CN113005072A - 一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用 Download PDF

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李国潮
付强
马春全
何颍欣
林德锐
杨傲冰
陈坚
涂玉蓉
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Foshan University
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Foshan University
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用。所述基因缺失株为：pgm基因缺失的马链球菌兽疫亚种菌株。本发明通过同源重组技术敲除马链球菌兽疫亚种菌株中的pgm基因得到一株基因缺失株Δpgm。该基因缺失株可以有效激活Caspase‑1，降低IL‑18的表达水平，进而使其致病力减弱，作为疫苗有良好的应用前景，对SEZ致病机制的研究具有重要意义。

Description

一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用。
背景技术
马链球菌兽疫亚种(Streptococccus equi ssp.zooepidemicus；SEZ)属于C群链球菌，是我国猪链球菌病的重要病原，导致被感染动物关节炎、脑膜炎、乳腺炎、败血症等，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前，疫苗免疫是有效预防和治疗猪链球菌病的首要措施，临床上的猪链球菌病的疫苗主要有灭活疫苗，亚单位疫苗等。
灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养，然后通过物理或化学方式使其灭活，可由整个病毒或细菌组成，也可由他们的裂解片段组成裂解疫苗。灭活疫苗的免疫机理一般是使受种者产生以体液免疫为主的免疫反应，产生的抗体有中和、清除病原微生物及其毒素的作用，对细胞外感染的病原微生物有较好的保护效果。亚单位疫苗是指利用微生物的某种表面结构成分(抗原)制成的不带有病毒核酸，但是能诱发机体产生抗体的疫苗，其成分仅有几种主要表面蛋白质，可避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病，但一般情况下，亚单位疫苗的免疫原性较低，需要借助其他手段提高免疫效果。
有研究表明，在宿主感染革兰氏阳性菌或阴性菌时Caspase-1的激活起到调控吞噬体成熟的作用。Caspase-1是炎症小体的重要组成部分，参与了机体炎症反应和先天免疫的调节，在宿主先天免疫抵御细菌感染的过程中介导了促炎症因子包括IL-18的产生。Caspase-1参加了细胞的程序性死亡并通过介导炎症反应干预疾病的发展，可将其作为治疗疾病时的靶向目标。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用。本发明通过敲除马链球菌兽疫亚种的pgm基因成功致弱了马链球菌兽疫亚种菌株的毒力，且基因缺失菌株在感染过程中通过依赖激活Caspase-1使致病力减弱。
第一方面，本发明提供一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株，所述基因缺失株为：pgm基因缺失的马链球菌兽疫亚种菌株。
本发明将得到的基因缺失株命名为基因缺失株Δpgm。该基因缺失株在pgm基因缺失后，保证亲本株免疫原性的同时毒力明显减弱，致病力降低。此外，本发明提供的马链球菌兽疫亚种基因缺失株可以激活宿主Caspase-1表达，将Caspase-1作为治疗靶标以抵御SEZ的感染。
进一步地，所述马链球菌兽疫亚种基因缺失株的亲本株为马链球菌兽疫亚种C55138。
进一步地，所述pgm基因缺失为pgm基因第808～1325位的核苷酸序列缺失。
第二方面，本发明提供一种制备所述基因缺失株的制备方法，包括：
通过同源重组敲除所述马链球菌兽疫亚种菌株的pgm基因。
进一步地，所述同源重组包括：
构建含有pgm上游同源臂和下游同源臂的重组质粒，将所述重组质粒导入马链球菌兽疫亚种感受态细胞中。
第三方面本发明提供一种疫苗，包括所述基因缺失株和佐剂。
进一步地，所述佐剂为MontanideTM GEL 01佐剂。
本发明进一步提供所述基因缺失株制备用于免疫马链球菌兽疫亚种引起的疾病的药物中的应用，例如猪链球菌病。
本发明进一步提供所述基因缺失株在降低IL-18分泌水平中的应用。
本发明进一步提供所述基因缺失株在提高Caspase-1水平中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明以马链球菌兽疫亚种C55138菌株为亲本株，采用同源重组的技术构建pgm基因缺失突变菌株Δpgm，通过电镜扫描分析突变株荚膜形态和制作生长曲线分析突变株生长特性；测定毒力以评价突变株致病力；建立小鼠感染模型，检测小鼠血清中的细胞因子分泌水平变化；通过Weatern Blot检测感染小鼠脾脏Caspase-1、IL-18的蛋白表达情况；建立Caspase-1-/-小鼠感染模型，检测IL-18的分泌水平；通过Caspase-1+/+小鼠和Caspase-1-/-小鼠的致病力试验，研究突变菌株Δpgm致病力减弱依赖于Caspase-1的机制。
相较于亲本株马链球菌兽疫亚种C55138而言，本发明提供的马链球菌兽疫亚种基因缺失株感染机体时致病力明显减弱，作为疫苗有良好的应用前景，对SEZ致病机制的研究具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的pgm基因缺失株的筛选和鉴定结果；其中左为同源重组双交换示意图，右为PCR和RT-PCR验证pgm基因缺失的结果示意图。
图2为本发明实施例1提供的亲本菌株C55138和突变菌株Δpgm的形态观察结果；其中，a为亲本菌株C55138，b为突变菌株Δpgm。
图3为实施例1提供的亲本菌株C55138和突变菌株Δpgm的生长曲线结果。
图4为本发明实施例1提供的突变菌株Δpgm和C55138菌株感染BALB/C小鼠存活曲线结果。
图5为本发明实施例1提供的Caspase-1+/+小鼠分别感染C55138、Δpgm后血清IL-18因子水平检测结果。
图6为本发明实施例1提供的突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138感染Caspase-1+/+小鼠后的Caspase-1、IL-18蛋白表达水平检测结果。
图7为本发明实施例1提供的Caspase-1-/-小鼠分别感染突变菌株Δpgm和C55138菌株后，小鼠血清内的IL-18因子水平检测结果。
图8为本发明实施例1提供的C55138、Δpgm菌株分别感染Caspase-1+/+、Caspase-1-/-小鼠后的存活率结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例所用E.coli Comprtent Cells DH5α和T-Vector pMDTM 19(Simple)均购自Takara公司；链球菌温敏型自杀载体pG+host5由广东省高校重点实验室保存；马链球菌兽疫亚种(SEZ；C55138株)购自国家兽医微生物菌种保藏中心；马链球菌兽疫亚种感受态由申请人制备保存。
本发明实施例使用的DNA Marker、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、Ex taq DNA聚合酶、EvoM-MLV反转录试剂盒II均购自Takara公司；质粒DNA小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；抗生素购自Genview公司；新生牛血清购自Gibco公司；小鼠IL-18ELISA检测试剂盒购自R&D公司；Cleaved Caspase-1(Asp296)Rabbit mAb购自CST公司；Anti-IL-18antibody(EPR19956)购自Abcam公司。
本发明实施例使用SPF级6～8周龄BALB/c小鼠、Caspase-1+/+(C57BL/6品系)小鼠购自广东省医学实验动物中心；Caspase-1-/-小鼠由华南农业大学实验动物中心(许可证号：SYXK(粤)2019-0136)饲养繁殖。
本发明实施例使用t检验的方法对所得的数据进行统计学分析，ELISA试验数据按照说明书要求进行分析；P＜0.05认定为有统计学意义上的差异，P＜0.001认定为差异极显著。数据处理后用软件Graphpad Prism 8.0作图。
实施例1
1、引物设计与合成
根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种ATCC 35246的全基因组序列(NO.CP002904.1)，以马链球菌兽疫亚种C55138菌株基因组DNA为模板，使用Primer 5.0软件在pgm基因上下游设计同源臂引物，引物由上海生工生物有限公司合成。引物信息见表1。
表1引物及序列信息
Figure BDA0003013717130000051
2、同源重组质粒pG+host5-pgm-LR的构建
提取SEZ C55138全基因组DNA作为PCR模板，用引物pgmL-f、pgmL-r扩增pgm基因上游同源臂(pgmL)和引物pgmR-f、pgmR-r扩增pgm基因下游同源臂(pgmR)，将上下游同源臂片段分别与19T-Vector连接后转化，获得重组质粒19T-pgm-L和19T-pgm-R。
利用限制性核酸内切酶消化19T-pgm-L质粒与pG+host5质粒，回收酶切产物，并进行连接转化，随后提取重组质粒pG+host5-pgm-L；将重组质粒pG+host5-pgm-L和质粒19T-pgm-R分别进行双酶切，回收酶切产物后连接并转化，转化子经PCR鉴定为阳性克隆后，提取同源重组质粒并命名为pG+host5-pgm-LR，置于-80℃冰箱保存备用。
PCR反应体系为：上游引物、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Ex taq DNA聚合酶(2×)12.5μL，模板DNA(0.1～2μg)1μL，ddH2O补至总体积为25μL。
PCR反应程序为(每个反应2～4步骤30cycles)：预变性(94℃，5min)，变性(94℃，30s)，退火(55℃，30s)，延伸(72℃，1min 50s)，后延伸(72℃，5min)。
双酶切反应体系(50μL)：质粒≤1μg，10×H Buffer 5μL，限制性核酸内切酶各1.5μL，ddH2O补至总体积为50μL，上述体系下37℃水浴锅孵育2-3h。
3、基因缺失突变株Δpgm的构建、筛选与鉴定
取1μL pG+host5-pgm-LR同源重组质粒通过电转化整合入马链球菌兽疫亚种C55138感受态细胞中，电击产物迅速转移至TSB培养基中，28℃，200r/min复苏2h；复苏后的菌液涂布于含有红霉素抗生素的TSA平板(含有5％新生牛血清)中，28℃恒温培养36h至单菌落出现。
挑取单菌落接种于TSB(含有5％新生牛血清)中，37℃培养至平台期。将菌液稀释涂布于含有红霉素抗生素TSA平板(含有5％新生牛血清)中，只有发生单交换或仍含有同源重组质粒的菌株才能在该平板上生长。挑取平板上的菌落于TSB中(含有5％新生牛血清)培养至对数生长后期，经PCR鉴定后筛选发生单交换的菌株，用同源臂双外侧引物pgmL-f、pgmR-r扩增出现两条条带即为成功发生单交换的菌株。
将成功发生单交换的菌株以1:100的比例接种于TSB培养基(含有5％新生牛血清)中，重复传代3-5次，稀释涂布于TSA平板(含有5％新生牛血清)。挑取平板上的菌落分别点接于含有红霉素抗性与不含有红霉素抗性的TSA平板(含有5％新生牛血清)，选取在不含红霉素平板上生长但在含有红霉素平板上不生长的菌落，提取细菌DNA，用同源臂双外侧引物对DNA进行PCR扩增，成功发生双交换的菌株仅能扩增出887bp大小的短片段，而恢复为野生菌株可以扩增出1405bp大小的长片段。经PCR鉴定后，将成功敲除pgm基因的菌株命名为Δpgm，纯化并保存于-80℃冰箱。
图1为pgm基因缺失株的筛选和鉴定结果，其中左为同源重组双交换示意图，右为PCR和RT-PCR验证pgm基因缺失的结果示意图。经PCR验证，当用亲本菌株C55138 DNA为模板时，扩增出一条1404bp大小的条带，用pgm基因缺失株DNA为模板时，仅扩增出一条886bp大小的条带，与预期缺失pgm基因中的518bp结果相符合。通过RT-PCR证实，pgm基因在缺失株Δpgm内缺乏其转录能力。结果表明，本发明通过该技术成功构建了pgm基因缺失株Δpgm。
4、透射电子显微镜观察
收集处于对数生长期的突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138菌液，用2.5％戊二醛固定2h。0.1M磷酸漂洗液漂洗三次，漂洗后用1％锇酸固定液固定2～3h，漂洗；分别用50％、70％、90％乙醇脱水15～20min；以90％乙醇：90％丙酮＝1:1的比例在4℃中作用15～20min，90％丙酮4℃作用15～20min，100％丙酮室温作用15～20min；浸透后菌团包埋于胶囊的纯树脂中，70℃处理处理12h以聚合；随后置于37℃烘箱内过夜烘箱内过夜，45℃烘箱内静置12h，60℃烘箱内48h以固化；用Leica UC 7超薄切片机切成60n超薄片后用醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色，最后置于Hitachi日立H-7600透射电子显微镜中，拍照保存。
图2为亲本菌株C55138和突变菌株Δpgm的形态观察结果；其中，a为亲本菌株C55138，b为突变菌株Δpgm。荚膜多糖为马链球菌兽疫亚种的重要组成部分，pgm基因缺失后，会导致荚膜多糖的分泌减少。通过透射电子显微镜观察突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138的荚膜形态可知，突变菌株Δpgm的荚膜多糖对比亲本菌株C55138荚膜多糖明显减少。
5、生长曲线
通过稀释平板菌落计数法连续测量10h内突变菌株的细菌生长情况，并绘制生长曲线。
图3为亲本菌株C55138和突变菌株Δpgm的生长曲线。对比突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138测定时间内的生长情况，发现突变菌株Δpgm在生长的迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期的生长速率与亲本菌株C55138的生长速率没有明显的差异，表明pgm基因缺失后，并不会影响菌株的生长繁殖。
6、毒力试验
挑取突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138单菌落接种于TSB培养基(含有5％新生牛血清)中，震荡培养至对数生长中期，经细菌涂板计数后，以1×105CFU细菌量混悬于PBS后腹腔接种于6～8周龄的BALB/c小鼠体内，设置PBS组作为对照组，每组10只小鼠，连续观察12天并做好记录。
图4为突变菌株Δpgm和C55138菌株感染BALB/C小鼠存活曲线结果，持续观察12天后，C55138组小鼠在攻毒后第4天出现死亡，第6天死亡率达到70％，而Δpgm组小鼠在12天内未出现死亡。从结果分析，Δpgm组小鼠的存活率明显高于C55138组小鼠的存活率，表明pgm基因缺失后，菌株的毒力下降。
7、小鼠感染模型的构建
挑取突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138单菌落接种于TSB培养基(含有5％新生牛血清)中震荡培养至对数生长中期，经涂板计数后，调整细菌量为1×105CFU，混悬于PBS中。分别取菌液腹腔接种于6～8周龄的小鼠体内，以PBS组为空白组，小鼠持续感染24h。
8、小鼠血清中细胞因子的检测
通过构建的Caspase-1+/+小鼠感染模型，对小鼠进行断尾采血，离心并分离血清，将血清分装后置于-20℃保存。使用ELISA试剂盒对血清样品的细胞因子水平进行测定，操作步骤按照说明书进行。随后使用酶标仪进行检测分析，检测波长为450nm。
图5为在Caspase-1+/+小鼠体内，感染C55138菌株的血清内IL-18细胞因子的分泌水平显著高于PBS感染组小鼠IL-18分泌水平(P＜0.001)；而感染了突变菌株Δpgm的小鼠血清内IL-18的分泌水平与PBS感染组小鼠IL-18分泌水平相比差异不显著，但突变菌株Δpgm感染组IL-18分泌水平显著低于C55138感染组IL-18分泌水平(P＜0.001)。结果表明，pgm基因缺失后，突变菌株感染小鼠显著性降低小鼠血清中IL-18的分泌量。
9、脾脏Caspase-1、IL-18蛋白表达量检测
小鼠感染细菌后，脱颈处死小鼠并提取脾脏组织。取0.1g小鼠脾脏组织置于研磨管内，充分研磨后加入适量组织裂解液(RIPA含1％Protease Inhibitor Cocktail与1％PMSF)，冰上放置3-5min，加入终浓度为1×的上样缓冲液，混匀后于100℃沸水中加热10min，样品分装并置于-20℃冰箱保存。
将处理后的蛋白样品通过12％SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，随后进行转膜，室温下封闭1h，洗膜，4℃条件下过夜孵育一抗，洗膜，室温下孵育二抗1h，洗膜，显影，曝光成像，最后拍照记录并保存数据。
图6为突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138感染Caspase-1+/+小鼠后的Caspase-1、IL-18蛋白表达水平。比较发现C55138组的Caspase-1蛋白水平明显低于Δpgm组的Caspase-1蛋白水平(P＜0.001)，而C55138组的IL-18蛋白水平高于Δpgm组的IL-18蛋白水平(P＜0.001)。该结果表明突变菌株Δpgm感染小鼠后能够激活Caspase-1。
10、Caspase-1-/-小鼠感染模型的细胞因子检测
图7为Caspase-1-/-小鼠分别感染突变菌株Δpgm和C55138菌株后IL-18的分泌水平情况，尽管两组实验组小鼠血清内的IL-18水平高于PBS组血清IL-18水平，但Δpgm感染组和C55138感染组之间的IL-18分泌水平差异不显著，与上述两种菌株感染Caspase-1+/+小鼠血清中的IL-18因子水平形成明显对比。综合分析ELISA数据，在小鼠Caspase-1存在的前提下，突变菌株Δpgm感染小鼠后将引起体内IL-18的分泌水平降低。结果表明突变菌株Δpgm感染小鼠依赖于Caspase-1降低IL-18分泌水平。
11、Caspase-1+/+小鼠和Caspase-1+/+小鼠致病力试验
挑取突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138单菌落接种于TSB培养基(含有5％新生牛血清)中震荡培养至对数生长中期，菌液经涂板计数后，调整细菌量为1×105CFU，混悬于PBS中。分别将突变菌株Δpgm和亲本菌株C55138菌液接种于6～8周龄的Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠腹腔内，设置PBS组作为对照组，每组10只小鼠，连续观察12天，并记录小鼠死亡情况。
图8为C55138、Δpgm菌株分别感染Caspase-1+/+、Caspase-1-/-小鼠后的存活率结果。结果显示，Caspase-1+/+小鼠感染C55138菌株后，在第4天出现死亡，第9天存活率只有10％；感染突变菌株Δpgm 12天后，存活率为50％，与亲本菌株感染组相比，小鼠存活率有所提高；而用突变菌株Δpgm和C55138菌株分别感染Caspase-1-/-小鼠时，12天内两组小鼠均死亡，存活率为0％(图8)。综上所述，小鼠Caspase-1的缺乏明显可以加剧感染小鼠的死亡，突变株Δpgm对小鼠的致病力减弱依赖于Caspase-1的激活。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 佛山科学技术学院
广东永顺生物制药股份有限公司
<120> 一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株及其制备方法和应用
<130> KHP211112144.7
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtcgactgt atctctggtg tca 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggatccgaa gtctgggtc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaggatccc tcttagacgt g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaattctac catatgcact cc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcataacctt cctgacaatc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggcagcca tctctaccac c 21

Claims (10)

1.一种马链球菌兽疫亚种基因缺失株，其特征在于，所述基因缺失株为：pgm基因缺失的马链球菌兽疫亚种菌株。
2.根据权利要求1所述的基因缺失株，其特征在于，所述马链球菌兽疫亚种基因缺失株的亲本株为马链球菌兽疫亚种C55138。
3.根据权利要求1或2所述的基因缺失株，其特征在于，所述pgm基因缺失为pgm基因第808～1325位的核苷酸序列缺失。
4.权利要求1-3任一项所述的基因缺失株的制备方法，其特征在于，包括：
通过同源重组敲除所述马链球菌兽疫亚种菌株的pgm基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组包括：
构建含有pgm上游同源臂和下游同源臂的重组质粒，将所述重组质粒导入马链球菌兽疫亚种感受态细胞中。
6.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1-3任一项所述基因缺失株和佐剂。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为MontanideTMGEL 01佐剂。
8.权利要求1-3任一项所述基因缺失株在制备用于免疫马链球菌兽疫亚种引起的疾病的药物中的应用。
9.权利要求1-3任一项所述基因缺失株在降低IL-18分泌水平中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述基因缺失株在提高Caspase-1水平中的应用。
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