CN109486846B - 一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用 - Google Patents

一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用，属于基因工程技术领域。其技术方案为：所述重组质粒是以pET‑28a（+）质粒为载体，在pET‑28a（+）限制性酶切位点BamHI和XhoI之间插入合成的Omp10‑Omp28‑L7/L12基因全长，建成含有Omp10‑Omp28‑L7/L12基因片段和卡那霉素筛选标签的pET‑28a（+）重组质粒，即pET‑28a（+）‑Omp10‑Omp28‑L7/L12重组质粒。本发明的有益效果为：本发明成功克隆布鲁氏菌Omp10‑Opm28‑L7/L12，并连接转化至表达质粒，实现了重组质粒在大肠杆菌表达系统的高效可溶性表达，表达的蛋白能在体液及细胞水平上抑制布鲁氏菌的感染、增殖和迁移能力，并可促进小鼠体内抗体的水平及延长免疫时间，为布鲁氏菌病的治疗提供新的治疗思路。

Description

一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌 中的表达和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用。
背景技术
布鲁氏杆菌(brucella)属于布鲁菌，是革兰阴性的球杆菌，一种兼性胞内寄生革兰阴性小球杆菌，多数单个排列，极少数2个相连或呈短杆状，多寄生于网状内皮系统。菌体无鞭毛，不形成芽胞，但有毒菌株可带菲薄荚膜。
动物都可感染布鲁菌病，但以羊、猪、牛最为易感。人也可感染布鲁菌，以羊布鲁菌的感染力最强，危害最严重，其次是牛布鲁菌。主要通过消化道、呼吸道、生殖道及损伤的皮肤、粘膜和吸血昆虫感染，主要侵害生殖系统和淋巴系统、病程反复，目前无法治愈，不仅给畜牧业带来巨大的经济损失，还严重威胁着人类的健康。
国内外的研究工作已经发现并筛选了部分具有较好免疫原性的蛋白质作为布鲁氏菌诊断和亚单位疫苗的候选蛋白。目前，研究较多的分子有布鲁氏菌主要外膜蛋白，细菌表面蛋白BCSP31，胞质结合蛋白P39，铁结合蛋白BFR，二氧四氢蝶咙合成酶BLS，Cu-Zn超氧化物歧化酶Cu-Zn SOD，热休克蛋白GrOEL、GrOES，转运蛋白YajC，DNA修复蛋白UvrA，核蛋白L7/L12等。
Omp28是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白。有报道显示在牛、羊、山羊、和人类的布鲁氏菌感染中都可以检测到Omp28抗原的存在。使用Omp28作为检测抗原，准确率可以达到90％以上(SecO-Mediavilla P.etc，2003)。Omp10具有更好的保守效果，布鲁氏菌外膜蛋白Omp10，存在于所有已知的布鲁氏菌的种和生物型之中(ClOeckaert A，1999；TibOr A，1999)，被期待能应用于加强布鲁氏菌的血清学检测。L7/L12核蛋白重要的布鲁氏菌优势抗原，各菌株中具有高度的保守性，研究发现，从布鲁氏菌中提取的L7/L12蛋白能特异地刺激感染动物的单核细胞，并促进γ干扰素(γ-IFN)的转录和表达，起辅助免疫保护作用(S.C.Oliverira.Etc,1994)。
发明内容
将Omp10、Omp28和核蛋白L7/L12基因联合应用于布鲁氏菌的血清学检测，不仅可以提高检测的敏感性和准确性，也能够区分天然感染与疫苗接种反应,具有良好的应用前景。并且可以作为基因工程疫苗的候选抗原，构建亚单位疫苗，通过与佐剂相配合来免疫动物，诱导细胞和体液型免疫反应，从而产生保护力。为了实现上述发明目的，本发明提供了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用。
本发明的具体方案如下：一种布鲁氏菌三种基因重组质粒，所述布鲁氏菌三种基因重组质粒是通过提取布鲁氏菌标准株(M28株)基因组DNA，通过PCR方法扩增布鲁氏菌Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因，再以SOE-PCR方法扩增Omp10-Omp28-linker基因，最后以SOE-PCR方法扩增0mp10-Omp28-L7/L12基因含卡那霉素筛选标签的pET-28a(+)表达质粒为载体，在pET-28a(+)质粒的限制性酶切位点BamH I和Xhol I之间插入Omp10-Omp28-L7/L12基因，构建的一种含Omp10-Omp28-L7/L12基因和卡那霉素筛选标签的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒。
为了实现上述目的，本发明还提供了所述布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)从NCBI中查找布鲁氏菌标准株(M28株)Omp10、Omp28、L7/L12核苷酸序列如SEQID NO：1、2、3所示与pET-28a(+)质粒图谱比较，确定引物设计中引入pET-28a(+)质粒上携带的限制性酶切BamH I和Xhol I；
2)pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的构建：
①Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker的PCR扩增
以布鲁氏菌标准株(M28)DNA为模板，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker，Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker的基因扩增序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；
分别胶回收Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因，以羊布鲁氏菌Omp10上游引物Primer1和Omp28下游引物Primer4作为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到Omp10-Omp28-linker融合基因，Omp10-Omp28-linker融合基因序列如SEQ ID NO：4所示；
以Omp10上游引物Primer1和L7/L12下游引物Primer6作为特异性引物进行SOE-PCR扩增,得到Omp10-Omp28-L7/L12融合基因，Omp10-Omp28-L7/L12融合基因序列如SEQ IDNO：5所示；
其中，Omp10上游引物Primer1的序列如SEQ ID NO:6，Omp28下游引物Primer4的序列如SEQ ID NO:9，L7/L12下游引物Primer6的序列如SEQ ID NO:11；
②将胶回收得到的Omp10-Omp28-L7/L12融合基因与pET-28a(+)质粒酶，经过16℃过夜连接，经转化，转化到DH5α中，测序得到pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒；
③将DH5α摇菌扩增，提质粒，将质粒转化到BL21(DE3)plysS中，菌液PCR验证阳性转化。
其中，Omp10-linker、linker-Omp28-linkerr和L7/L12-linker的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、模板DNA 1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积为25μL；其PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为94.0℃，30s，退火条件为55.0℃，30s，延伸I条件为72.0℃，45s；延伸II条件为72.0℃，10min。
融合基因Omp10-Omp28-linker的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、Omp10-linker模板0.5μL、Omp28-linker模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，60s；延伸II条件为72.0℃，10min。
融合基因Omp10-Omp28-L7/L12的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、Omp10-Omp28-linker模板0.5μL、L7/L12-linker模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II条件为72.0℃，10min。
双酶切pET-28a(+)反应体系：pET-28a(+)质粒7μg，BamH I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中30min；
pET-28a(+)-0mp10-Omp28-L7/L12重组质粒的连接反应体系：5×反应缓冲液1.0μL，0mp10-Omp28-L7/L12基因2.0μL，酶切后的pET-28a(+)质粒1.0μL，T4 DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃金属浴中连接过夜；
双酶切pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的反应体系如下：pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12质粒1μg，BamH I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，5×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中30min。
为了达到上述目的，本发明还提供了所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒在大肠杆菌中的表达，包括以下步骤：
1)将构建的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒及pET-28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB琼脂平板，培养8-12h后鉴定；
2)阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，利用设计的Omp10-Omp28-L7/L12的上下游引物进行PCR扩增目的基因，目的片段长度约为1600bp；
3)将筛选出的阳性重组子接种至5ml自动表达培养基中，30℃,200rpm震荡培养，分别在2、4、6、8小时离心收集菌体，弃掉上清，用PBS重悬菌体沉淀，按4:1取重悬后的菌体加入5×SDS-PAGE loading buffer，煮菌10min后，离心取上清进行SDS-PAGE，以确定最佳表达时间；
4)重组子经过诱导表达后，收集培养基，离心取菌体沉淀，将上清液与上样缓冲液1:4比例混匀后煮沸，进行SDS-PAGE电泳；Western-blotting鉴定Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白在大肠杆菌中表达的免疫原性。
一种如上述的布鲁氏菌三种基因重组质粒在预防布鲁氏菌中的应用。
一种如上述的布鲁氏菌三种基因重组质粒在大肠杆菌中的表达，表达的蛋白在检测和制成亚单位疫苗的应用。
本发明的有益效果是：本发明成功克隆布鲁氏菌Omp10-Opm28-L7/L12，并将3个基因成功连接转化至表达质粒，实现了pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒在大肠杆菌表达系统的高效可溶性表达，构建的表达质粒以自动诱导培养基，成本低廉，操作简单，并增强了融合蛋白的活性；三个蛋白连接更加增强了蛋白的免疫原性；该重组质粒为可溶性表达，表达效率高，三个蛋白连接可以制备检测的试剂盒，同时可以作为亚单位疫苗进行临床试验；该重组质粒在大肠杆菌表达系统表达的蛋白能在体液及细胞水平上抑制布鲁氏菌的感染、增殖和迁移能力，并可促进小鼠体内抗体的水平及延长免疫时间；为布鲁氏菌病的治疗提供新的治疗思路，推动牛羊产业的发展。
附图说明
图1为Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因PCR反应结果显示图。图中M为DL10000 Marker，2-4泳道为Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker DNA，bp为碱基对单位。
图2为Omp10-linker与linker-Omp28-linker SOE-PCR反应结果显示图。图中M为DL10000 Marker，1、2泳道为SOE-PCR后Omp10-Omp28-linker DNA，bp为碱基对单位。
图3为Omp10-Omp28-linker与L7/L12-linker SOE PCR反应结果显示图。图中M为DL10000 Marker，1-2泳道为SOE-PCR后Omp10-Omp28-L7/L12DNA，bp为碱基对单位。
图4为pET-28a(+)双酶切结果显示图。图中M为DL2000Marker，1、2泳道为双酶切结果显示图，bp为碱基对单位。
图5为BL21(DE3)plysS阳性转化子双酶切反应结果显示图。图中M为DL10000Marker，2-3泳道为酶切结果，bp为碱基对单位。
图6为BL21(DE3)plysS阳性转化子PCR反应结果显示图。图中M为DL10000 Marker，2-5泳道为PCR结果，bp为碱基对单位。
图7为SWISS-MODEL软件分析预测融合蛋白空间折叠状态显示图。
图8为SDS-PAGE显示图。图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道为空质粒阴性对照，2-5泳道分别为第6h、8h、10h、12h、诱导后上清样。55.4KDa为蛋白质分子质量单位。
图9为蛋白纯化图。图中M为Blue Plus Protein Marker，2泳道为纯化蛋白样品。55.4KDa为蛋白质分子质量单位。
图10为Western-blotting显示图。图中M为Blue Plus Protein Marker，1泳道为对照，2泳道为蛋白样品。试验中一抗别为鼠抗布鲁氏菌S2全菌蛋白多抗。55.4KDa为蛋白质分子质量单位。
图11为sIgA及血清IgG效价结果图。图中A为为气管液sIgA效价结果图，B小肠液sIgA效价结果图，C为血液中IgG效价结果图。
图12为血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度结果图。图中A为IL-2浓度结果图，B为IL-4浓度结果图，C为IFN-γ浓度结果图，D为IL-10浓度结果图。
图13为T淋巴细胞转化率、CD8+T细胞数、CD4+T细胞数结果图。图中A为T淋巴细胞转化率结果图，B为CD8+T细胞数结果图，C为CD48+T细胞数结果图。
图14为疫苗保护试验显示图。图中A为小鼠脾脏中布鲁氏杆菌病含量动态变化图，B为疫苗的保护率。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1布鲁氏菌三种基因重组质粒
本发明实施例提供了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒，所述重组质粒是以pET-28a(+)质粒为载体，在pET-28a(+)限制性酶切位点BamHI和xhoI之间插入合成的Omp10-Omp28-L7/L12基因全长，建成含有Omp10-Omp28-L7/L12基因片段和卡那霉素筛选标签的pET-28a(+)重组质粒，即pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒，所述Omp10-Omp28-L7/L12基因片段的基因扩增序列如SEQ ID NO：5所示。
SEQ ID NO：5Omp10-Omp28-L7/L12基因片段的基因扩增序列
Figure GDA0003155439180000061
实施例2布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法
本发明实施例提供了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)从NCBI中查找布鲁氏菌标准株(28M株)Omp10、Omp28和L7/L12(SEQ ID NO:1、2、3)核苷酸序列，并与pET-28a(+)质粒谱图信息相比较，从而确定引物设计时需要引入的双酶切位点为BamHI和Xhol I；
2)重组质粒pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的构建
①Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因的PCR扩增
根据布鲁氏菌Omp10、Omp28和L7/L12基因设计如下引物：
Primer1:5′-CGCGGATCCATGAAACGCTTCCGCATCGTT-3′
其中，划线部分为BamHI酶切位点如序列表SEQ ID NO：5。
Primer2:
5′GCTTCCTCCTCCTCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCCGGCGTTGCGGCGGGTG-3′
Primer3:
5′-GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCAACACTCGTGCTAGCAATTTT-3′
Primer4:
5′-GCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCCTTGATTTCAAAAACGACATT-3′
Primer5:
5′-GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGCTGATCTCGCAAAGATCGTTG-3′
Primer6:
5′-CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAG-3′
其中，划线部分为Xhol I酶切位点如序列表SEQ ID NO：10。
以布鲁氏菌标准株(M28株)DNA为模板进行PCR扩增Omp10-linker、Omp28-linker和L7/L12-linker基因：
Figure GDA0003155439180000071
Figure GDA0003155439180000081
PCR反应条件为：
Figure GDA0003155439180000082
如图1所示:对回收的基因琼脂糖凝胶电泳得到三条条带，分别是432bp、837bp和444bp的条带，与预期结果相符。PCR产物经过基因测序鉴定，证明该产物为扩增出的Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因(SEQ ID NO:1、2、3所示)。
融合基因Omp10-Omp28-linker的PCR扩增：
分别胶回收Omp10-linker、linker-Omp28-linker基因，以Primer 1和Primer 4特异性引物进行SOE-PCR扩增得到Omp10-Omp28-linker融合基因，SOE PCR反应结果如图2所示；
PCR反应体系为：
Figure GDA0003155439180000083
Figure GDA0003155439180000091
Figure GDA0003155439180000092
融合基因Omp10-Omp28-L7/L12的PCR扩增：
分别胶回收Omp10-Omp28-linker、L7/L12-linker基因，以Primer 1和Primer 6特异性引物进行SOE-PCR扩增得到Omp10-Omp28-L7/L12融合基因，SOE PCR反应结果如图3所示；
PCR反应体系为：
Figure GDA0003155439180000093
Figure GDA0003155439180000094
Figure GDA0003155439180000101
②将Omp10-Omp28-L7/L12基因胶回收，胶回收产物与pET-28a(+)质粒酶切产物(如图4所示)胶回收后16℃过夜连接，经转化至DH5α，挑单菌落摇菌提质粒，酶切及测序鉴定后得到pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒，具体操作如下：
感受态大肠杆菌制备：
(1)将DH5α菌种在所需LB琼脂平板上划线，37℃温箱中，正置30min后培养8-12h；
(2)挑取单个菌落，无菌接种于约4ml的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，培养过夜；
(3)取过夜的菌液，以1:100的比例接种于100ml的LB液体培养基中，置于37℃摇床培养1.5-2h，转速为220r/min，培养菌液至半浑浊半透明状态(OD600值约为0.4-0.6)；
(4)将菌体转至无菌的用冰预冷的50ml离心管中，在冰上静置10min；使菌液冷却至约0℃。
(5)4℃离心机上离心10min，转速为5000r/min，回收菌体沉淀。
(6)将离心管倒置1min，尽量倒出上清；
(7)用20ml预冷的0.1mOl/l的CaCl2溶液，重新悬浮细胞。
(8)在4℃离心机上5000r/min离心10min；
(9)倒出上清液，将离心管倒置1min，使最后的液体流出，收集沉淀；
(10)加入2ml提前预冷的0.1M的CaCl2(含有15％的甘油)，用移液器轻轻悬浮细胞沉淀；
(11)为提高转化效率，在4℃放置18h后，再进行分装。分装200μl于每个冻存管中，放于-80℃冰箱中进行保存备用。
双酶切pET-28a(+)反应体系如下：pET-28a(+)质粒1μg，BamH酶0.5μL，XholI酶0.5μL，10×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中30min；
连接反应体系：Omp10-Omp28-L7/L12基因7μL，pET-28a(+)质粒1μL，T4 DNAligase 1μL，5×ligation buffer 1μL各组份混匀后，16℃金属浴中连接3h；
如图5所示：对重组pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12质粒双酶切得到一条5700bp及一条1600bp大小的条带。重组质粒经过基因测序鉴定，Omp10-Omp28-L7/L12序列插入正确，说明成功连接到pET-28a(+)克隆质粒中。
其中，序列表信息如下：
SEQ ID NO：1：NCBI收录的布鲁氏杆菌Omp10基因序列加入连接子
Figure GDA0003155439180000111
SEQ ID NO：2：NCBI收录的布鲁士杆菌Omp28基因序列加入连接子
Figure GDA0003155439180000112
SEQ ID NO：3：NCBI收录的布鲁氏杆菌L7/L12基因序列加入连接子
Figure GDA0003155439180000113
SEQ ID NO：4：Omp10-Omp28-linker基因扩增序列
Figure GDA0003155439180000121
SEQ ID NO：5：Omp10-Omp28-L7/L12基因扩增序列
Figure GDA0003155439180000122
SEQ ID NO：6：Omp10-linker上游引物Primer1
5′-CGCGGATCCATGAAACGCTTCCGCATCGTT-3′
SEQ ID NO：7：Omp10-linker下游引物Primer2
5′-GCTTCCTCCTCCTCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCCGGCGTTGCGGCGGGTG-3′
SEQ ID NO：8：linker-Omp28-linker上游引物Primer3
5′-GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCAACACTCGTGCTAGCAATTTT-3
SEQ ID NO：9：linker-Omp28-linker下游引物Primer4
5′-GCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCCTTGATTTCAAAAACGACATT-3′
SEQ ID NO：10：L7/L12-linker上游引物Primer5
5′-GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGCTGATCTCGCAAAGATCGTTG-3′
SEQ ID NO：11：L7/L12-linker下游引物Primer6
5′-CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAG-3′
实施例3布鲁氏菌三种基因重组质粒在大肠杆菌中的表达
本发明实施例提供了一种布鲁氏菌三种基因重组质粒在大肠杆菌中的表达，包括以下步骤：
1)将实施例2中构建的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒及pET-28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB琼脂平板，培养8-12h后鉴定；
其中，BL21(DE3)plysS感受态细胞步骤如下：
a.取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入10μL目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
b.42℃水浴热激45S，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
c.向每个离心管中加入500μL无菌的LB肉汤培养基(不含抗生素)混匀后置于37℃，200转/每分钟培养1小时，使细菌复苏。
d.吸取200μL已转化的感受态细胞加到有卡那的LB琼脂培养基上，讲细胞均匀涂开，将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板37℃过夜培养。
2)阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，以Primer 1和Primer 6特异性引物进行PCR扩增目的片段(外源基因Omp10-Omp28-L7/L12被插入该基因中)，PCR反应体系如下：
Figure GDA0003155439180000141
PCR反应条件为：
Figure GDA0003155439180000142
如图6所示：经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性转化子的PCR产物均出现条带，出现1623bp长度，Omp10-Omp28-L7/L12融合基因以插入表达质粒中，挑取阳性转化子进行后续蛋白表达。
阳性转化子成功构建完成后，对连接的基因利用SWISS-MODEL软件进行空间结构预测：
如图7所示：SWISS-MODEL软件分析结果中可以看出试验所连接的三段基因中间以两条段肽段连接，并且该肽段两段基因所表达的蛋白分别保持各自的空间结构，互不干扰。因此本试验所选用的表达系统所表达的蛋白仍可分别保留两个基因的空间结构，并且保持其各自免疫原性。
3)在大肠杆菌中诱导表达Omp10-Opm28-L7/L12融合蛋白，具体步骤如下：
a.将筛选出的阳性重组子1ml菌液接种于100ml的含有卡那的LB培养基中。
b.以上培养液于37℃、220转/分钟培养至1.5-2.5h使其达到对数生长期，用分光光度计测得OD600nm＝0.4-0.6。
c.用移液器吸取2ml菌液放4℃作诱导前对照，在剩余的菌液中分别在6、8、10、12、14小时取2ml的菌液(确定最佳诱导时间)。
如图8所示：与对照组相比，自动诱导表达系统中大肠杆菌在10小时表达量最高，泳道中得到一条约为55.4kDa大小的条带，与预期结果一致。并且随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加并且在10h时表达量最高10h后表达量不再升高，这符合大肠杆菌表达规律，因此该重组表达质粒可以在大肠杆菌表达系统中成功表达，最佳诱导时间为10h。
4)Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白表达产物的鉴定及纯化。
a.将诱导10小时后的重组质粒5000r/min，4℃离心15min。弃上清收集菌体沉淀。
b.收集菌体收，每100mg菌体(湿重)加入2ml细菌裂解液(每1ml细菌抽提试剂中已加入10μl蛋白酶抑制剂混合物)，超声裂解菌体。
c.10000r/min，4℃离心3min，收集上清中的可溶性蛋白。
d.用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
e.使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
f.使用适量Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
如图9所示：对收获的蛋白进行纯化后，SDS-PAGE得到一条约为55.4kDa大小的条带，于上述结果一致，因此表明该融合蛋白经大肠杆菌成功表达后得到较好的纯化。
将上纯化后的蛋白与SDS上样缓冲液1:4混合后，煮沸10min，进行SDS-PAGE，每孔上样量为40μL。将SDS-PAGE的中蛋白分别转移至3片NC膜中，用0.5％的脱脂奶粉封闭3h，然后将已封闭的2片NC膜，浸入1：1000稀释的兔抗His标签一抗(用0.05％PBST配制)、37℃摇晃孵育2.5h，取出漂洗3次，再浸入1：5000稀释的HRP-Goat-Anti-Mouse-His二抗(用PBST配制)中孵育1.5h，洗膜后用DEB化学显色。
如图10所示：对纯化后的融合蛋白分别利用抗His标签抗体，鼠抗羊Omp10、Omp28、L7/L12二抗进行鉴定，分别在目的条带处得到约为55.4kDa大小的条带，表明经本表达系统表达的蛋白分别保留了Omp10、Omp28、L7/L12的免疫原性。
实施例4应用
本发明实施例通过以下实验说明本发明的有益效果。
1)疫苗制备
大量表达Omp10-Omp28-L7/L12蛋白,用分光光度计测定蛋白浓度，-80℃保存。Omp10-Omp28-L7/L12与松花粉多糖按照相应的体积比混合后加入到组织捣碎机进行混匀，使最终的蛋白浓度为100μg/ml；最终的多糖浓度50mg/ml。进行疫苗的稳定性和安全性试验。
2)免疫程序
将小鼠分为4组，分别为Omp10-Omp28-L7/L12-TPPPS、纯化的Omp10-Opm28-L7/L12、S2疫苗组及PBS空白对照组。每组分别腹股沟皮下注射0.2mL。在免疫后的0、14、28、42、56d采血，备用。
3)免疫指标检测
体液免疫的影响：利用间接ELISA方法检测气管和小肠粘膜sIgA及血清IgG效价。
细胞免疫的影响：MTT法检测淋巴细胞转化率，流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞数量，血清细胞因子IL-2、IL-4、INF-γ、IL-10浓度按照小鼠IL-2、IL-4、INF-γ、IL-10含量检测试剂盒进行。
如图11、12、13所示：结果表明，融合蛋白能够显著提高机体抗体水平，IL-2、IL-4、INF-γ的分泌水平以及淋巴细胞增殖,且TPPPS佐剂的添加进一步提高了免疫效果。
4)疫苗保护率测定
免疫一周，从每组20只小鼠放入一个新的隔离器。每组腹股沟皮下接种羊种布鲁氏菌标准强毒(M28株)0.2mL(含106CFU)，连续8天检测并计算小鼠脾脏中布鲁氏菌的变化。
免疫三次后一周，从每组20只小鼠放入一个新的隔离器。每组腹股沟皮下接种羊种布鲁氏菌标准强毒(M28株)0.2mL(含106CFU)，连续7天检测观察并记录临床表现。
保护率＝死亡数量/总数量×100％.
如图14所示：布鲁氏菌注射后，免疫Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白有效降低小鼠的感染几率，Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白的保护效果要显著优于空白对照，且TPPPS佐剂的添加进一步增强机体的抵抗力。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种布鲁氏菌三种基因重组质粒、构建方法及其在大肠杆菌中的表达和应用
<141> 2018-12-29
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 432
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 1
cgcggatcca tgaaacgctt ccgcatcgtt gcccccctcg cactcatgtc gcttgcgctg 60
gctgcttgcg aaacaacagg cccgggcagc ggcaatgccc cgatcatagc ccatacccct 120
gccggcatag aaggaagctg ggtcgatccg aacggcatcg cttcctcatt caatggcggc 180
atctttgaaa cccgcaccac cgacaccaac gaaaagctgg cggagggcaa ctatctctac 240
ctgtcgccgc aactcgttga aatcaacatg cggtccatcg tgcgcggcac cacctcgaag 300
gtaaattgcg cactggtttc gccgacgcaa cttaactgca cctcctcggc cggttcgcgc 360
ttctcgctca cccgccgcaa cgccggcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga 420
ggaggaggaa gc 432
<210> 2
<211> 837
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 2
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcaacac tcgtgctagc 60
aattttctcg cagcctcatt ttccacaatc atgctcgtcg gcgctttcag cctgcccgct 120
ttcgcacagg agaatcagat gacgacgcag cccgcgcgca tcgccgtcac cggggaaggc 180
atgatgacgg cctcgcccga tatggccatt ctcaatctct cggtgctacg ccaggcaaag 240
accgcgcgcg aagccatgac cgcgaataat gaagccatga caaaagtgct cgatgccatg 300
aagaaggccg gcatcgaaga tcgcgatctc cagacaggcg gcatcaatat ccagccgatt 360
tatgtctatc ctgacgacaa gaacaacctg aaagagccta ccatcaccgg ctattctgta 420
tccaccagtc tcacggttcg cgtgcgcgaa ctggccaatg ttggaaaaat tttggatgaa 480
tccgtcacgc tcggtgttaa tcagggcggt gatttgaacc tggtcaatga taatccctcc 540
gccgtgatca acgaggcgcg caagcgcgca gtggccaatg ccattgccaa ggcgaagacg 600
cttgccgacg ctgcaggcgt ggggcttggc cgtgtggtgg aaatcagtga actgagccgc 660
ccgcccatgc cgatgccaat tgcgcgcgga cagttcagaa ccatgctagc agccgcaccg 720
gacaattccg tgccgattgc cgcaggcgaa aacagctata acgtatcggt caatgtcgtt 780
tttgaaatca agggaggagg aggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagc 837
<210> 3
<211> 444
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 3
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcgctga tctcgcaaag 60
atcgttgaag acctttcggc cctgaccgtt ctggaagccg ctgagctgtc caagcttctc 120
gaagagaagt ggggcgtttc ggctgctgct ccggtcgctg ttgctgctgc cggtggcgct 180
gcccctgctg ctgccgcaga agaaaagacc gaattcgacg tcgttctcgc tgacggcggc 240
gctaacaaga tcaacgtgat caaggaagtg cgcgcactca ccggtctcgg cctcaaggaa 300
gccaaggact tggtcgaagg cgctccgaag gctgtcaagg aaggcgcctc gaaggacgaa 360
gctgagaaga tcaaggcaca gctcgaagct gctggcgcca aggttgaact caagcatcat 420
catcatcatc attaactcga gcgg 444
<210> 4
<211> 1224
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 4
cgcggatcca tgaaacgctt ccgcatcgtt gcccccctcg cactcatgtc gcttgcgctg 60
gctgcttgcg aaacaacagg cccgggcagc ggcaatgccc cgatcatagc ccatacccct 120
gccggcatag aaggaagctg ggtcgatccg aacggcatcg cttcctcatt caatggcggc 180
atctttgaaa cccgcaccac cgacaccaac gaaaagctgg cggagggcaa ctatctctac 240
ctgtcgccgc aactcgttga aatcaacatg cggtccatcg tgcgcggcac cacctcgaag 300
gtaaattgcg cactggtttc gccgacgcaa cttaactgca cctcctcggc cggttcgcgc 360
ttctcgctca cccgccgcaa cgccggcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga 420
ggaggaggaa gcaacactcg tgctagcaat tttctcgcag cctcattttc cacaatcatg 480
ctcgtcggcg ctttcagcct gcccgctttc gcacaggaga atcagatgac gacgcagccc 540
gcgcgcatcg ccgtcaccgg ggaaggcatg atgacggcct cgcccgatat ggccattctc 600
aatctctcgg tgctacgcca ggcaaagacc gcgcgcgaag ccatgaccgc gaataatgaa 660
gccatgacaa aagtgctcga tgccatgaag aaggccggca tcgaagatcg cgatctccag 720
acaggcggca tcaatatcca gccgatttat gtctatcctg acgacaagaa caacctgaaa 780
gagcctacca tcaccggcta ttctgtatcc accagtctca cggttcgcgt gcgcgaactg 840
gccaatgttg gaaaaatttt ggatgaatcc gtcacgctcg gtgttaatca gggcggtgat 900
ttgaacctgg tcaatgataa tccctccgcc gtgatcaacg aggcgcgcaa gcgcgcagtg 960
gccaatgcca ttgccaaggc gaagacgctt gccgacgctg caggcgtggg gcttggccgt 1020
gtggtggaaa tcagtgaact gagccgcccg cccatgccga tgccaattgc gcgcggacag 1080
ttcagaacca tgctagcagc cgcaccggac aattccgtgc cgattgccgc aggcgaaaac 1140
agctataacg tatcggtcaa tgtcgttttt gaaatcaagg gaggaggagg aagcggagga 1200
ggaggaagcg gaggaggagg aagc 1224
<210> 5
<211> 1623
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 5
cgcggatcca tgaaacgctt ccgcatcgtt gcccccctcg cactcatgtc gcttgcgctg 60
gctgcttgcg aaacaacagg cccgggcagc ggcaatgccc cgatcatagc ccatacccct 120
gccggcatag aaggaagctg ggtcgatccg aacggcatcg cttcctcatt caatggcggc 180
atctttgaaa cccgcaccac cgacaccaac gaaaagctgg cggagggcaa ctatctctac 240
ctgtcgccgc aactcgttga aatcaacatg cggtccatcg tgcgcggcac cacctcgaag 300
gtaaattgcg cactggtttc gccgacgcaa cttaactgca cctcctcggc cggttcgcgc 360
ttctcgctca cccgccgcaa cgccggcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga 420
ggaggaggaa gcaacactcg tgctagcaat tttctcgcag cctcattttc cacaatcatg 480
ctcgtcggcg ctttcagcct gcccgctttc gcacaggaga atcagatgac gacgcagccc 540
gcgcgcatcg ccgtcaccgg ggaaggcatg atgacggcct cgcccgatat ggccattctc 600
aatctctcgg tgctacgcca ggcaaagacc gcgcgcgaag ccatgaccgc gaataatgaa 660
gccatgacaa aagtgctcga tgccatgaag aaggccggca tcgaagatcg cgatctccag 720
acaggcggca tcaatatcca gccgatttat gtctatcctg acgacaagaa caacctgaaa 780
gagcctacca tcaccggcta ttctgtatcc accagtctca cggttcgcgt gcgcgaactg 840
gccaatgttg gaaaaatttt ggatgaatcc gtcacgctcg gtgttaatca gggcggtgat 900
ttgaacctgg tcaatgataa tccctccgcc gtgatcaacg aggcgcgcaa gcgcgcagtg 960
gccaatgcca ttgccaaggc gaagacgctt gccgacgctg caggcgtggg gcttggccgt 1020
gtggtggaaa tcagtgaact gagccgcccg cccatgccga tgccaattgc gcgcggacag 1080
ttcagaacca tgctagcagc cgcaccggac aattccgtgc cgattgccgc aggcgaaaac 1140
agctataacg tatcggtcaa tgtcgttttt gaaatcaagg gaggaggagg aagcggagga 1200
ggaggaagcg gaggaggagg aagcgctgat ctcgcaaaga tcgttgaaga cctttcggcc 1260
ctgaccgttc tggaagccgc tgagctgtcc aagcttctcg aagagaagtg gggcgtttcg 1320
gctgctgctc cggtcgctgt tgctgctgcc ggtggcgctg cccctgctgc tgccgcagaa 1380
gaaaagaccg aattcgacgt cgttctcgct gacggcggcg ctaacaagat caacgtgatc 1440
aaggaagtgc gcgcactcac cggtctcggc ctcaaggaag ccaaggactt ggtcgaaggc 1500
gctccgaagg ctgtcaagga aggcgcctcg aaggacgaag ctgagaagat caaggcacag 1560
ctcgaagctg ctggcgccaa ggttgaactc aagcatcatc atcatcatca ttaactcgag 1620
cgg 1623
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 6
cgcggatcca tgaaacgctt ccgcatcgtt 30
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 7
gcttcctcct cctcgcttcc tcctcctccg cttcctcctc ctccgccggc gttgcggcgg 60
gtg 63
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 8
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcaacac tcgtgctagc 60
aatttt 66
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 9
gcttcctcct cctccgcttc ctcctcctcc gcttcctcct cctcccttga tttcaaaaac 60
gacatt 66
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 10
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcgctga tctcgcaaag 60
atcgttg 67
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> Brucella melitensis
<400> 11
ccgctcgagt taatgatgat gatgatgatg cttgagttca accttggcgc cag 53

Claims (9)

1.一种布鲁氏菌三种基因重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以pET-28a(+)质粒为载体，在pET-28a(+)限制性酶切位点BamHI和XhoI之间插入合成的Omp10-Omp28-L7/L12基因全长，建成含有Omp10-Omp28-L7/L12基因片段和卡那霉素筛选标签的pET-28a(+)重组质粒，即pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒，所述Omp10-Omp28-L7/L12基因片段的基因扩增序列如SEQ ID NO：5所示。
2.一种布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)从NCBI中查找布鲁氏菌M28标准株的Omp10、Omp28、L7/L12核苷酸序列，与pET-28a(+)质粒图谱比较，设计长度特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点BamH I和Xhol I以及linker连接子；
2)pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的构建：
①Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker的PCR扩增；具体为：
以布鲁氏菌M28标准株DNA为模板，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker，Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker的基因扩增序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；
分别胶回收Omp10-linker、linker-Omp28-linker和L7/L12-linker基因，以羊布鲁氏菌Omp10上游引物Primer1和Omp28下游引物Primer4作为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到Omp10-Omp28-linker融合基因，Omp10-Omp28-linker融合基因序列如SEQ ID NO：4所示；
以Omp10上游引物Primer1和L7/L12下游引物Primer6作为特异性引物进行SOE-PCR扩增,得到Omp10-Omp28-L7/L12融合基因，Omp10-Omp28-L7/L12融合基因序列如SEQ ID NO：5所示；
其中，Omp10上游引物Primer1的序列如SEQ ID NO:6，Omp28下游引物Primer4的序列如SEQ ID NO:9，L7/L12下游引物Primer6的序列如SEQ ID NO:11；
②将胶回收得到的Omp10-Omp28-L7/L12融合基因与pET-28a(+)质粒酶，经过16℃过夜连接，经转化，转化到DH5α中，测序得到pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒；
③将DH5α摇菌扩增，提质粒，将质粒转化到BL21(DE3)plysS中，菌液PCR验证阳性转化。
3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，所述布鲁氏菌Omp10-linker、Omp28-linker和L7/L12-linker的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3μL、含有Mg2+的10×buffer 2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、模板DNA 1.0μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积为25μL；其PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为94.0℃，30s，退火条件为55.0℃，30s，延伸I条件为72.0℃，45s；延伸II条件为72.0℃，10min。
4.根据权利要求2所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，所述Omp10-Omp28-linker融合基因的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3μL、含有Mg2+的10×buffer2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、Omp10-linker模板0.5μL、Omp28-linker模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，60s；延伸II条件为72.0℃，10min。
5.根据权利要求2所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，所述Omp10-Omp28-L7/L12融合基因的PCR扩增的体系为：ddH2O17.3μL、含有Mg2+的10×buffer2.5μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、dNTP 2.0μL、Omp10-Omp28-linker模板0.5μL、L7/L12-linker模板0.5μL、高保真Taq酶0.2μL，总体积25μL；PCR反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸I条件为72.0℃，90s；延伸II条件为72.0℃，10min。
6.根据权利要求2所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，双酶切pET-28a(+)反应体系为：pET-28a(+)质粒7μg，BamH I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，10×buffer2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中30min；
所述pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的连接反应体系为：5×反应缓冲液1.0μL，Omp10-Omp28-L7/L12基因2.0μL，酶切后的pET-28a(+)质粒1.0μL，T4 DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃金属浴中连接过夜；
双酶切pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒的反应体系如下：pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12质粒1μg，BamH I酶0.5μL，Xhol I酶0.5μL，5×buffer 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中30min。
7.根据权利要求2所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法，其特征在于，所述布鲁氏菌Omp10、Omp28、L7/L12三段基因序列分别加入的linker连接子为柔性linker肽段连接子，所述连接子具有氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。
8.一种如权利要求1所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒、或者如权利要求2-7任一项所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒的构建方法构建的重组质粒在大肠杆菌中表达的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)将构建的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12重组质粒及pET-28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB琼脂平板，培养8-12h后鉴定；
2)阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，以此为模版，利用设计的Omp10-Omp28-L7/L12的上下游引物进行PCR扩增目的基因，目的片段长度为1600bp；
3)将筛选出的阳性重组子接种至5ml自动表达培养基中，30℃,200rpm震荡培养，分别在2、4、6、8小时离心收集菌体，弃掉上清，用PBS重悬菌体沉淀，按4:1取重悬后的菌体加入5×SDS-PAGE loading buffer，煮菌10min后，离心取上清进行SDS-PAGE，以确定最佳表达时间；
4)重组子经过诱导表达后，收集培养基，离心取菌体沉淀，将上清液与上样缓冲液1:4比例混匀后煮沸，进行SDS-PAGE电泳；Western-blotting鉴定Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白在大肠杆菌中表达的免疫原性。
9.一种如权利要求8所述的布鲁氏菌三种基因重组质粒在大肠杆菌中表达的应用，其特征在于，表达的蛋白在检测和制成亚单位疫苗的应用。
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