CN116179572A - 猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列、表达方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列、表达方法及其应用，属于动物免疫技术领域。本发明通过人工合成的ESPss蛋白的核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，得到目的基因PCR产物和pET‑28a阳性质粒使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切处理后连接后，诱导重组ESPss蛋白的表达，得到保护性抗原ESPss，其可以显著提高小鼠的抗体水平，可以显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子IL‑4和IFN‑γ的表达水平，并为2型、7型和9型猪链球菌感染提供较好的免疫保护作用。

Description

猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列、表达方法及其应用

技术领域

本发明涉及猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列、表达方法及其应用，属于动物免疫技术领域。

背景技术

猪链球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，作为一种条件致病菌，广泛存在于猪的呼吸道、消化道和生殖道中，健康猪也100％带菌。猪链球菌在自然界中分布广泛，血清型种类繁多，不仅猪、马、牛、羊及家禽都可以成为其感染宿主，还可以导致人的感染，是一种重要的人畜共患病。在早期感染病原时，病猪会出现发热、精神萎靡等症状。主要的临床症状表现为淋巴结局部化脓性病症和败血症。

猪链球菌病的诊断依据通常通过对临床症状的辨别和对病理部位进行剖检观察，以此进行初步诊断。如需确诊则需要通过一系列的实验室方法，实验室主要流行的检测方法有三大类：病原分离培养及生化鉴定、血清学鉴定、分子水平鉴定。利用高倍显微镜进行检测，链球菌为革兰氏阳性菌在革兰氏染色镜检呈现紫色，形状为圆球形或椭圆形，呈短链状排列或成串排列。目前根据荚膜多糖的不同，将猪链球菌分为35个血清型(1/2,1～34型)，但仍有相当数量的猪链球菌菌株无法定型，其中猪链球菌2型、7型及9型是常见致病的血清型，猪链球菌2型是临床上分离的最多的血清型，毒力最强。

猪链球菌病的治疗目前主要依赖于抗生素，但是长期使用抗生素会导致菌株产生耐药性，因此应对猪链球菌应该采取更加科学的方法，因此疫苗成为了预防猪链球菌病最科学的方法。目前可用于防治猪链球菌的疫苗包括活菌苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。

随着生物技术的不断发展，基因工程疫苗的开发越来越受到重视，猪链球菌基因工程苗亚单位疫苗重要的一步是保护性抗原的筛选。刘丽娜通过对中国和荷兰的4株猪链球菌的基因比对分析，发现RfeA基因相似性为100％，推测该基因非常保守。通过原核表达后的蛋白免疫小鼠后，用2型强毒株OSZYH33攻击，结果表明RfeA免疫组的小鼠存活率为90％，明显高于对照组，说明该蛋白具有较好的免疫原性。位于细胞表面的HP0245，经过原核表达后，免疫原性分析后发现，在高剂量的SS2攻毒时能提供80％的保护力，同源的HP0245基因与编码胞外肽段的高度保守序列存在于大部分SS标准菌株中，因此HP0245能够成为研制亚单位疫苗的候选蛋白。Enolase被证实在所有血清型的猪链球菌中都有表达，是一段高度保守的序列。有研究证实在小鼠模型上，用特殊佐剂乳化的Enolase，可诱导显著的体液免疫应答，并可以为致死剂量的SS2和SS7的感染提供有效保护。

发明内容

现有研究的保护性抗原目前仅对2型强毒株具有一定的保护效果，而对其他类型的猪链球菌的保护效果不佳，为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种猪链球菌广谱保护性抗原ESPss(Extracellular Solute-binding Protein of S.suis)及其基因序列，并公开其制备方法及具体应用。

本发明上述技术效果通过下述技术方案实现：

一种猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列，其核苷酸编码序列如SEQ.No:1所示。上述核苷酸编码序列由上海派森诺生物限公司完成合成得到。

本发明还提供一种上述所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其包括如下步骤：

1)人工合成SEQ.No:1所示的核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如SEQ.No:2所示，反向引物如SEQ.No:3所示；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，得到目的基因PCR产物；

2)构建重组质粒pET28a-ESPss：使用EcoRⅠ和HindIII酶对目的基因PCR产物和pET-28a阳性质粒分别进行双酶切处理；回收经过双酶切处理过的ESPss基因和pET-28a阳性质粒在16℃金属浴条件下过夜进行连接反应；

3)连接产物测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化后的感受态细胞转接于具有Kan抗性的LB液体培养基中逐级培养，培养温度为37℃；

4)控制培养温度、培养时间和IPTG的浓度诱导重组ESPss蛋白的表达，上清液收集后经镍柱纯化和富集除盐，得到重组蛋白的大小为50kDa的ESPss抗原，利用Western Blot验证其抗原性。

如上所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其中步骤1)中扩增体系的组成如下：LATaq酶25μL，正向引物1μL，反向引物1μL；模板2μL，ddH₂O 21μL，PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min 30s，35个循环，72℃延伸10min。

如上所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，所述步骤2)中目的基因PCR产物的酶切体系的组成为：10×Buffer 2μL，ESPss基因9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH₂O 8μL；pET-28a质粒的酶切体系的组成为10×Buffer 2μL，pET-28a质粒9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH₂O 8μL。

如上所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，所述步骤2)中连接反应体系的组成为：10×Buffer 1μL，ESPss基因7μL，pET-28a质粒1.5μL，T4 DNA连接酶0.5μL。

如上所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，所述步骤3)中测序鉴定步骤具体包括：连接反应产物转化到感受态细胞DH5α,转化后菌液涂在卡那霉素的LB琼脂平板上培养，挑取单菌落转接到LB液体培养基，收集菌液并提取质粒进行测序，并与目的片段进行比对分析。

本发明步骤1)中在引物序列中引入酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，主要是便于后续与原核表达载体的重组反应。

如上所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法中，所述的连接产物转化鉴定具体包括下述步骤：

将连接产物加入到解冻完成的感受态细胞中，42℃水浴热激90s，立即置于冰上2min；室温条件下加入LB培养基，200rpm，37℃下振荡培养1h；将培养完成的感受态细胞培养液8000rpm离心2min后弃去上清，使用培养基重悬菌体，取50μL菌液均匀地涂在卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下倒置过夜培养；挑取平板上单菌落转接至带有卡那霉素抗性的LB液体培养基37℃振荡过夜培养；收集菌液，菌液PCR后使用试剂盒提取质粒，测序，获取的序列利用Snapgene软件与目的片段进行比对分析。

本发明还请求保护猪链球菌保护性抗原ESPss基因序列表达的ESPss蛋白。本发明所述的ESPss蛋白在预防2型、7型、9型血清型猪链球菌感染中的应用。本发明实施例2表明所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物的抗体Ig G的表达水平。实验结果显示，首次免疫时使用保护性抗原免疫和未使用保护性抗原免疫的小鼠抗体IgG水平相当，无显著性差异。首次免疫的第13天和二次免疫后第9天后，使用保护性抗原免疫的IgG水平显著高于未使用保护性抗原免疫的小鼠，且二次免疫后第9天小鼠的IgG水平高于首次免疫的第13天，这表明本发明所述的保护性抗原的能够显著提升小鼠的抗体表达水平。

本发明实施例2显示，所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平。实验结果显示，不论是在血清中还是在肺脏和脾脏中，使用保护性抗原免疫的小鼠的IL-4和IFN-γ的表达水平均明显高于对照组。这表明，所述的保护性抗原具有显著提升IL-4和IFN-γ的表达水平的作用。

本发明与现有技术中的保护性抗原相比，对猪链球菌不同血清型的保护作用更为广谱，具有显著的调节细胞因子和免疫增强效果，具有如下技术优势：

1)本发明ESPss蛋白不仅对于2型血清型猪链球菌感染具有很好的保护作用，而且对于7型、9型猪链球菌感染均具有很好的免疫保护作用。本发明实施例2表明，本发明实施例2表明所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物的抗体Ig G的表达水平。

2)本发明所述的ESPss蛋白能够调节血清及脏器细胞因子的效果，本发明实施例2

表明，所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平。

附图说明

图1.本发明ESPss蛋白的表达和纯化的电泳图，其中M:Protein marker；1:pet28a空质粒；2:ESPss蛋白表达上清液；3:ESPss蛋白表达包涵体裂解液；4，5:纯化的ESPss蛋白。

图2.ESPss蛋白免疫后的抗体水平监测。

图3.小鼠肺脏、脾脏和血清中IL-4、IFN-γ分泌水平检测。

图4.猪链球菌2型、7型和9型的攻毒保护生存曲线

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。本发明的专利保护范围以权利要求书限定的专利保护范围为准。

本发明下述实施例中所使用的2型、7型和9型血清型猪链球菌DNA提取方法如下：

(1)将在-80℃保存好的猪链球菌2型、7型和9型在5％哥伦比亚血琼脂培养基上进行划线复苏后，于37℃培养箱中过夜培养，挑取单克隆接种于TSB培养基，37℃下200rpm摇床培养12h；

(2)取200μL菌液8000rpm离心5min，弃去上清；

(3)用500μL无菌的TE裂解液重悬菌体，8000rpm离心5min，弃去上清；

(4)用100μL无菌的TE裂解液重悬菌体，沸水浴中煮15min后，冰浴5min，12000rpm离心10min，吸取上清用作模板。

本发明下述实施例中质粒的提取方法如下：将含有表达载体pET-28a的DH5α冻存菌经复苏后，挑取单克隆菌落进行扩大培养。根据AXYGEN质粒小提试剂盒说明书提取空载质粒。具体的提取步骤如下所示：

(1)取过夜培养的菌液5mL，12000×g离心1min弃去上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL的S1 Buffer(已加入RNase A)悬浮沉淀，不要留有菌块；

(3)向离心管中加入250μL的S2 Buffer，温和并充分的上下翻转4～6次混合均匀使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5min；

(4)向离心管加入350μL的S3 Buffer，温和并充分的上下翻转6～8次，12000×g离心1min；

(5)吸取步骤4中的离心上清液并转移到制备管(至于2mL中，试剂盒内提供)12000×g离心1min弃滤液；

(6)将制备管放入离心管内，加入500μL的W1 Buffer，12000×g离心1min弃滤液；

(7)将制备管放入离心管内，加入700μL的W2 Buffer(已加入无水乙醇)，12000×g离心1min弃滤液，重复本步骤一次；

(8)将制备管放回2mL离心管中，12000×g离心1min，将吸附在柱中残留的漂洗液去除；

(9)将制备管放入新的1.5mL的离心管中，在制备管膜中央加60～80μL的Eluent(已提前加热至65℃)，室温静置1min后，12000×g离心1min；

(10)测定质粒浓度后于-20℃保存。

实施例1本发明所述的猪链球菌保护性抗原ESPss基因序列及其制备方法

本发明所述的猪链球菌保护性抗原ESPss基因序列的表达方法具体包括如下步骤：a、引物设计及目的基因的扩增

人工合成SEQ.No:1所示的核苷酸序列作为模板，使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如SEQ.No:2所示，反向引物如SEQ.No:3所示；ESPss基因的引物有上海派森诺生物有限公司合成。

以猪链球菌2型为模板进行基因ESPss的扩增，扩增体系如下(50μL):

PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min 30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的基因，将回收的目的基因保存到-20℃。

b、质粒连接，构建pET28a-ESPss重组质粒

将目的基因的PCR产物和pET-28a阳性质粒使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切处理，其中所述目的基因的PCR产物酶切体系(20μL)为

所述pET-28a阳性质粒酶切体系(20μL)为

将配制好的酶切体系放在37℃水浴锅中反应2h，之后经1％琼脂糖凝胶电泳，利用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的基因，测定浓度后放于-20℃储藏备用。

将回收的经过双酶切处理过的ESPss基因和pET-28a阳性质粒在16℃金属浴过夜连接。连接体系(10μL)为：

c、重组质粒转化及鉴定

将重组质粒转化感受态细胞DH5α并进行鉴定，具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱取出感受态细胞DH5α，在冰上解冻；

(2)取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻指弹管壁混匀，请勿振荡混匀，置于冰上孵育30min；

(3)42℃水浴热激90s，立即置于冰上2min；

(4)加入600μL平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃振荡培养1h；

(5)将上述培养好的感受态细胞培养液8000rpm离心2min，弃去上清，用剩余的培养基100～120μL重悬菌体，取50μL菌液均匀地涂在卡那霉素的LB琼脂平板上，倒置在37℃培养箱中过夜培养；

(6)挑取LB琼脂平板上单菌落转接至3mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃振荡过夜培养；

(7)收集菌液，菌液PCR使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作步骤参照质粒试剂盒的使用说明操作。将提取后的质粒送上海派森诺生物有限公司进行测序，获取的序列利用Snapgene软件与目的片段进行比对分析。

d、目的基因原核表达及检测

(1)将成功构建的pET28a-ESPss重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)中，具体步骤参考感受态细胞BL21(DE3)使用说明书，挑取单菌落转接于5mL Kan抗性(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h；

(2)准备好的菌液按1:100的比例转接于10mL Kan抗性(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD_600nm值在0.6～0.8之间时分别加入适宜终浓度为的IPTG，并对诱导的温度、时间及转速等条件进行优化，蛋白在上清中表达；

(3)将经过诱导和未诱导的只含pET-28a空载体的BL21(DE3)和阳性重组菌以及诱导之后的阳性重组菌的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析。

(4)用中性洗涤剂清洗电泳胶板后，再用双蒸水淋洗干净，晾干配制12％的分离胶；

(5)将制备好的样品取15μL加入上样孔中，稳压80V电泳，待指示剂溴酚蓝前沿进入分离胶后即可将电压提高至120V继续电泳，直至指示剂迁移至分离胶下缘时结束电泳。

(6)电泳完毕，取出凝胶，置于有盖的大培养皿中，倒入考马斯亮蓝染色液浸没凝胶，于水平摇床上染色30min。回收染色液，用少量水淋洗凝胶，于水平摇床上脱色至蓝色背景消失。

e、蛋白纯化

经过条件的摸索，发现ESPss蛋白表达形式为可溶性蛋白，其纯化步骤具体如下：

(1)将过夜培养的菌液(含有pET28a-ESPss重组质粒)按1:100的比例转接于200mL含有Kan(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃下200rpm培养至OD_600nm值在0.6～0.8之间；

(2)经过条件摸索发现ESPss蛋白最佳表达条件为37℃、200rpm过夜诱导，终浓度为1mmol/mL的IPTG；

(3)诱导之后的菌液8000rpm离心5min收菌，ESPss蛋白的菌体团块用40mL LysisBuffer吹打混匀并进行超声破碎处理直至溶液变清亮之后8000rpm离心30min分离上清和沉淀，收集上清；

(4)加入8mL的Lysis Buffer用来平衡层析介质，将含有多聚组氨酸标签的蛋白澄清样品上样至柱中，流速控制为0.5～1mL/min，收集流出液以待后续分析；

(5)用10mL的250mM的Elution Buffer洗涤ESPss蛋白，进行梯度洗脱，流速控制为0.5～1mL/min。

f、ESPss蛋白富集及超滤除盐

(1)将10kDa和3kDa超滤管接满UP水，冰上预冷10min；

(2)将纯化好的ESPss蛋白加入到10kDa超滤管，6000rpm离心15min，在超滤过程中不断加入1×PBS进行稀释除盐；

(3)将除盐超滤后的蛋白SDS-PAGE电泳分析，测定蛋白浓度进行分装冻存于-80℃。本发明纯化后的重组蛋白的电泳图如图1所示，其中M:Protein marker；1:pet28a空质粒；2:ESPss蛋白表达上清液；3:ESPss蛋白表达包涵体裂解液；4，5:纯化的ESPss蛋白。

g、重组蛋白抗原性分析

(1)将纯化的各个重组蛋白进行SDS-PAGE，之后恒流240mA,2h冰浴转印到NC膜上；

(2)5％的脱脂乳封闭2h，之后用PBST洗3次，每次10min；

(3)用猪链球菌2型阳性血清(1:200)作为一抗，4℃过夜孵育，之后用PBST洗3次，每次10min；

(4)HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗(1:10000)，室温孵育50min，之后用PBST洗3次，每次10min；

(5)ECL法显色。

实施例2本发明猪链球菌保护性抗原ESPss对小鼠感染的影响

a、2型、7型、9型猪链球菌菌株复壮

(1)将冻存于-80℃的SS2、SS7和SS9菌株分别划线复苏在5％的血平板上，37℃恒温培养箱过夜培养；

(2)挑取血平板上的单克隆于5mL的TSB培养基中37℃、200rpm过夜培养；

(3)将过夜培养的SS2、SS7和SS9菌株1：100接种于10mL的TSB培养基中37℃、200rpm培养6h，8000rpm、5min离心收集菌体，PBS重悬后洗3次，后用PBS调整细菌浓度分别至1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL，每只小鼠腹腔注射200μL；

(4)12～24h内观小鼠发病情况，从濒临死亡的小鼠肺部分离细菌扩大培养，进行PCR鉴定，其中SS2的血清型正向鉴定引物如SEQ.NO.4所示，SS2的血清型反向鉴定引物如SEQ.NO.5所示；SS7的血清型正向鉴定引物如SEQ.NO.6所示，SS7的血清型反向鉴定引物如SEQ.NO.7所示；SS9的血清型正向鉴定引物如SEQ.NO.8所示，SS9的血清型反向鉴定引物如SEQ.NO.9所示。

(5)PCR的反应体系为20μL，2×Taq Mix 10μL，上游引物各1μL，下游引物各1μL，模板各2μL，剩余不足体积用ddH₂O补足。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；30个循环(94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸50s)；72℃延伸7min。将PCR之后的产物经1％琼脂糖凝胶120V电压下电泳30min观察结果。

b、小鼠半数致死量(LD50)的测定

(1)将经小鼠复壮之后的SS2、SS7、SS9株以1：100接种于TSB中，37℃、200rpm培养6h，OD₆₀₀在0.6～0.8；

(2)8000rpm、5min离心收集菌体，用PBS洗3次后重悬，调整细菌浓度分别为2.0×10⁹CFU/mL、1.6×10⁹CFU/mL、2.0×10⁹CFU/mL，将菌悬液以PBS为稀释液进行10倍稀释，取10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5组腹腔接种200μL/只，每组8只小鼠，对照组注射等量PBS，每个实验组均分开饲养，定时观察小鼠发病和死亡情况，连续观察7天；

(3)按照Reed-Muench法计算半数致死量LD₅₀，计算半数致死量(LD₅₀)的公式如下：距离比例r＝(高于50％死亡率A-50)÷(高于50％死亡率A-低于50％死亡率B)

lgLD₅₀＝高于50％死亡率稀释度倒数的对数+距离比例×稀释倍数

根据以上公式算出，即当原菌液稀释成一定的倍数即可造成50％的小鼠死亡，根据实验数据可得SS2的LD₅₀为：3.56×10⁷CFU/mL；SS7的LD₅₀为4.02×10⁷CFU/mL；SS9的LD₅₀为7.88×10⁷CFU/mL。

c、小鼠免疫

将66只3周龄BALB/c小鼠随机分为6组，每组11只小鼠，其中3组免疫ESPss保护性抗原，免疫剂量为100μL(1mg/mL)，剩余3组接种100μL PBS，作为阴性对照组。在免疫之前将各个蛋白和弗氏不完全佐剂1:1混合并乳化，皮下多点注射。第一次免疫14天后进行第二次免疫，免疫剂量均为100μg。

d、猪链球菌2、7、9型攻毒实验

在末次免疫的10天后，各个组免疫的小鼠以8倍LD₅₀ SS2、SS7和SS9通过腹腔注射进行攻击，连续观察7天，记录发病及死亡情况。图4为猪链球菌2型、7型和9型的攻毒保护生存曲线，实验结果显示，未进行ESPss保护性抗原免疫的感染猪链球菌的小鼠在感染后36小时或48小时内死亡，而本发明ESPss保护性抗原可以大幅度提升感染猪链球菌的小鼠的存活率。其中对于9型猪链球菌的保护效果最好。

e、小鼠体内抗体水平的检测

分别以纯化的重组融合蛋白包被ELISA板，设定阴性对照，监测免疫后小鼠血清中抗体效价变化，以P/N值大于或等于2.1作为判定特异性的临界值。

通过眼眶后静脉丛收集适量全血，收集首次免疫的第13天和二次免疫后第9天的小鼠血清，室温静置温育2h后，于4℃中过夜静置，3000rpm、4℃离心15min，收集血清，无菌分装保存于-80℃备用。首次免疫的第13天和二次免疫后第9天小鼠体内抗体水平测定结果如图2所示。实验结果显示，首次免疫时使用保护性抗原免疫和未使用保护性抗原免疫的小鼠抗体IgG水平相当，无显著性差异。首次免疫的第13天和二次免疫后第9天后，使用保护性抗原免疫的IgG水平显著高于未使用保护性抗原免疫的小鼠，且二次免疫后第9天小鼠的IgG水平高于首次免疫的第13天，这表明本发明所述的保护性抗原的能够显著提升小鼠的抗体表达水平。

本实施例中抗体水平的测定方法如下所示：

(1)取96孔可拆ELISA酶标板，每孔分别包被100μL用包被液稀释好的ESPss蛋白(蛋白最终剂量为1μg)，4℃包被过夜；

(2)使用0.5％PBS-T洗液洗板3次，排干水分，每孔加入200μL 1％BSA封闭液，37℃封闭2h。

(3)使用0.5％ PBS-T洗液洗板3次，排干水分；

(4)分比以1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600，1：51200及1：102400稀释免疫后血清；

(5)将上述稀释的血清分别加入已包被好抗原的ELISA板中，每孔100μL，并做3个复孔；

(6)37℃温箱孵育1h后使用0.5％ PBS-T洗液洗板3次，排干水分；

(7)每孔分别加入以1:10000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG 100μL，37℃温箱孵育30min；

(8)使用0.5％PBS-T洗液洗板3次，排干水分；

(9)每孔加入TMB显色液100μL，室温避光孵育15min至反应完全；

(10)每孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm处测定的OD值。

f、小鼠血清及脏器细胞因子的测定

(1)在二免后攻毒前从免疫组和对照组中随机取3只小鼠进行无菌解剖，取出小鼠的肺脏放入事先盛有1mL PBS内按照1：10(mg：mL)称取重量并做好记录(盛有1mL PBS的EP管重量事先已称量好)和肺脏样品一起作匀浆处理，匀浆后3000rpm、4℃离心50min，尽量吸取上清液，分装好，放于-20℃备用；

(2)使用IL-4和IFN-γELISA检测试剂盒检测血清、肺脏和脾脏中的IL-4和IFN-γ的含量，操作步骤见试剂盒内说明书。其测定结果如图3所示。实验结果显示，不论是在血清中还是在肺脏和脾脏中，使用保护性抗原免疫的小鼠的IL-4和IFN-γ的表达水平均明显高于对照组。这表明，所述的保护性抗原具有显著提升IL-4和IFN-γ的表达水平的作用。

Claims (10)

1.一种猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列，其编码核苷酸序列如SEQ.No:1所示。

2.一种猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其包括如下步骤：

1)人工合成SEQ.No:1所示的核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如SEQ.No:2所示，反向引物如SEQ.No:3所示；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，得到目的基因PCR产物；

2)构建重组质粒pET28a-ESPss：使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶对目的基因PCR产物和pET-28a阳性质粒进行双酶切处理；回收经过双酶切处理过的ESPss基因和pET-28a阳性质粒在16℃金属浴条件下过夜进行连接反应；

3)连接产物测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化后的感受态细胞转接于具有Kan抗性的LB液体培养基中逐级培养，培养温度为37℃；

4)控制培养温度、培养时间和IPTG的浓度诱导重组ESPss蛋白的表达，收集其上清液，经镍柱纯化和富集除盐后得到重组蛋白的大小为50kDa的ESPss抗原，利用Western Blot验证其抗原活性。

3.根据权利要求2所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中扩增体系的组成如下：LATaq酶25μL，正向引物1μL，反向引物1μL；模板2μL，ddH₂O 21μL，PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，35个循环，72℃延伸10min。

4.根据权利要求2所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中目的基因PCR产物的酶切体系的组成为：10×Buffer 2μL，ESPss基因9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH₂O 8μL；pET-28a质粒的酶切体系的组成为10×Buffer 2μL，pET-28a质粒9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH₂O 8μL。

5.根据权利要求2所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中连接反应体系的组成为：10×Buffer 1μL，ESPss基因，7μL，pET-28a质粒1.5μL，T4DNA连接酶0.5μL。

6.根据权利要求2所述的猪链球菌保护性抗原ESPss的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中测序鉴定步骤具体包括：连接反应产物转化到感受态细胞DH5α,转化后菌液涂在卡那霉素的LB琼脂平板上培养，挑取单菌落转接到LB液体培养基，收集菌液并提取质粒进行测序，并与目的片段进行比对分析。

7.权利要求1所述的猪链球菌保护性抗原ESPss基因序列表达的ESPss蛋白。

8.权利要求7所述的ESPss蛋白在对2型、7型、9型血清型猪链球菌感染提供免疫保护中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物的抗体Ig G的表达水平。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的ESPss蛋白能够显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平。

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