图中A为重组蛋白ompA及ompA-Fc融合蛋白对鸡腹腔巨噬细胞活力影响结果图。B为TPPPS对对鸡腹腔巨噬细胞活力影响结果图。

图12为融合蛋白及TPPPS对鸡腹腔巨噬细胞吞噬活性影响显示图。

图中A为ompA-Fc-TPPPS组，B为ompA-Fc组，C为ompA组，D为TPPPS组，E为PBS组。

图13为融合蛋白及TPPPS对鸡腹腔巨噬细胞MHC-II分子分泌影响显示图。

图中A为ompA-Fc-TPPPS组，B为ompA-Fc组，C为ompA组，D为TPPPS组。图中绿色线为各试验组，红色线为PBS组。

图14为动物试验各免疫指标检测显示图。

图中A为血清抗体效价结果图，B为血清IL-2浓度结果图，C为血清IL-4浓度结果图，D为CD4+T细胞数量结果图，E为CD8+T细胞数量结果图,F为T淋巴细胞转化率结果图。

图15为动物保护性试验显示图。

图中A为发病率，B为保护率。

序列表信息：

SEQ ID NO：1：禽波氏杆菌ompA基因序列；

SEQ ID NO：2：鸡IgY Fc基因序列；

SEQ ID NO：3：融合ompA-Fc基因序列；

SEQ ID NO：4：禽波氏杆菌ompA上游引物Primer1；

SEQ ID NO：5：禽波氏杆菌ompA下游引物Primer2；

SEQ ID NO：6：鸡IgY Fc上游引物Primer3；

SEQ ID NO：7：鸡IgY Fc下游引物Primer4；

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

以下结合实施例详细阐述本发明的具体内容。

实施例1重组质粒pPIC9-ompA-Fc的构建

包括以下步骤：

1)从NCBI中查找禽波氏杆菌标准株ompA(SEQ ID NO:1)及鸡IgY Fc(SEQ ID NO:2)核苷酸序列，并与pPIC9质粒谱图信息相比较，从而确定引物设计时需要引入的双酶切位点为Xho I和Not I；

2)pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建

①禽波氏杆菌ompA-linker基因的PCR扩增

根据GenBank公布的禽波氏杆菌ompA设计如下引物：

Primer1:5-CCGCTCGAGATGCATCATCATCATCATCATAACAAACCCTCCAAAATCGCACTT-3′，短划线部分为Xho I酶切位点，长划线部分为His标签。如序列表SEQ ID NO：4所示。

Primer2:5-CGTATGAACCTCCACCTCCTGATCCACCTCCACCCTTGCGGCTACCGACGATTT-3′，划线部分为linker序列。如序列表SEQ ID NO：5所示。

以禽波氏杆菌P5株DNA为模板，用Primer1和Primer2作为引物对ompA-linker基因进行PCR扩增：

PCR反应条件为：

如图2所示:对回收的ompA-linker基因琼脂糖凝胶电泳得到一条658bp的条带，与预期结果一致。

鸡IgY Fc-linker基因的PCR扩增：

根据GenBank公布的鸡IgY Fc核苷酸序列设计如下引物：

Primer3:5-CAAGGGTGGAGGTGGATCAGGAGGTGGAGGTTCATACGCCATCCCACCCAG-3′，划线部分为linker序列。如序列表SEQ ID NO：6所示。

Primer4:5-TTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGGCGCTGGCTGAAGCGGATG-3′，短划线部分为Not I酶切位点，长划线部分为His标签。如序列表SEQ ID NO：7所示。

提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，以此为模板，利用Primer3和Primer4进行PCR扩增鸡IgY Fc-linker基因：

PCR反应条件为：

如图1所示：对IgY Fc PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条692bp大小的条带，与预期结果一致。

融合基因的PCR扩增：

分别胶回收ompA-linker及IgY Fc-linker基因，以Primer 1和Primer 4特异性引物进行SOE-PCR扩增得到ompA-Fc融合基因；

PCR反应条件为：

如图3所示：对融合基因的SOE-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条为1306bp大小的条带，与预期结果一致。经过基因测序鉴定，融合基因序列正确，如SEQ ID NO：3所示。

②将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接，经转化至DH5α，挑单菌落摇菌提质粒，酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒，具体操作如下：

感受态大肠杆菌制备：

(1)将DH5α菌种在所需LB琼脂平板上划线，37℃温箱中，正置30min后培养8-12h；

(2)挑取单个菌落，无菌接种于约4ml的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，培养过夜；

(3)取过夜的菌液，以1:100的比例接种于100ml的LB液体培养基中，置于37℃摇床培养1.5-2h，转速为220r/min，培养菌液至半浑浊半透明状态(OD600值约为0.4-0.6)；

(4)将菌体转至无菌的用冰预冷的50ml离心管中，在冰上静置10min；使菌液冷却至约0℃。

(5)4℃离心机上离心10min，转速为5000r/min，回收菌体沉淀。

(6)将离心管倒置1min，尽量倒出上清；

(7)用20ml预冷的0.1mol/l的CaCl₂溶液，重新悬浮细胞。

(8)在4℃离心机上5000r/min离心10min；

(9)倒出上清液，将离心管倒置1min，使最后的液体流出，收集沉淀；

(10)加入2ml提前预冷的0.1M的CaCl₂(含有15％的甘油)，用移液器轻轻悬浮细胞沉淀；

(11)为提高转化效率，在4℃放置18h后，再进行分装。分装200μl于每个冻存管中，放于-80℃冰箱中进行保存备用。

连接反应体系：ompA-Fc基因4.5μL，PMD18-T质粒0.5μL，Solution I5.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2h；

PMD18-T-ompA-Fc质粒双酶切反应体系如下：PMD18-T-ompA-Fc质粒1μg，Not I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL， 各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

如图4所示：对重组质粒PMD18-T-ompA-Fc双酶切得到一条2692bp及一条1298bp大小的条带，说明成功构建克隆质粒。

③将双酶切后重组质粒PMD18-T-ompA-Fc得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接转化，对酶切及测序正确的质粒命名为：pPIC9-ompA-Fc；

具体操作如下：

连接反应体系：10×反应缓冲液1.0μL，ompA-Fc基因2.0μL，酶切后的pPIC9质粒6.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；

双酶切pPIC9-ompA-Fc反应体系如下：pPIC9-ompA-Fc质粒1μg，Not I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h。

如图5所示：对pPIC9-ompA-Fc重组质粒双酶切得到一条8000bp及一条1298bp大小的条带，说明该融合基因成功连接到表达质粒中。

实施例2pPIC9-ompA-Fc质粒毕赤酵母表达及纯化：

1)OmpA-Fc融合蛋白在毕赤酵母的表达及鉴定

①将构建的pPIC9-ompA-Fc重组质粒及pPIC9空质粒用Sal I内切酶酶切线性化并胶回收，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；用LiCl法将线性化回收后的质粒分别转化入毕赤酵母GS115株感受态细胞，涂布RDB平板，培养3-5d后鉴定。

LiCl法酵母转化步骤：

(1)将毕赤酵母GS115株接种到到5mL YPD培养基中，30℃摇菌约18h；

(2)取上述菌液，按1:1000的比例接种到50mL YPD培养基中，30℃摇菌约18h，培养到OD值约为0.4～1.0之间；

(3)将上述菌液分装于1.5mL离心管中，13000r/min离心1min，弃去上清，用1mL无菌水洗涤1次，离心去上清，重复2次；

(4)每管加入1mL TE/LiCl溶液，重悬菌体沉淀，室温放置30min，3000r/min离心5min，弃去上清；

(5)每管加入80μL TE/LiCl溶液；

(6)将鲑鱼精DNA水浴煮沸10min，煮完稍加离心迅速置于冰盒上；

(7)取一无菌离心管，依次加入10μL煮沸的鲑鱼精DNA，10μL线性化的pPIC9-ompA-Fc重组质粒/pPIC9空质粒，50μL毕赤酵母GS115株感受态细胞，轻轻混匀，室温孵育1h；

(8)将800μL50％的PEG3350，100μL TE，100μL LiCl混匀后加入到上述溶液中，继续孵育1h；

(9)42～44℃水浴热激15～30min；

(10)3000r/min离心3min，弃去上清；

(11)加入1mL YPD培养基重悬菌体沉淀，30℃摇床上培养3h；

(12)3000r/min离心3min，弃去上清，100μL TE重悬菌体；

(13)将上述菌液均匀涂布于RDB平板上，30℃恒温培养箱培养4-5d。

单酶切pPIC9-ompA-Fc/pPIC9质粒反应体系如下：pPIC9-ompA-Fc/pPIC9质粒1μg，Sal I酶1μL,10×buffer 2.5μL,灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

②阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，利用通用引物AOX5和AOX3进行PCR扩增毕赤酵母的Aox1基因(外源基因ompA-Fc被插入该基因中)，PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：

如图6所示：经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴、阳性转化子的PCR产物均出现两条带，出现一条2200bp及490bp条带者为空质粒转化子，出现一条2200bp及1777bp条带者为阳性转化子，其中1777bp长度表示质粒上490bp的基因片段与ompA-Fc融合基因1287bp(不含酶切位点)的长度之和；挑取阳性转化子进行后续蛋白表达。

阳性转化子成功构建完成后，对连接的基因利用SWISS-MODEL软件进行空间结构预测：

如图7所示：SWISS-MODEL软件分析结果中可以看出试验所连接的两段基因中间以一段肽段连接，并且该肽段两段基因所表达的蛋白分别保持各自的空间结构，互不干扰。因此本试验所选用的表达系统所表达的蛋白仍可分别保留两个基因的空间结构，并且保持其各自免疫原性。

2)OmpA-Fc融合蛋白在毕赤酵母的表达

①在毕赤酵母中诱导表达ompA-Fc融合蛋白

将筛选出的阳性重组子接种至20ml BMGY培养基中，30℃,250rpm震荡培养至OD600＝2-6，离心收集菌体。若为阳性转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为阴性转化子，则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；30℃,250rpm震荡培养96h，每隔24h补加甲醇至1％，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h取1ml培养基，离心取上清分析表达水平，以确定最佳收菌时间。

如图8所示：与对照组相比，在不同时间段取样泳道中都得到一条约为47.2kDa大小的条带，与预期结果一致。并且随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加，这符合毕赤酵母表达规律，因此该重组表达质粒可以在毕赤酵母表达系统中成功表达。

②OmpA-Fc融合蛋白表达产物的鉴定及纯化。

收集培养液，离心取上清，将上清液与SDS上样缓冲液1:4混合后，煮沸10min，进行SDS-PAGE，每孔上样量为40μL。将SDS-PAGE的中蛋白分别转移至3片NC膜中，用0.5％的脱脂奶粉封闭3h,然后将已封闭的2片NC 膜，分别浸入1：1000稀释的兔抗His标签一抗(用0.05％PBST配制)、1:1000鼠抗ompA一抗，37℃摇晃孵育2.5h，取出漂洗3次，再浸入1：5000稀释的HRP-Goat-Anti-Mouse-IgY二抗(用PBST配制)中孵育1.5h，洗膜后用DEB化学显色。第3片NC膜过夜封闭后，漂洗3次后直接浸入1:5000稀释的HRP-Rabbit-Anti-Chicken-IgY二抗(用PBST配制)中孵育1.5h，洗膜后用DEB化学显色。

如图9所示：对收获的蛋白进行纯化后，SDS-PAGE得到一条约为47.2kDa大小的条带，于上述结果一致，因此表明该融合蛋白经毕赤酵母成功表达后得到较好的纯化。

如图10所示：对纯化后的融合蛋白分别利用抗His标签抗体，抗ompA一抗及兔抗鸡IgY二抗进行鉴定，分别在目的条带处得到约为47.2kDa大小的条带，表明经本表达系统表达的蛋白分别保留了禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc的免疫原性。

实施例3体外试验检索

1)吞噬细胞的分离：

①提前2-4天腹腔注射4％巯乙基淀粉肉汤2ml/只鸡(40-80日龄)。

②鸡处死后于酒精中浸泡15min，于超净台中无菌剪开皮肤，用镊子提起腹腔，注射器注入10ml预冷的PBS(分两次注射)，两手指捏住腹腔皮肤多点按摩近30min。

③注射器抽出腹腔悬液于离心管中，2000g离心5min，常温PBS洗涤2次后加入1640培养基，计数以使细胞达到2×10⁶cell/ml，将细胞铺于培养板中，温箱培养2h后，用常温PBS冲洗细胞，贴壁的细胞即为鸡腹腔巨噬细胞，加入培养基继续培养24h。

④为保证巨噬细胞的浓度，2h贴壁后可用2.5mmol/l EDTA 37℃消化15min贴壁细胞并收集培养。

2)巨噬细胞活力检测：

①将上述提取的鸡腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板，各孔分别加入2.5、5、10μg/ml的ompA及ompA-Fc蛋白，12.5、50、100μg/ml的泰山松花粉多糖(TPPPS)，各浓度重复4孔，边缘设置阴性对照孔，防止边缘效应。各孔中加入25μl ConA(20mg/ml)。

②盖上细胞板盖之后用胶带将边缘密封，在显微镜下观察，静止几分钟后后放置于细胞培养箱中培养12h以上。

③待细胞长到铺满全层后，每孔加入10μl MTT(避光)，继续37℃孵育4h，之后每孔加入100μl DMSO。

④轻轻摇匀后酶标仪读取490nm处的吸光度(OD值)。

如图11所示：2.5、5、10μg/ml的重组蛋白ompA及融合蛋白ompA-Fc与不同浓度的TPPPS对巨噬细胞活性没有影响，值得注意的是TPPPS呈剂量依赖型促进鸡腹腔巨噬细胞的增殖。因此本试验选取5μg/ml蛋白及50μg/ml TPPPS进行后续研究。

3)鸡腹腔巨噬细胞吞噬实验检测

①分离培养鸡腹腔巨噬细胞于96孔细胞培养板中，2h纯化后，于各孔加入不同浓度的蛋白，继续培养1h(本试验中分为5μg/ml ompA蛋白组，5μg/mlompA-Fc蛋白组，ompA-Fc-TPPPS组，50μg/ml TPPPS组及PBS组).

②用PBS冲洗细胞培养板3次，利用超净台中鼓风机彻底吹干培养板10min。

③各孔加入100ul大鼠抗omp一抗，37度避光反应1h。

④PBS冲洗细胞培养板3次，利用超净台中鼓风机彻底吹干培养板10min。

⑤各孔加入100ul 1:500二抗，37度避光反应1h。

⑥PBS冲洗细胞培养板3次。弃掉PBS后上机查看荧光情况。

如图12所示：与ompA组相比，鸡IgY Fc的连接有效促进鸡腹腔巨噬细胞对ompA的吞噬，TPPPS的添加能够进一步增强鸡腹腔巨噬细胞对ompA的吞噬能力。

4)MHC-II抗体检测：

①分离培养鸡腹腔巨噬细胞于24孔细胞培养板中，2h纯化后，于各孔加入不同浓度的蛋白，继续培养12h(本试验中分为5μg/ml ompA蛋白组，5μg/ml ompA-Fc蛋白组，ompA-Fc-TPPPS组，50μg/ml TPPPS组及PBS组)。

②EDTA消化细胞，PBS洗涤3次后加入鼠抗鸡MHC-II一抗10ul孵育30min。

③PBS清洗细胞3次后冰育羊抗鼠IgY二抗30min。

④PBS清洗细胞3次后上流式细胞仪计染色细胞数量。

如图13所示：相比于重组禽波氏杆菌ompA疫苗，ompA-Fc疫苗有效促进鸡腹腔巨噬细胞MHC-II受体分泌。而且TPPPS佐剂能有效促进鸡腹腔巨噬细胞MHC-II受体分泌。

实施例4体内试验检测

1)疫苗制备

大量表达ompA-Fc及ompA蛋白,分别采用分光光度计测定蛋白浓度，-80℃保存。ompA-Fc与松花粉多糖按照相应的体积比混合后加入到组织捣碎机进行混匀，使最终的蛋白浓度为100μg/ml；最终的多糖浓度50mg/ml。进行疫苗的稳定性和安全性试验。

2)免疫程序

将雏鸡分为4组，分别为ompA-Fc-TPPPS组、纯化的ompA-Fc组、纯化的ompA组及空白对照组。分别免疫三次，每次间隔两周。在免疫后的3、7、14、21、27、35、42、49d采血，备用。

免疫三次后一周，从每组中选取20只鸡放入一个新的隔离器，并用10LD₅₀禽波氏杆菌的LL株鼻内攻毒。连续7d观察并记录临床表现。临床症状，包括呼吸困难，打喷嚏等。

发病率＝发病鸡的数量/总数×100％。

如图15所示：在感染禽波氏杆菌后，免疫重组禽波氏杆菌ompA疫苗有效增强机体免受该菌的感染几率，ompA-Fc疫苗效果要由于单纯ompA疫苗组，且TPPPS佐剂的添加进一步增强机体对禽波氏杆菌的抵抗力。

3)指标检测

体液免疫的影响：利用间接ELISA方法检测血清抗体效价。

细胞免疫的影响：MTT法检测淋巴细胞转化率，流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞数量，血清IL-2和IL-4含量按照鸡IL-2、IL-4检测试剂盒进行。

如图14所示：结果表明，相比于重组禽波氏杆菌ompA疫苗，ompA-Fc疫苗具有良好的免疫效果。值得注意的是TPPPS作为佐剂显著提高机体抗体水平，血清IL-2和IL-4的分泌水平、淋巴细胞增殖及转化率。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或 变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种pPIC9-ompA-Fc 重组质粒，其特征在于，根据NCBI中查找如SEQ ID NO：1所示的禽波氏杆菌标准株ompA和如SEQ ID NO：2所示的鸡IgY Fc核苷酸序列，设计两对特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点和linker连接子；通过PCR方式分别扩增出两个基因ompA-linker和IgY Fc-linker，并通过SOE-PCR方法将两个基因融合成如SEQ ID NO：3所示的ompA-Fc基因片段；以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9 表达质粒为载体，在pPIC9的限制性酶切位点Not I和Xhol I之间插入ompA-Fc基因全长，构建成一种含ompA-Fc基因全长和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9重组质粒，即pPIC9-ompA-Fc 重组质粒；

其中，所述禽波氏杆菌ompA基因序列和所述鸡IgY-Fc基因序列分别加入的linker连接子为柔性linker肽段连接子，所述连接子为10个氨基酸，所述连接子具有氨基酸序列自选的为：GGGGSGGGGS；

其中，所述pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1) 从NCBI中查找如SEQ ID NO：1所示的禽波氏杆菌标准株ompA和如SEQ ID NO：2所示的鸡IgY Fc核苷酸序列，与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定引物设计中引入pPIC9质粒上携带的酶切位点为Xho I和Not I；

2）pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建：

①禽波氏杆菌ompA-linker的PCR扩增：

以禽波氏杆菌 P5 株DNA为模板，利用含有linker连接子的引物进行 PCR扩增，得到ompA-linker；

鸡IgY Fc-linker的PCR扩增：

提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到鸡IgY Fc-linker；

分别胶回收ompA-linker和Fc-linker基因，以如SEQ ID NO：4所示的禽波氏杆菌ompA上游引物 Primer1和如SEQ ID NO：7 所示的鸡IgY Fc下游引物Primer4特异性引物进行SOE-PCR扩增得到如SEQ ID NO：3所示的ompA-Fc融合基因；

②将胶回收得到的融合基因ompA-Fc，经过16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒；

③将双酶切PMD18-T-ompA-Fc重组质粒得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化，酶切及测序得到正确的重组表达质粒，并命名为：pPIC9-ompA-Fc；

所述两对特异性引物具体为：

禽波氏杆菌ompA上游引物SEQ ID NO：4；

禽波氏杆菌ompA下游引物SEQ ID NO：5；

鸡IgY Fc上游引物SEQ ID NO：6；

鸡IgY Fc下游引物SEQ ID NO：7。

2.根据权利要求1所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒，其特征在于，一对引物，以禽波氏杆菌全基因组DNA为模板PCR扩增ompA基因，得到ompA-linker；另一对引物以鸡脾脏cDNA为模板进行IgY Fc段序列PCR 扩增反应得到IgY Fc-linker；以这两种PCR产物为模板通过SOE-PCR扩增融合基因ompA-Fc。

3.一种根据权利要求1或2所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤如下：

1) 从NCBI中查找如SEQ ID NO：1所示的禽波氏杆菌标准株ompA和如SEQ ID NO：2所示的鸡IgY Fc核苷酸序列，与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定引物设计中引入pPIC9质粒上携带的酶切位点为Xho I和Not I；

2）pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建：

①禽波氏杆菌ompA-linker的PCR扩增：

以禽波氏杆菌 P5 株DNA为模板， 利用含有linker连接子的引物进行 PCR扩增，得到ompA-linker；

鸡IgY Fc-linker的PCR扩增：

提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到鸡IgY Fc-linker；

分别胶回收ompA-linker和Fc-linker基因，以如SEQ ID NO：4 所示的禽波氏杆菌ompA上游引物 Primer1和如SEQ ID NO：7 所示的鸡IgY Fc下游引物Primer4特异性引物进行SOE-PCR扩增得到如SEQ ID NO：3所示的ompA-Fc融合基因；

②将胶回收得到的融合基因ompA-Fc，经过16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒;

③将双酶切PMD18-T-ompA-Fc重组质粒得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化，酶切及测序得到正确的重组表达质粒，并命名为：pPIC9-ompA-Fc。

4.根据权利要求3所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒的构建方法，其特征在于: 禽波氏杆菌ompA的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3 μL、10×buffer (含有Mg²⁺) 2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、dNTP 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、高保真Taq酶0.2 μL，总体积为25μL；其PCR反应条件为：95.0℃，5 min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为56.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II 条件为72.0℃，10 min。

5.根据权利要求3所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒的构建方法，其特征在于，鸡IgY Fc的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3 μL、10×buffer (含有Mg²⁺)2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、dNTP 2.0 μL、鸡脾脏cDNA 1.0 μL、高保真Taq酶0.2 μL，总体积25 μL；PCR反应条件为：95.0℃，5 min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30 s，退火条件为58.0℃，45 s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II 条件为72.0℃，10min。

6.根据权利要求3所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒的构建方法，其特征在于，融合基因的PCR扩增的体系为：ddH₂O 17.3 μL、10×buffer(含有Mg²⁺) 2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、dNTP 2.0 μL、鸡 IgY Fc 模板0.5 μL、禽波氏杆菌ompA 模板0.5 μL、高保真Taq酶0.2 μL，总体积25 μL；PCR反应条件为：95.0℃，5 min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45 s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II 条件为72.0℃，10 min。

7.根据权利要求3所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒的构建方法，其特征在于，PMD18-T-ompA-Fc重组质粒的连接反应体系为：ompA-Fc基因4.5 μL，PMD18-T质粒0.5 μL，SolutionI 5.0 μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接2 h；

双酶切PMD18-T-ompA-Fc反应体系： PMD18-T-ompA-Fc质粒1.0 μg，Not I 酶0.5 μL，Xhol I 酶0.5 μL，10×buffer 2.0 μL，灭菌超纯水补至20 μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2 h ；

pPIC9-ompA-Fc重组质粒的连接反应体系：10×反应缓冲液1.0 μL， ompA-Fc基因2.0μL，酶切后的pPIC9质粒6.0 μL，T4 DNA 连接酶1.0 μL，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；

双酶切pPIC9-ompA-Fc重组质粒的反应体系如下：pPIC9-ompA-Fc质粒1.0 μg，Not I酶0.5 μL，Xhol I 酶0.5 μL，10×buffer 2.0 μL，灭菌超纯水补至20 μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2 h 。

8.一种根据权利要求1或2所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒在毕赤酵母表达系统中的诱导表达，其特征在于包括以下步骤：

1) OmpA-Fc融合蛋白在毕赤酵母的表达：

①将构建的pPIC9-ompA-Fc重组质粒及pPIC9空质粒用Sal I 内切酶酶切线性化后，去磷酸化处理，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；将线性化回收的质粒分别用LiCl法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布RDB平板，培养3-5 d 后鉴定；

②阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，利用通用引物AOX5和AOX3进行PCR扩增毕赤酵母的Aox1基因，外源基因ompA-Fc被插入该基因中，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴、阳性转化子的PCR产物均出现两条带， 出现一条2200 bp及490 bp条带者为空质粒转化子，出现一条2200 bp及1777 bp条带者为阳性转化子，其中1777 bp长度表示质粒上490 bp的基因片段与ompA-Fc融合基因 1287 bp (不含酶切位点)的长度之和；

③将筛选出的阳性重组子接种至20 ml BMGY培养基中，30℃, 250 rpm 震荡培养至OD₆₀₀=2-6，离心收集菌体；若为阳性转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为阴性转化子，则加入1/5体积的BMMY培养基重悬；30℃,250 rpm震荡培养96 h，每隔24 h补加甲醇至1%，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96 h取1ml培养基离心取上清后分析表达水平，以确定最佳收菌时间；

2）OmpA-Fc融合蛋白的鉴定

重组子经过甲醇诱导后，收集培养基，离心取上清液，将上清液与上样缓冲液1:4比例混匀后煮沸， 进行SDS-PAGE电泳； Western-blotting鉴定ompA-Fc融合蛋白在毕赤酵母表达的免疫原性。

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