CN107427569A - 链球菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及光子照射的链球菌疫苗制品和其使用方法。

Description

链球菌疫苗
通过交叉引用的并入
本申请要求2015年3月26日提交的题目为“链球菌疫苗”的澳大利亚临时专利申请号2015901098的优选权，其全部内容通过交叉引用并入本文。
技术领域
一般而言，本发明涉及疫苗领域。更具体地，本发明涉及链球菌疫苗制品及其使用方法。
背景技术
链球菌是属于链球菌科的球形细菌属。存在许多不同物种的链球菌，其中的一些在人和动物中引起疾病。其它链球菌在制造多种发酵产品中是重要的。
基于它们的溶血性质(α-和β-溶血性)，个体链球菌物种被分类为两个主要的群。α-溶血性链球菌包括肺炎链球菌和草绿色链球菌。β-溶血性群由A群和B群链球菌组成。B群链球菌通常栖息于消化系统和女性的阴道而没有不利影响。大部分人快速地发展出对B群链球菌的自然免疫，但是它们可以在新生儿中引起更严重类型的感染。A群链球菌一般栖息于咽喉和皮肤表面，并且是成人和儿童中感染的常见原因。虽然大部分A群感染不经常给健康造成严重威胁(例如咽喉感染、蜂窝组织炎、脓疱病、鼻窦炎、中耳感染)，但是A群链球菌可以通过更深地穿透入身体的组织和器官来建立更严重的侵袭性感染(例如肺炎、脓毒症、脑膜炎、坏死性筋膜炎)并且可以引发严重的后遗症，包括急性链球菌感染后肾小球肾炎和急性风湿热。
此外，肠球菌性(粪便)链球菌物种以显著的数目在肠中出现并且可以引起心内膜炎和尿路感染。
肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)是在人和动物群体中导致显著的发病率和死亡率的重要的人病原体。它引起严重的病症，包括肺炎、脑膜炎、鼻窦炎和中耳炎。全球每年估计1,600,000人死于侵袭性肺炎球菌疾病，并且那些中的大约一百万是儿童。存在基于荚膜化学结构和免疫原性可区分的许多不同血清型的肺炎链球菌(>90)。荚膜多糖被认为是肺炎链球菌的必需的毒力因子，这是由于在为非侵袭性肺炎球菌疾病原因的肺炎链球菌之中实际上不存在无被囊(non-encapsulated)的菌株。荚膜多糖因而在当前的肺炎球菌疫苗中被用作疫苗抗原。
当前的肺炎球菌缀合疫苗仅覆盖选择的血清型组，(例如PCV7(7种血清型)、PCV10(10种血清型)和PCV13(13种血清型))。在许多群体中，引入靶向血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的PCV7疫苗显著地减小肺炎球菌疾病的负担。然而，尽管通过靶向的疫苗血清型引起它们针对疾病的功效，血清型替换通常减小接种的净效果。例如，在包括美国、英格兰、德国、威尔士和荷兰的大量地方中，血清型19A被报道是在PCV7引入后一般出现的非疫苗血清型。非疫苗血清型在实施肺炎球菌缀合疫苗之后的出现因而出现问题。
考虑与肺炎球菌缀合疫苗相关联的非疫苗血清型的出现，对能够针对较大范围的血清型诱发免疫力的新型链球菌疫苗存在需要。
上呼吸道的定居在肺炎球菌疾病的发病机理中是必需的第一步，并且因此认为是侵袭性肺炎球菌疾病的最重要的危险因子。它还为群落中肺炎球菌的水平扩散提供了基础，使得它成为预防措施的重要靶标。
因此，对如下疫苗存在需要：其能够针对大范围的肺炎球菌血清型诱发免疫力并且其适合于上呼吸道施用。
发明内容
本发明涉及改进的链球菌疫苗，其减少或减轻目前的链球菌疫苗的至少一种缺陷。
因此，本发明涉及至少下列实施方式：
实施方式1.用于预防或治疗对象中链球菌细菌的感染的方法，该方法包括给对象施用治疗有效量的光子照射的链球菌细菌以从而预防或治疗感染。
实施方式2.根据实施方式1的方法，其中该方法预防或治疗多种不同的链球菌物种和/或血清型的感染。
实施方式3.根据实施方式2的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括不同的：链球菌物种、链球菌血清型、和/或链球菌衍生物。
实施方式4.根据实施方式1至3中任一项的方法，其中链球菌感染包括肺炎链球菌的一种或多种血清型的感染。
实施方式5.根据实施方式1至4中任一项的方法，其中链球菌细菌的感染是呼吸道感染、肺炎、耳部感染、耳痛、中耳感染、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、结膜炎、菌血症(bacteraemia)、败血症、关节感染、骨感染、脓毒性关节炎、脓毒症、骨髓炎、软组织感染、蜂窝组织炎、肌炎、眶周蜂窝组织炎、脓肿、坏死性筋膜炎、脓疱病、腹膜炎、心脏感染、心内膜炎和/或心包炎中的任一种或多种。
实施方式6.针对对象中的链球菌细菌诱发免疫反应的方法，该方法包括给对象施用治疗有效量的光子照射的链球菌细菌以从而诱发免疫反应。
实施方式7.根据实施方式6的方法，其中免疫反应包括针对施用给对象的不同的链球菌物种和/或血清型的异型免疫反应。
实施方式8.根据实施方式6或实施方式7的方法，其中治疗有效量的光子照射的链球菌细菌包括不同的：链球菌物种、链球菌血清型、和/或链球菌衍生物。
实施方式9.根据实施方式7或实施方式8的方法，其中不同的链球菌物种和/或血清型是肺炎链球菌血清型。
实施方式10.根据实施方式6至9中任一项的方法，其中免疫反应包括如下的任一种或多种：
(i)B-淋巴细胞反应；
(ii)至少部分地通过来自光子照射的链球菌细菌的双链RNA与Toll样受体的相互作用诱发的先天免疫反应；
(iii)T-淋巴细胞反应。
实施方式11.根据实施方式1至10中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括至少一种肺炎链球菌血清型，或肺炎链球菌血清型的至少一种未被囊的衍生物。
实施方式12.根据实施方式1至11中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括突变体链球菌细菌，其包括：
(i)一种或多种缺陷DNA修复蛋白；和/或
(ii)引起缺陷DNA修复能力的遗传改变。
实施方式13.根据实施方式12的方法，其中光子照射的突变体链球菌细菌包括编码DNA修复蛋白的至少一种基因的缺陷。
实施方式14.根据实施方式13的方法，其中光子照射的突变体链球菌细菌是肺炎链球菌突变体，其包括选自编码DNA烷基化修复蛋白的基因、编码DNA聚合酶4的基因、hexA、hexB、mutS、radC、recA、recF、recN、recO、uvrA、uvrB、uvrC或uvrD的一种或多种基因的缺陷。
实施方式15.根据实施方式12至14中任一项的方法，其中缺陷DNA修复蛋白在光子照射的突变体链球菌细菌中是突变的、截短的或不存在。
实施方式16.根据实施方式12至15中任一项的方法，其中光子照射的突变体链球菌细菌包括链球菌Rx1菌株衍生物，其中：
(i)自溶素、溶血素、肺炎球菌溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种是缺陷的；和/或
(ii)不存在自溶素、溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种。
实施方式17.根据实施方式16的方法，其中光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷自溶素蛋白的基因、编码缺陷溶血素的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和/或编码缺陷PsaA蛋白的基因中的任一种或多种；或
(ii)是衍生物，其中不存在编码自溶素的基因、编码溶血素的基因、和/或编码PsaA蛋白的基因中的任一种或多种。
实施方式18.根据实施方式16或实施方式17的方法，其中自溶素是LytA。
实施方式19.根据实施方式16至18中任一项的方法，其中光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因，和编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因；或
(ii)不包含lytA基因，并且包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因。
实施方式20.根据实施方式12至19中任一项的方法，其中与对应的非突变体链球菌细菌需要的相比，光子照射的突变体链球菌细菌需要减小剂量的光子照射用于灭活。
实施方式21.根据实施方式1至20中任一项的方法，其中一些或所有光子照射的链球菌细菌包括修饰的链球菌细菌，其包括编码RNA转录物的DNA序列，其中RNA转录物包括能够在转录后形成双链部分的自互补性区域。
实施方式22.根据实施方式21的方法，其中双链RNA转录物的部分的长度是至少：10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个碱基对。
实施方式23.根据实施方式21或实施方式22的方法，其中双链RNA转录物引发对象中的先天免疫反应，其包括Toll样受体活化。
实施方式24.根据实施方式23的方法，其中Toll样受体是Toll样受体-3(TLR-3)。
实施方式25.根据实施方式1至24中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括营养突变体链球菌细菌。
实施方式26.根据实施方式1至24中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括编码抗原或其组分的至少一种重组DNA部分，所述抗原或其组分：
(i)灭活或减毒细菌；和/或
(ii)诱发或增强对象中的免疫反应。
实施方式27.根据实施方式26的方法，其中重组DNA部分替换或破坏病原性、感染、增殖、体内生长、或其任意组合必需的内源基因。
实施方式28.根据实施方式1至27中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括全杀死的(whole killed)链球菌细菌。
实施方式29.根据实施方式1至28中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌被粘膜或鼻内施用至对象。
实施方式30.根据实施方式1至29中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌联合佐剂被施用至对象。
实施方式31.根据实施方式1至30中任一项的方法，其中一个、两个或三个单独剂量的光子照射的链球菌细菌被施用至对象。
实施方式32.根据实施方式1至31中任一项的方法，其中对象是人。
实施方式33.根据实施方式1至32中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌被施用至少：8千戈瑞(kGy)、9kGy、10kGy、11kGy、12kGy、15kGy、20kGy、25kGy、30kGy、40kGy或50kGy的总剂量的光子照射。
实施方式34.根据实施方式1至33中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的链球菌细菌、X-照射的链球菌细菌或其组合。
实施方式35.根据实施方式1至33中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括X-照射的链球菌细菌。
实施方式36.根据实施方式1至33中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的链球菌细菌和X-照射的链球菌细菌的组合。
实施方式37.根据实施方式20或实施方式33的方法，其中光子照射是γ-照射。
实施方式38.根据实施方式20或实施方式33的方法，其中光子照射是X-照射.
实施方式39.根据实施方式20或实施方式33的方法，其中光子照射是γ-照射和X-照射的组合。
实施方式40.根据实施方式1至39中任一项的方法，其中光子照射的链球菌细菌包括如下链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和编码缺陷PsaA蛋白的基因；
(ii)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因；
(iii)包括编码缺陷PsaA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码LytA蛋白的基因；或
(iv)包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，其中不存在编码LytA蛋白的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因。
实施方式41.疫苗组合物，其包括光子照射的链球菌细菌和药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体，其中：
(i)光子照射的链球菌细菌包括包含一种或多种缺陷DNA修复蛋白的突变体链球菌细菌，和/或其中不存在至少一种类型的DNA修复蛋白的突变体链球菌细菌；和/或
(ii)光子照射的链球菌细菌包括修饰的链球菌细菌，其包括编码RNA转录物的DNA序列，其中RNA转录物包括能够在转录后形成双链部分的自互补性区域。
实施方式42.根据实施方式41的疫苗组合物，其中突变体链球菌细菌是肺炎链球菌突变体，其包括选自编码DNA烷基化修复蛋白的基因、编码DNA聚合酶4的基因、hexA、hexB、mutS、radC、recA、recF、recN、recO、uvrA、uvrB、uvrC或uvrD的一种或多种基因的缺陷。
实施方式43.根据实施方式41或实施方式42的疫苗组合物，其中修饰的链球菌细菌是修饰的肺炎链球菌细菌并且双链RNA转录物的部分的长度是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个碱基对。
实施方式44.根据实施方式41至43中任一项的疫苗组合物，其中光子照射的链球菌细菌包括编码抗原或其组分的至少一种重组DNA部分，所述抗原或其组分：
(i)灭活或减毒细菌；或
(ii)诱发或增强对象中的免疫反应。
实施方式45.根据实施方式44的疫苗组合物，其中重组DNA部分替换或破坏病原性、感染、繁殖或其任意组合必需的内源基因。
实施方式46.根据实施方式41至45中任一项的疫苗，其中光子照射的链球菌细菌包括链球菌Rx1菌株衍生菌株，其中：
(i)自溶素、溶血素、肺炎球菌溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种是缺陷的；和/或
(ii)不存在自溶素、溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种。
实施方式47.根据实施方式46的疫苗，其中光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷自溶素蛋白的基因、编码缺陷溶血素的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和/或编码缺陷PsaA蛋白的基因中的任一种或多种；或
(ii)是衍生物，其中不存在编码自溶素的基因、编码溶血素的基因、和/或编码PsaA蛋白的基因中的任一种或多种。
实施方式48.根据实施方式41至47中任一项的疫苗，其中光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因，和编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因；或
(ii)不包含lytA基因，并且包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因。
实施方式49.根据实施方式41至48中任一项的疫苗，其中光子照射的突变体链球菌细菌包括如下链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和编码缺陷PsaA蛋白的基因；
(ii)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因；
(iii)包括编码缺陷PsaA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码LytA蛋白的基因；或
(iv)包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，其中不存在编码LytA蛋白的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因。
实施方式50.根据实施方式41至49中任一项的疫苗组合物，其中光子照射的链球菌细菌包括全减毒的或全杀死的链球菌细菌。
实施方式51.根据实施方式41至50中任一项的疫苗组合物，进一步包括佐剂。
实施方式52.根据实施方式41至51中任一项的疫苗组合物，其中疫苗组合物被配制用于粘膜或鼻内施用或被配制用于肌肉内、皮下或皮内注射。
实施方式53.根据实施方式41至52中任一项的疫苗组合物，其中光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的突变体链球菌细菌和/或γ-照射的修饰的链球菌细菌。
实施方式54.根据实施方式41至52中任一项的疫苗组合物，其中光子照射的链球菌细菌包括X-照射的突变体链球菌细菌和/或X-照射的修饰的链球菌细菌。
实施方式55.根据实施方式41至52中任一项的疫苗组合物，其中光子照射的链球菌细菌包括：
(i)γ-照射的和X-照射的突变体链球菌细菌的组合；和/或
(ii)γ-照射的和X-照射的修饰的链球菌细菌的组合。
实施方式56.用于制备根据实施方式41至55中任一项的疫苗组合物的方法，该方法包括：
(i)光子照射链球菌细菌的制品以从而减毒或杀死细菌；和
(ii)将光子照射的链球菌细菌与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合。
实施方式57.根据实施方式56的方法，其中所述光子照射链球菌细菌的制品包括将细菌暴露于γ-辐射。
实施方式58.根据实施方式56的方法，其中所述光子照射链球菌细菌的制品包括将细菌暴露于X-辐射。
实施方式59.根据实施方式56的方法，其中所述光子照射链球菌细菌的制品包括将细菌暴露于γ-辐射和X-辐射。
实施方式60.通过实施方式56至59中任一项的方法制备的疫苗组合物。
实施方式61.实施方式41至55或60中任一项的疫苗组合物，其用于预防或治疗链球菌细菌的感染。
实施方式62.光子照射的链球菌细菌在制备用于预防或治疗链球菌细菌的感染的药物中的用途，其中药物是根据实施方式41至55或60中任一项的疫苗组合物。
实施方式63.根据实施方式61的疫苗组合物或根据实施方式62的用途，其中链球菌细菌的感染是呼吸道感染、肺炎、耳部感染、耳痛、中耳感染、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、结膜炎、菌血症、败血症、关节感染、骨感染、脓毒性关节炎、骨髓炎、软组织感染、蜂窝组织炎、肌炎、眶周蜂窝组织炎、脓肿、腹膜炎、心脏感染、心内膜炎和心包炎中的任一种或多种。
附图说明
现在将仅借助非限制性实例，参考附图描述本发明的优选实施方式，其中：
图1显示了使用抗-LytA和抗-PdT抗血清检测肺炎链球菌D39和多种衍生物中的PdT和LytA的蛋白质印迹分析的结果。这确认成功地缺失lytA基因和ply置换为编码PdT的突变基因，其导致生成lytA无效突变体(自溶素-缺陷的)、肺炎球菌溶血素突变体衍生物(PdT)Rx1菌株，称为肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)。泳道：1.纯化的Ply和LytA(每个5ng)作为对照；2.肺炎链球菌D39；3.肺炎链球菌Rx1；4.Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗菌株(照射前)。由于存在His6-标签，重组纯化的Ply和LytA蛋白的大小更大；
图2显示了溶血试验的结果，进行所述溶血试验以确认在衍生物Rx1菌株肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——其携带PdT突变体形式的肺炎球菌溶血素——中缺乏溶血活性；
图3显示了由ΔlytA基因编码的mRNA转录物的预测的二级结构；
图4提供了图表，其描绘了在冰(图4A)或干冰(图4B)上暴露于多种剂量的γ-照射之后的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)生存能力；
图5提供了革兰氏染色的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的图像，其指示γ-照射对物理形态的影响。DI：干冰；KGY：千戈瑞；
图6提供了肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的扫描电子显微图像，其指示γ-照射对物理形态的影响；
图7是图表，其显示了小鼠——其接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——针对使用活的肺炎链球菌菌株D39(血清型2)的鼻内攻击的(A)中数生存时间和(B)存活百分数。*P＝<0.05；γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图8提供了一系列图表，其指示了小鼠——其接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——针对使用EF3030(血清型19F)(图8A&图8B)或P9(血清型6A)(图8C)的异型攻击的免疫力。在攻击之后96小时测定肺(图8A)和鼻咽(图8B)中的EF3030细菌计数。图8C显示了小鼠在使用P9攻击之后21天的存活时间。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图9提供了一系列图表，其显示了测量小鼠——其鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——中的肺炎链球菌-特异性抗体反应的ELISA的结果。个体图表显示了对抗原Ply、CbpA、GlpO和NanA的血清中的特异性IgG反应；以及对PspA和对未照射的全Rx1(ΔLytA,PdT)细菌细胞的IgG和IgA抗体反应。小鼠接种有γ-PN(γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT))或未接种(PBS对照)；
图10提供了一系列图表，其显示了测量小鼠——其腹腔内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——中的肺炎链球菌-特异性抗体反应的ELISA的结果。个体图表显示了针对肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)细胞(WC)(图10A)的全细胞裂解物以及纯化的抗原Ply(图10B)和CbpA(图10C)的血清中的特异性IgG滴度。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图11提供了显示野生型C57/BL6和B-细胞缺陷C57/BL6(μMT)小鼠——其鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)并且使用致死剂量的肺炎链球菌菌株D39攻击——的存活百分数的图表。**P＝<0.01；γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图12显示了对来自培养的脾细胞的上清液实施的细胞因子分析的结果，所述培养的脾细胞源自鼻内接种有肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠。指示了在使用肺炎链球菌抗原MalX、ConA、或全γ-照射的Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗的刺激之后，来自脾细胞的上清液中的白介素-17A(IL-17A)(图12A)和干扰素-γ(IFN-γ)水平(图12B)。图12C和12D显示了在存在MalX或疫苗的情况下，对培养的脾细胞进行的细胞内细胞因子染色的结果，以测量在刺激72h后诱发的Th1细胞(使用IFN-γ+)、Th2细胞(IL-4+)、Th17细胞(IL-17+)和T-reg细胞(Foxp3+)的比例。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图13显示了在A/PR8攻击之前三周(i)给予PBS作为对照的小鼠(图13A)和(ii)鼻内接种肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠(图13B)在使用流感病毒菌株A/PR8的攻击之后体重的百分数变化。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图14显示了小鼠——其已经鼻内接种有仅霍乱毒素(CT)(对照)或肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)加霍乱毒素——在使用肺炎链球菌菌株EF3030(血清型19F)攻击后在肺(图14A)和鼻咽(图14B)中的细菌计数。图14C和图14D显示了分别使用肺炎链球菌菌株D39(血清型2)或肺炎链球菌菌株P9(血清型6A)攻击的小鼠——其已经鼻内接种有仅CT(对照)或肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)加CT——的存活时间。*p＝<0.05；**p＝<0.01；γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图15显示了细胞内细胞因子染色的结果，进行该细胞因子染色以测量在使用γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗或MalX抗原——其来自鼻内接种有仅霍乱毒素(CT)(对照)或肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)加CT的小鼠(图15A和图15B)——刺激脾细胞72h后诱发的Th1细胞(使用IFN-γ+)、Th2细胞(IL-4+)、Th17细胞(IL-17+)和T-reg细胞(Foxp3+)的比例。还对来自培养的脾细胞的上清液实施细胞因子分析。指示了在使用MalX或γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗刺激之后，来自脾细胞的上清液中的白介素-17A(IL-17A)和干扰素-γ(IFN-γ)水平(图15C)。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图16显示了在存在或不存在霍乱毒素佐剂的情况下，测量在来自小鼠——其鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)——的血清中对未照射的全Rx1(ΔLytA,PdT)细菌细胞的肺炎链球菌-特异性抗体反应的ELISA的结果。γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图17提供了显示野生型C57/BL6小鼠——其鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)并且使用致死剂量的肺炎链球菌菌株D39攻击——的存活百分数的图表。小鼠在攻击前24h、攻击之后6h和攻击之后48h注射有IFN-γ或IL-17的中和抗体，或相关的同种型对照抗体。*P＝<0.05，**P＝<0.01；γ-PN＝γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)；
图18显示了与未接种的小鼠比较，在接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠中，在使用肺炎链球菌D39活体攻击(live challenge)后24和48小时诱发的肺中T效应细胞(Th1和Th17)、γδT细胞(γδT1和γδT17)和吞噬细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的总数目；
图19显示了菌株D39、Rx1、Rx1(ΔLytA,PdT)和Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)的PCR和蛋白质印迹分析的结果。还显示了Rx1、Rx1(ΔLytA,PdT)和Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)的生长。对于PCR，扩增ply、lytA和psaA基因的遗传基因座(图19A)。对于蛋白质印迹，使用针对Ply、LytA和PsaA的抗血清(图19B)。为了生长，细菌以0.05的A600接种入SILAC RPMI1640Flex Media(补充有葡萄糖)并且在5％CO2中在37℃下静态培养(图19C)。这确认了psaA基因从Rx1(ΔLytA,PdT)成功地缺失以生成Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)并且证明Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)菌株在未补充有Mn2+的培养基中的生长缺陷；
图20显示了由ΔpsaA基因编码的mRNA转录物的预测的二级结构；和
图21提供了图表，其描绘了在干冰(图21A)上暴露于多种剂量的γ-照射之后肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的生存能力。显示了肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)——其从没有被照射(图21B)或已经在25kGy下被照射(图21C)——的物理形态的扫描电子显微图像。
定义
如本申请中使用的，除非上下文另外明确地规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，短语“蛋白质”还包括多个蛋白质。
如本文使用的，术语“包括”意思是“包含”。词语“包括”的变型，比如“包含”和“含有”具有对应变化的含义。因而，例如，“包括”γ-照射的链球菌菌株A的疫苗可以排他地由γ-照射的链球菌菌株A构成或可以包括一种或多种额外的组分(例如γ-照射的链球菌菌株B)。
如本文使用的术语“多种(plurality)”意思是多于一种。在某些具体方面或实施方式中，多种可以意思是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多，和其中可导出的任何整数，和其中可导出的任何范围。
如本文使用的术语“治疗有效量”在其含义内包括无毒的但是足够量的药剂或组合物用于本发明以提供期望的治疗效果。需要的精确量将取决于因素比如正在治疗的物种、对象的年龄与一般状况、正在治疗的病症的严重度、正在施用的具体药剂、施用模式等在对象之间变化。因而，不可能规定适用于所有实施方式的精确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域技术人员可以仅使用常规实验确定适当的“有效量”。
如本文使用的术语“光子辐射”将被理解为涵盖γ-辐射(即γ-射线)和X-辐射(即X-射线)二者。因此，“光子照射的”材料可以是已经暴露于γ-辐射并且其已经因此成为“γ-照射的”的材料，已经暴露于X-辐射并且其已经因此成为“X-照射的”的材料，或二者。仅借助非限制性实例，为了成为光子照射的，材料可以经受至少0.01MeV、至少0.1MeV、至少0.5MeV、0.01MeV和0.5MeV之间、0.01MeV和1MeV之间、0.01MeV和10MeV之间、0.5MeV和20MeV之间、0.5MeV和15MeV之间、0.5MeV和10MeV之间、0.5MeV和5MeV之间、0.5MeV和2MeV之间、或1MeV和2MeV之间(例如1.25MeV)的能量下的光子辐射。
如本文使用的，术语“减毒的(attenuated)”在细菌的上下文中将被理解为意思是该细菌能够在其施用的宿主中建立仅非致病感染，持续足以诱发宿主中的免疫反应的时期。然而，该细菌不能建立长期感染或建立对施用减毒细菌的非免疫抑制(non-immunocompromised)的宿主有害的致病感染。
如本文使用的术语“诱发(induce，inducing)”、和“增强(enhance，enhancing)”在免疫力或免疫反应的上下文中指的是免疫力或免疫反应的增加，其高于可能不存在或可测量的现有水平。
如本文使用的，术语“对象”包括具有经济、社会或研究意义的任何动物，其包括牛、马、羊、灵长类、鸟和啮齿动物物种。因此，“对象”可以是哺乳动物，比如，例如，人或非人哺乳动物(例如猪、猫、狗、奶牛、马、或绵羊)。还包括在此术语范围内的是实验室动物(例如啮齿动物、兔等)、鸟(例如家禽)、鱼和甲壳动物。
如本文使用的术语“预防(prevent、prevention和preventing)”在给定的感染和/或由感染引起的疾病或病症的上下文中将被理解为意思是对象在暴露于引起感染、疾病或病症的致病生物体之后具有减小的发展出感染和/或疾病或病症的倾向。减小的发展出感染和/或疾病或病症的倾向将被理解为包括减弱的倾向和缺乏任何倾向二者。
如本文使用的术语“治疗(treat和treating)”在给定的感染和/或由感染引起的疾病或病症的上下文中将被理解为涵盖减少感染对象的致病生物体的数目和/或减少任何感染的症状和/或由感染引起的疾病或病症的症状。
将理解关于叙述的数值在本文使用术语“大约”包括叙述的数值和叙述的值加或减百分之十内的数值。
将理解当提及数值的范围时在本文使用术语“之间”涵盖范围的每个端点处的数值。例如，长度为10个残基和20个残基之间的多肽包括长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。
本文对现有技术文件的任何描述，或衍生自或基于那些文件在本文的陈述，不是承认该文件或衍生的陈述是相关领域的公知常识的一部分。
出于描述的目的，除非另外陈述，本文引用的所有文件由此通过引用以其全部并入。
具体实施方式
下列具体实施方式以足以使本领域普通技术人员实践本发明的详细程度传达了本发明的示例性实施方式。描述的多种实施方式的特征或限制不必然限制本发明的其它实施方式或作为整体的本发明。因此，下列具体实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求所限定。
当前使用的针对链球菌感染的疫苗通常是多糖疫苗，其包含来自多种血清型的纯化的荚膜多糖(最近的PCV23疫苗包含来自23种血清型的多糖)；或缀合疫苗，其包含缀合至白喉类毒素或非链球菌起源的其它蛋白抗原的荚膜多糖。血清型替换是与多糖疫苗相关联的重大问题，并且缀合疫苗仅针对由多糖疫苗覆盖的血清型亚组诱发免疫力。例如，存在超过90种识别的肺炎链球菌的血清型并且大部分已经显示引起疾病。由当前可获得的链球菌疫苗诱发的免疫力因而不足以针对某些致病物种内的大多数链球菌物种和/或血清型建立广泛的免疫力。与病毒相比，产生安全的减毒的活细菌疫苗是困难的。比较而言，细菌具有远远更大数目的基因并且它因而更难以阻止突变体/减毒的细菌在施用给疫苗接受者后逆转回致病形式。活细菌疫苗也不适于施用给免疫抑制的个体比如经历用于恶性肿瘤的化疗的那些个体、HIV患者、和青年或老年对象。这些个体实际上阻止接受任何形式的减毒的活链球菌疫苗，尽管其更易感于多种形式的链球菌感染。
本发明提供了能够针对不同的链球菌物种和/或不同的链球菌血清型诱发异型免疫力的疫苗(在本文也称为“本发明的疫苗”)。疫苗包含杀死的链球菌细菌，因而减轻由减毒的活疫苗引起的潜在问题。疫苗还能够针对大范围的链球菌物种和/或血清型诱发免疫力，因而减小血清型替换的潜在影响。
本文还提供了用于制造本发明的疫苗的方法，以及包括该疫苗的药物和药物组合物。
本发明还涉及预防或治疗对象中的链球菌感染的方法。该方法包含给对象施用本发明的疫苗。该疫苗可以出于预防性或治疗性目的被施用。该方法可以针对多种不同的链球菌物种和/或亚型诱发对象中的异型免疫力。
虽然不需要限制，本发明的疫苗优选地配制用于粘膜表面和经由粘膜表面被施用。例如，疫苗可以被鼻内施用，其在某些实施方式中取决于具体的目标疾病或病症可以刺激更有效的免疫反应。
链球菌疫苗制品
-链球菌菌株
本发明的疫苗基于通过暴露于γ-照射被减毒或杀死的减毒的或全杀死的链球菌细菌和其衍生物。链球菌细菌可以是能够在宿主生物体中建立有害感染的致病细菌。本发明的疫苗可以包括通过暴露于光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)被减毒或杀死的不同的链球菌细菌的组合，其包括例如不同的链球菌物种的组合，和/或相同链球菌物种内不同的链球菌血清型的组合。
例如，链球菌细菌可以是α-、β-或γ-溶血性链球菌，如根据良好表征的溶血性质或在γ-溶血性链球菌细菌的情况下缺乏溶血性质分类的。
合适的α-溶血性链球菌细菌的非限制性实例包括肺炎链球菌和草绿色链球菌(例如突变链球菌、血链球菌(S.sanguinis)、轻型链球菌、口腔链球菌(S.oralis)、表兄链球菌(S.sobrinus)、米勒链球菌)。还在本发明范围内的是这些链球菌物种的个体血清型。
合适的β-溶血性链球菌细菌的非限制性实例包括基于细胞壁细菌抗原(多糖)的碳水化合物组成在蓝氏分群(A-H、L、N和R/S群)下分类的那些。例如，β-溶血性细菌可以包括酿脓链球菌(A群)、无乳链球菌(B群)、似马链球菌(C群)、马链球菌(C群)、兽疫链球菌(C群)、停乳链球菌(C群)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(D群)、牛链球菌(D群)、米勒链球菌(E群)、突变链球菌(E群)、咽峡炎链球菌(F群)、犬链球菌(G群)、停乳链球菌(G群)、血链球菌(S.sanguis)(H群)、停乳链球菌(L群)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(N群)、和猪链球菌(S.suis)(R/S群)中的任一种或多种。还在本发明范围内的是这些链球菌物种的个体血清型。
在一些实施方式中，本发明的疫苗包括肺炎链球菌的一种或多种血清型。因此，疫苗可以包括肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F和/或48中的任一种或多种。
在一些实施方式中，疫苗包括肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一种或多种。
-链球菌衍生物
本发明的疫苗可以包括光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)链球菌衍生物。链球菌衍生物可以是由人工遗传操纵引起的重组体形式链球菌细菌，或天然存在的突变体形式的链球菌细菌。在没有任何具体限定的情况下，链球菌衍生物可以包括减小病原性的一种或多种遗传修饰。
仅借助非限制性实例，链球菌衍生物可以包括破坏或去除荚膜基因座(cps)的遗传改变。例如，肺炎链球菌cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和/或cpsE基因中的任一种或多种，或其它链球菌物种中的同源基因，可以被修饰，以便预防、破坏或修改荚膜产生(例如通过重组等)。可选地，链球菌衍生物可以在这些或其它基因中具有自发突变，其导致天然存在的无被囊的链球菌细菌。链球菌衍生物可以缺乏所有或至少一部分的荚膜基因座。在一些实施方式中，缺乏荚膜的链球菌衍生物是肺炎链球菌菌株Rx1或Rx1衍生物。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括减少或阻止其它靶蛋白的产生或活性的遗传改变。仅借助非限制性实例，遗传改变可以存在于：编码胆碱结合蛋白的一种或多种基因；编码自溶素的一种或多种基因(例如肺炎链球菌lytA、lytB、lytC或其它链球菌细菌中的同源基因)；赋予生长营养物/辅因子(例如金属离子)要求的一种或多种基因(例如肺炎链球菌psaA或其它链球菌细菌中的同源基因)；编码保护性抗原的一种或多种基因(例如肺炎链球菌pspA或其它链球菌细菌中的同源基因)；和/或编码毒力决定簇或调节子的一种或多种基因(例如肺炎链球菌codY、comC、comD、cps2A、csp4A、glpO、mgrA、nanA、nanB、pavA、pcpA、phtA、phtB、phtD、phtE、piuA、piaA、ply、prtA、psaA、psrP、rrgA、rrgB、spxB、和这些基因在其它链球菌细菌中的同系物)。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括导致具有减小的病原性和/或体内生长的营养缺陷型的遗传改变。仅借助非限制性实例，遗传改变可以存在于编码胸苷酸合酶的一种或多种基因中。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括来自如下的一种或多种(外源)基因：相同物种但是不同血清型的链球菌细菌；来自不同物种的链球菌细菌；非链球菌细菌；或人或非人哺乳动物(例如猪、猫、狗、奶牛、马、或绵羊)；实验室动物(例如啮齿动物或兔)；鸟；和/或重组链球菌细菌待施用的对象。在一些实施方式中，一种或多种外源基因破坏或以其它方式灭活一种或多种内源基因(例如就在上面段落中陈述的任一种或多种基因)。在其它实施方式中，一种或多种外源基因不破坏或灭活任何内源基因。仅借助非限制性实例，一种或多种外源基因编码诱发或增强施用链球菌衍生物的对象中的免疫反应的蛋白质。免疫反应可以是先天的、后天的或二者。在一些实施方式中，一种或多种外源基因编码免疫调谐子(例如细胞因子、趋化因子、抗体、融合蛋白、肽、蛋白质、和/或激素)。在其它实施方式中，一种或多种外源基因可以包括来自另一种不同的细菌家族的抗原(例如肺炎支原体抗原、流感嗜血杆菌抗原、肺炎衣原体抗原、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原、金黄色葡萄球菌抗原)、病毒抗原(例如腺病毒抗原、冠状病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、变性肺病毒(metapneumovirus)抗原、鼻病毒抗原、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncitial virus)抗原、HIV抗原、肝炎病毒抗原、疱疹病毒抗原、麻疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、乳头瘤病毒抗原、风疹病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原)、真菌/酵母抗原、蠕虫抗原、和/或原生动物抗原。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括引起细菌过表达一种或多种靶基因的遗传改变。在此背景下，“过表达”将被理解为意思是在相同的生物学条件下，与对应的链球菌细菌中不具有遗传修饰的相同基因的表达相比增加的表达水平。给定的靶基因的过表达可以，例如，针对链球菌菌株——其是施用的链球菌衍生物的亲代——和/或针对链球菌衍生物自身诱发或增强对象中的免疫反应。仅借助非限制性实例，遗传改变可以增加链球菌衍生物中编码能够激活补体系统的蛋白质的一种或多种基因(例如肺炎链球菌cbpA、pspA、ply或这些基因在其它链球菌细菌中的同系物)的产生。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括引起缺陷DNA修复能力的遗传改变。由于减毒或灭活需要的光子照射的剂量可以被减小同时疫苗功效和安全可以相反地增加，使用包括光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)链球菌衍生物——其具有降低的修复由光子照射引起的DNA损伤的能力——的疫苗可以是有利的。在一些实施方式中，链球菌衍生物包括破坏或灭活编码错配修复系统中的蛋白质的一种或多种基因(例如肺炎链球菌hex基因座或此基因座在其它链球菌细菌中的同系物)的表达的遗传改变。在其它实施方式中，链球菌衍生物包括破坏或灭活编码DNA烷基化修复蛋白的一种或多种基因(例如肺炎链球菌DNA聚合酶4、hexA、hexB、mutS、radC、recA、recF、recN、recO、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD或这些基因在其它链球菌细菌中的同系物)的表达的遗传改变。
额外地或可选地，链球菌衍生物可以包括促进双链RNA(dsRNA)的产生的遗传改变。dsRNA可以是mRNA或tRNA。非限制地，dsRNA的长度可以是多于10、多于15、多于20、多于25、多于30、多于35、多于40、多于45、多于50、多于55、多于65或多于70个碱基对的长度。额外地或可选地，dsRNA的长度可以是：大约10和大约70个碱基对(bp)之间；大约10和大约50个碱基对(bp)之间；大约10和大约30个碱基对(bp)之间；大约20和大约70个碱基对(bp)之间；大约20和大约60个碱基对(bp)之间；大约20和大约50个碱基对(bp)之间；大约20和大约40个碱基对(bp)之间；大约20和大约30个碱基对(bp)之间；大约30和大约70个碱基对(bp)之间；大约40和大约70个碱基对(bp)之间；大约50和大约70个碱基对(bp)之间；大约60和大约70个碱基对(bp)之间；大约30和大约60个碱基对(bp)之间；大约30和大约50个碱基对(bp)之间；或大约30和大约40个碱基对(bp)之间的长度。在一些实施方式中，dsRNA是另外为单链的较大的RNA分子的组分。较大的RNA分子可以包括多个dsRNA组分。dsRNA可以是较大的RNA分子内部组分或末端组分。在一些实施方式中，dsRNA可以包括终止茎-环序列。dsRNA可以源自较大的RNA分子内的自互补性区域。链球菌衍生物的给定基因内的编码区(一个或多个)/外显子(一个或多个)可以被改造以包括一个或多个自互补性区域并且从而当转录时产生dsRNA部分。
dsRNA可以能够被Toll样受体(TLR)蛋白识别，所述Toll样受体(TLR)蛋白由施用链球菌衍生物的对象中的细胞表达。TLR蛋白可以位于细胞的内质网和/或内体区室(endosomal compartment)。TLR蛋白可以是Toll样受体3(TLR3)蛋白。非限制地，细胞可以是B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤细胞和/或树突细胞中的任一种或多种。由TLR3蛋白识别dsRNA可以诱发对象中的免疫反应。免疫反应可以是先天免疫反应。免疫反应可以是1型干扰素反应和/或包括释放炎性细胞因子。
一般而言，在本发明的疫苗中使用的链球菌衍生物将与它们起源的亲本菌株具有显著程度的遗传相似性。借助非限制性实例，如本文提及的“链球菌衍生物”可以与其起源的亲本链球菌菌株具有大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、或大于99％的序列同源性。借助进一步的非限制性实例，当与对应的其亲本菌株比较时，如本文提及的“链球菌衍生物”可以在一个、两个、三个、四个、五个或多于五个基因或表达那些基因必需的调控序列中包括遗传改变。遗传改变可以增加、降低、或阻止讨论的一种或多种基因的表达。
在一个非限制性实施方式中，链球菌细菌衍生物可以是Rx1菌株。自溶素基因(lytA)可以被缺失或致使在Rx1衍生菌株中无功能。额外地或可选地，肺炎球菌溶血素基因(ply)可以被缺失或致使在Rx1衍生菌株中无功能。例如，ply基因可以被替换为另一种基因比如ply的类毒素形式(version)。
额外地或可选地，肺炎球菌表面抗原A基因(psaA)可以被缺失或以其它方式致使无功能。肺炎链球菌的psaA基因编码肺炎球菌表面抗原A(PsaA)，其参与Mn2+运输和对氧化应激的抗性。如本文描述的psaA-缺失突变体在低Mn2+环境中的生长中可以是缺陷的和/或肺炎球菌感受态中可以是缺陷的。在非限制性实施方式，Rx1(ΔLytA,PdT)的psaA-缺失突变体可以被用于产生疫苗候选菌株Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)，其具有减小的毒力、减小的感受态、和/或减小的低Mn2+环境中的生长。这些特征可以给Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)添加额外的生物保障性和生物安全性，使得它成为用于制备γ-照射的肺炎链球菌疫苗的合适的疫苗候选。另外，Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)在Mn2+应激条件下的发酵罐生长可以诱发增加保护性抗原的生产水平的基因表达的改变。通过使用具有较高表达水平的保护性抗原的疫苗产品，可以因而提供改进水平的保护。
用于细菌的遗传操纵的技术对本领域普通技术人员是熟知的(参见，例如，Vennison“Laboratory Manual for Genetic Engineering”,PHI Learning Pvt.Ltd.,2010；Zyskind and Bernstein,“Recombinant DNA Laboratory Manual”,Elsevier,2014；Bose,“Genetic Manipulation of Staphylococci”in“Methods in Molecular Biology”,Springer Protocols,volume 1106,pages 101-111,2014；Hakenbeck and Chhatwal,“Molecular Biology of Streptococci”,Horizon Scientific Press,2007；Morona etal.,“The effect that mutations in the conserved capsular polysaccharidebiosynthesis genes cpsA,cpsB and cpsD have on virulence of StreptococcusPneumoniae”,J.Infect.Dis.189:1905-1913,2004；Morona et al.,“Mutationalanalysis of the carboxy-terminal[YGX]4repeat domain of CpsD,anautophosphorylating tyrosine kinase required for capsule biosynthesis inStreptococcus pneumonia”,J.Bacteriol.185:3009-3019,2003；McAllister et al.,“Molecular analysis of the psa permease complex of Streptococcus pneumoniae”,Mol.Microbiol.53:889-901,2004；Mahdi et al.,“Identification of a novelpneumococcal vaccine antigen preferentially expressed during meningitis inmice”,J.Clin.Invest.122:2208-2220,2012)。
光子辐射
本发明的疫苗中的链球菌细菌和其衍生物可以暴露于光子辐射。如上面记载的，术语“光子辐射”将被理解为涵盖γ-辐射(即γ-射线)和X-辐射(即X-射线)二者。因此，“光子照射的”链球菌细菌或它们的衍生物可以是借助暴露于γ-辐射(即γ-射线)的“γ-照射的”，借助暴露于X-辐射(即X-射线)的“X-照射的”，或二者。如本领域普通技术人员已知的，X-射线与γ-射线相同，除它们由电子通过原子核的电场发射而不是核自身在放射性衰变之后发射以外。仅借助非限制性实例，为了成为光子照射的，材料可以经受至少0.01MeV、至少0.1MeV、至少0.5MeV、0.01MeV和0.5MeV之间、0.01MeV和1MeV之间、0.01MeV和10MeV之间、0.5MeV和20MeV之间、0.5MeV和15MeV之间、0.5MeV和10MeV之间、0.5MeV和5MeV之间、0.5MeV和2MeV之间、或1MeV和2MeV之间(例如1.25MeV)的能量下的光子辐射。
本发明的疫苗中的链球菌细菌和其衍生物可以是γ-照射的。可以使用任何合适的γ-辐射的来源。合适的γ发射器包括但不限于Ba137、Co60、Cs137、Ir192、U235、Se75和Yb169。
可以使用商购的装置进行链球菌细菌和其衍生物的γ-照射，所述商购的装置例如，由Atomic Energy of Canada Ltd.,Canada制造的Gammacell照射器(例如Gammacell40照射器、Gammacell 220照射器、Gammacell 1000照射器、Gammacell 3000照射器)、由J.L.Shepherd and Associates(San Fernando,California,USA)制造的γ-照射器、或由Nordion Inc.(Kanata,Ontario,Canada)制造的Nordion Gamma Cell-1000照射器。例如，在美国专利号3,557,370和美国专利号3,567,938中描述了其它合适的装置。
额外地或可选地，本发明的疫苗中的链球菌细菌和其衍生物可以是X-照射的。可以使用任何合适来源的X-辐射。合适的X-辐射的来源包括但不限于由IBA Industrial(Louvain-la-Neuve,Belgium)制造的杀菌X-射线机。其它合适的装置包括例如由Rad Source Technologies Inc.(Suwanee,Georgia,USA)制造的和
一般而言，链球菌细菌和其衍生物暴露于足以减毒或灭活细菌/衍生物的剂量的光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)。优选地，光子辐射的剂量足以减毒或灭活细菌和其衍生物，而基本上不破坏抗原(例如表面抗原)的结构。抗原决定簇的免疫原性可以因此被光子照射的细菌和其衍生物保留。优选地，光子辐射的剂量在一段时期内和在一定水平下被施用至细菌或其衍生物：其足以确保处理的所有细菌/衍生物暴露而没有不利地影响抗原决定簇的结构完整性。
如本领域普通技术人员已知的，辐射的吸收剂量的度量是戈瑞(Gy)，其被定义为1焦耳的能量沉积在1千克的质量中。其老的度量单位是拉德，其代表“辐射吸收剂量”，其中1Gy＝100拉德。
依据本发明使用的链球菌细菌和其衍生物可以暴露于大约1×103拉德和大约2×109拉德(或大约10Gy至大约2×104kGy)的范围中的总剂量的光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)。在本发明的某些实施方式中，链球菌细菌或衍生物暴露于大约1×103拉德和大约2×109拉德之间、大约1×103拉德和大约1×109拉德之间、大约1×103拉德和大约1×108拉德之间、大约1×103拉德和大约1×107拉德之间、大约1×103拉德和大约1×106拉德之间、大约1×103拉德和大约1×105拉德之间、大约1×103拉德和大约1×104拉德之间、大约1×103拉德和大约2×109拉德之间、大约1×104拉德和大约2×109拉德之间、大约1×105拉德和大约2×109拉德之间、大约1×106拉德和大约2×109拉德之间、大约1×107拉德和大约2×109拉德之间、大约1×108拉德和大约2×109拉德之间或大约1×109拉德和大约2×109拉德之间的总剂量的X-辐射和/或γ-辐射。
在本发明的一些实施方式中，链球菌细菌或衍生物暴露于大约6.5×104拉德和大约2×107拉德(大约0.65KGy至大约200kGy)之间的总剂量的光子辐射(例如X-辐射和/或γ-辐射)。在本发明的其它实施方式中，链球菌细菌或其衍生物暴露于大约10kGy至大约12kGy、大约12kGy至大约14kGy、大约14kGy至大约16kGy、大约10kGy至大约20kGy、大约14kGy至大约20kGy、大于10kGy、大约12kGy至大约14kGy、大于12kGy、大于14kGy、大于16kGy、大于18kGy、大于20kGy、1.26×106拉德(12.6kGy)的总光子辐射剂量，大约1×106拉德(大约10kGy)光子-射线的总光子辐射剂量，或大约1×105拉德(1KGy)的总光子辐射剂量。
光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)的最佳剂量可以受因素比如链球菌细菌或其衍生物存在的培养基、待处理的细菌/衍生物的量、和/或在处理的亚型或菌株影响。因此，光子辐射的总剂量、暴露时间和/或在暴露时期内施加的光子辐射的水平可以被优化以增强处理的效力。
光子辐射(例如X-辐射和/或γ-辐射)的总剂量可以在一段时期内累积地施用至链球菌细菌或其衍生物。例如，可以在低于总剂量的水平下、在足以实现需要的光子辐射的总剂量的时期内，将光子辐射施用至细菌/衍生物。
在一个实施方式中，链球菌细菌或其衍生物的制品被维持在冷冻和/或冻干状态，同时暴露于光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)。这可以促进保留生物完整性和避免抗原的不必要损害，从而增强光子照射的细菌制品的免疫原性，和特别地，它们针对例如异种亚型引发交叉反应/交叉保护免疫力的能力。一般而言，10-20kGy(例如大于10、大于12、大于14、大于16、或大于18kGy)的光子辐射剂量对于处理冷冻的和/或冻干的链球菌细菌或其衍生物的制品可以是有效的。
如上面提及的，优选的是使用光子辐射的处理足以灭活细菌/衍生物而基本上不破坏细菌抗原的结构。可以使用本领域公知的方法评估链球菌细菌或其衍生物的减毒和/或灭活。
例如，通过测定在使用光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)处理后在琼脂培养基上形成集落的活细菌的数目(即集落形成单位)来评估细菌减毒和/或灭活。
可以使用表面组分的蛋白质印迹、FAC分析、或酶法试验，例如，通过与针对纯化的天然抗原组分培养的单特异性抗血清的实验组的反应性，评估抗原决定簇的完整性。
预防和治疗方法
本发明提供了用于预防对象中的链球菌感染的预防方法。还提供了用于治疗对象中的链球菌感染的治疗方法。方法包括给对象施用光子照射的链球菌细菌和/或光子照射的其衍生物，例如，以本发明的疫苗的形式。光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物可以是γ-照射的、X-照射的或二者。
方法针对对象中的链球菌细菌诱发或增强免疫反应。由于其可以针对链球菌细菌的多种血清型诱发或增强免疫反应，该免疫反应可以是交叉保护的/异种的。方法还可以包括施用多种不同的光子照射的(例如γ-照射的、X-照射的或二者)链球菌物种或其衍生物，以从而针对链球菌细菌的多种物种和其多种血清型生成免疫力。
方法可以针对下列链球菌细菌物种中的任一种或多种诱发或增强免疫反应：无乳链球菌、牛链球菌、犬链球菌、停乳链球菌、马链球菌、马肠链球菌、似马链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、米勒链球菌、突变链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、唾液链球菌、血链球菌、猪链球菌和乳房链球菌。
在一些实施方式中，方法包括通过给对象施用光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)给定链球菌物种的制品，预防或治疗由相同链球菌物种引起的链球菌感染。引起感染的链球菌物种血清型可以不同于施用的光子照射的链球菌物种血清型。
仅借助非限制性实例，方法可以被用于预防或治疗：
(i)由无乳链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)无乳链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的无乳链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(ii)由牛链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)牛链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的牛链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(iii)由犬链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)犬链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的犬链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(iv)由停乳链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)停乳链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的停乳链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(v)由马链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)马链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的马链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(vi)由马肠链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)马肠链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的马肠链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(vii)由无乳链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)无乳链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的无乳链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(viii)由似马链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)似马链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的似马链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(ix)由粪肠球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)粪肠球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的粪肠球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(x)由屎肠球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)屎肠球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的屎肠球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xi)由海豚链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)海豚链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的海豚链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xii)由米勒链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)米勒链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的米勒链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xiii)由突变链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)突变链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的突变链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xiv)由肺炎链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)肺炎链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的肺炎链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xv)由酿脓链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)酿脓链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的酿脓链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xvi)由唾液链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)唾液链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的唾液链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xvii)由血链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)血链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的血链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；
(xviii)由猪链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)猪链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的猪链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)；和/或
(xix)由乳房链球菌的任一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症，所述方法通过施用一种或多种光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)乳房链球菌的血清型(一种或多种)进行。施用的光子照射的乳房链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)。
在一些实施方式中，方法被用于预防或治疗由肺炎链球菌的一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症。方法可以包括通过给对象施用一种或多种血清型的光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)肺炎链球菌，针对多种不同的肺炎链球菌血清型诱发对象中的免疫反应。在一些实施方式中，方法包括施用单一光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)肺炎链球菌的血清型。
在一些实施方式中，方法包括预防或治疗由肺炎链球菌的一种或多种血清型引起的感染、疾病或病症。方法包括给对象施用至少一种血清型的光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)肺炎链球菌，并且可以针对肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F和/或48中的任一种或多种诱发对象中的免疫反应。在一些实施方式中，方法可以针对肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的任一种或多种诱发对象中的免疫反应。施用的光子照射的肺炎链球菌血清型(一种或多种)可以不同于引起感染、疾病或病症的血清型(一种或多种)。
疾病或病症可以是由链球菌细菌的具体物种或血清型的感染引起的任意疾病或病症。仅借助非限制性实例，疾病或病症可以是肺炎、耳部感染、耳痛、中耳感染、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、结膜炎、菌血症、败血症、关节感染、骨感染、脓毒性关节炎、骨髓炎、软组织感染、蜂窝组织炎、肌炎、眶周蜂窝组织炎、脓肿、腹膜炎、心脏感染、心内膜炎和心包炎中的任一种或多种。
对象可以是具有经济、社会或研究意义的任何动物，包括牛、马、羊、灵长类、鸟和啮齿动物物种。因此，对象可以是哺乳动物，比如，例如，人或非人哺乳动物(例如猪、猫、狗、奶牛、马、或绵羊)。对象可以是实验室动物(例如啮齿动物比如小鼠、大鼠或豚鼠；兔等)、鸟(例如家禽)、鱼或甲壳动物。
光子照射的(例如γ-照射的和/或X-照射的)链球菌细菌和/或光子照射的其衍生物可以通过任何合适的途径施用至对象，所述途径包括，例如，肠胃外(例如皮内、静脉内、脊柱内、腹腔内、皮下或肌肉内)、口服、外用、或粘膜途径(例如鼻内)。在一些实施方式中，施用通过粘膜途径。例如，施用可以是鼻内的。
不受限于特定的作用机理(一种或多种)，方法可以诱发对象中的免疫反应，其包括下列的一种或多种：
(i)特异性地结合至引起感染、疾病或病症的链球菌细菌的抗原(一种或多种)的抗体的产生；
(ii)特异于引起感染、疾病或病症的链球菌细菌的抗原(一种或多种)的CD4+T淋巴细胞反应；
(iii)特异于引起感染、疾病或病症的链球菌细菌的抗原(一种或多种)的CD8+T淋巴细胞反应。
在一些实施方式中，方法可以诱发对象中的免疫反应，其可以是白介素-17A(IL-17A)依赖性的，IL-17A非依赖性的，和/或其包括激活先天免疫系统——其包括产生细胞因子(例如IFN-γ)和/或活化Toll样受体(例如TLR-3)。这可以帮助减小B细胞的活化阈值和/或增强针对感兴趣的抗原的抗体反应的质量或数量。
仅借助非限制性实例，当与合适的对照比较时，通过方法在对象中诱发或增强的免疫反应可以增加至少大约10％、至少大约20％、至少大约25％、至少大约50％、至少大约75％、至少大约90％、至少大约两倍、至少大约五倍、至少大约十倍、至少大约二十倍、至少大约五十倍、或至少大约100倍。例如，合适的对照可以是在另外类似、基本上相同、或相同的条件下在进行方法之前对相同的免疫反应的测量。
用于检测和定量免疫反应的方法对本领域普通技术人员是熟知的并且包括，例如，固相异相(solid phase heterogeneous)试验(例如酶联免疫吸附试验)、液相试验(例如电化学发光试验)、放大发光近似均相(amplified luminescent proximityhomogeneous)试验、流式细胞术、细胞内细胞因子染色、功能性T-细胞试验、功能性B-细胞试验、功能性单核细胞-巨噬细胞试验、树突细胞和网状内皮细胞试验、NK细胞反应的测量、氧化爆发试验、细胞毒性特异性细胞裂解试验、五聚体结合试验、和吞噬与凋亡评价。
疫苗制剂
本文描述的链球菌细菌和其衍生物可以被并入药物组合物。组合物可以针对致病生物体——其能够在宿主中建立可以在疾病或病症中达到顶点的感染——刺激免疫反应。因此，组合物可以是疫苗，包括预防性疫苗(即出于预防感染和/或疾病/病症的目的施用的疫苗)和治疗性疫苗(即出于治疗感染和/或疾病/病症的目的施用的疫苗)。本发明的疫苗可以因此出于预防、改善、缓解或治疗的目的被施用至接受者。将理解所有这样的疫苗在本文通过提及“本发明的疫苗”被共同地涵盖。在标题为“链球菌菌株”和“链球菌衍生物”的分段中，在上面描述了适于并入本发明的疫苗的合适的链球菌细菌和其衍生物的非限制性实例。疫苗的链球菌细菌和其衍生物通过光子辐射(例如γ-辐射和/或X-辐射)被减毒或灭活。在将细菌/衍生物与其它试剂(一种或多种)组合以形成疫苗制剂之前、期间或之后，光子辐射可以被施加至细菌/衍生物。
-制剂
可以使用本领域普通技术人员已知的方法制备本发明的疫苗。在Gennaro et al.(Eds),(1990)，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USA中描述了合适的方法的非限制性实例，并且在Voller et al.,(1978)，“New Trends and Developments in Vaccines”，University Park Press,Baltimore,Maryland,USA中一般地描述了用于疫苗制备的方法。
疫苗可以包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。如本文所考虑的“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂是当施用至特定接受者比如人或非人动物时不产生不良反应(一种或多种)的物质。药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和佐剂通常还与疫苗的其它成分相容。可以在“Handbook of Pharmaceutical excipients”4thEdition,(2003)Rowe et al.(Eds),The Pharmaceutical Press,London,AmericanPharmaceutical Association,Washington中找到合适的赋形剂、稀释剂、和载体的非限制性实例。
药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的非限制性实例包括去矿物质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油比如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，比如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性有机硅；矿物油比如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物比如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇(aralkanol)；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯比如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜聚糖；黄蓍胶或阿拉伯胶，和凡士林。通常，一种或多种载体将形成按组合物重量计的10％至99.9％。
本发明的疫苗可以是适于通过注射施用的形式，适于口服摄取的制剂的形式(例如，比如胶囊、片剂、囊片、酏剂)，适于外用施用的膏剂、霜剂或洗剂的形式，适于作为滴眼液递送的形式，适于通过吸入施用——比如通过鼻内吸入或口服吸入——的气溶胶形式，或适于肠胃外施用——即皮内、皮下、肌肉内或静脉注射——的形式。
用于口服施用的固体形式的疫苗可以包含人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂布剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻酸钠、羟甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜耳胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙或覆盆子调味剂。合适的涂布剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或乳二硬脂酸甘油酯。
除上面的试剂之外，用于口服施用的液体形式的疫苗还可以包含液体载体。合适的液体载体包括水，油比如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、落花生油、椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。
用于口服施用的包括疫苗的悬浮液可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或乙酰醇(acetyl alcohol)。合适的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸比如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇单-或双-油酸酯、-硬脂酸酯或月桂酸酯等。
对于作为可注射的溶液或悬浮液的疫苗的制备，可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体，比如林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。
用于口服施用的疫苗乳剂可以进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上面示例的分散剂或天然胶比如瓜耳胶、阿拉伯胶或黄蓍胶。
疫苗的外用制剂包括活性成分(一种或多种)(例如光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物)连同一种或多种可接受的载体，以及任选地任何其它的治疗成分。适于外用施用的制剂包括液体或半液体制品，其适于通过皮肤渗透至需要治疗的部位，比如擦剂、洗液、霜剂、膏剂或糊剂；和适于施用至眼、耳或鼻的滴剂。
当配制为滴剂时，疫苗可以包括无菌水性或油性溶液或悬浮液。这些可以通过将活性成分溶解于杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂的水溶液并且任选地包括表面活性剂来制备。得到的溶液然后可以通过过滤澄清，转移至合适的容器并且灭菌。例如，灭菌可以通过如下实现：过滤，接着通过无菌技术转移至容器。适于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备油性溶液的合适的溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。
当配制为洗剂时，疫苗包括适于应用于皮肤或眼的那些。眼洗剂可以包括无菌水溶液，其任选地包含杀菌剂，并且可以通过与上面关于滴剂的制备描述的那些类似的方法来制备。应用于皮肤的洗剂或擦剂还可以包括加速干燥和冷却皮肤的试剂，比如醇或丙酮，和/或保湿剂(moisturiser)比如甘油、或油比如蓖麻油或落花生油。
当配制为霜剂、膏剂或糊剂时，疫苗可以是用于外部应用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过将活性成分——其是单独的细分或粉末形式，或在水性或非水性流体的溶液或悬浮液中——与油脂基材(basis)或非油脂基材混合来制造。该基材可以包括烃比如硬、软或液体石蜡，甘油，蜂蜡，金属皂；胶水；天然起源的油比如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸比如硬脂酸或油酸连同醇比如丙二醇或聚乙二醇。
疫苗可以包括任何合适的表面活性剂比如阴离子、阳离子或非离子型表面活性剂比如失水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂比如天然胶、纤维素衍生物或无机材料比如火成硅石(salicaceous silicas)，和其它成分比如羊毛脂。
疫苗可以以脂质体的形式施用。脂质体通常源自磷脂或其它脂质物质，并且由在水性介质中分散的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。脂质体形式的疫苗可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)——天然的和合成的二者。形成脂质体的方法是本领域已知的，关于此，具体参考：Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33 et seq。
-佐剂
佐剂(一种或多种)可以被包括在本发明的疫苗中，但是本文提供的实验数据证明了光子照射的链球菌细菌和其衍生物可以在不必需这样的佐剂的情况下诱发免疫力。因此，本发明的疫苗可以包括或可以不包括佐剂。
一般而言，在疫苗组合物的上下文中，佐剂活性包括但不限于增强由疫苗中的免疫原性组分(例如光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物)诱发的免疫反应(定量地或定性地)的能力。这可以减少产生免疫反应需要的免疫原性组分的剂量或水平和/或减少产生期望的免疫反应需要的免疫的数目或频率。
优选地，佐剂将增强由疫苗的组分(一种或多种)诱发和/或增强的免疫反应，从而改进保护功效。优选地，佐剂将使得利用较低剂量的其它活性组分(一种或多种)(例如光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物)诱发保护性免疫力。
在“Vaccine Adjuvants:Preparation Methods and Research Protocols(Methods in Molecular Medicine)”，(2000),Ohagan(Ed),Humana Press Inc.中描述了适于包含在本发明的疫苗和其制备方法中的佐剂的非限制性实例。任何合适的佐剂可以被包括在本发明的疫苗中。
这样的佐剂的具体实例包括但不限于氢氧化铝；包括干扰素、白介素和其它细胞因子的多肽佐剂；AMPHIGEN、水包油和油包水乳剂；和皂草苷比如QuilA。
例如，可以利用铝基佐剂。合适的铝基佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝和其组合。在欧洲专利号1216053和美国专利号6,372,223中描述了可以利用的铝基佐剂的其它具体实例。
水包油乳剂可以被用作本发明的疫苗中的佐剂。水包油乳剂是本领域熟知的。一般而言，水包油乳剂将包括可代谢的油，例如，鱼油、植物油或合成油。合适的水包油乳剂的实例包括在欧洲专利号0399843、美国专利号7,029,678和PCT公布号WO 2007/006939中描述的那些。水包油乳剂可以联合其它佐剂和/或免疫刺激物使用。
其它合适的佐剂的非限定性实例包括免疫刺激物比如粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、单磷酰脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或其组成亚单位、热不稳定的肠毒素(LT)或其组成亚单位、Toll样受体配体佐剂比如脂多糖(LPS)和其衍生物(例如，单磷酰脂质A和3-脱酰基单磷酰脂质A)、胞壁酰二肽(MDP)、Toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR-2、TLR-3激动剂)和呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白。
本发明的疫苗中的佐剂可通常包括软化剂(emollient)、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。另一种类型的“自身佐剂(self adjuvant)”通过免疫原性肽与脂质的缀合来提供，比如水溶性脂肽Pam3Cys或其二棕榈酰衍生物Pam2Cys。这样的佐剂具有伴随免疫原性组分进入抗原呈递细胞(比如树突细胞)并且因而产生了增强的抗原呈递和在同时活化细胞的优势(参见，例如，Brown and Jackson,(2005),“Lipid based selfadjuvanting vaccines”，Current Drug Delivery,23:83)。
合适的佐剂是商购的，比如，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐比如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的脂多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子比如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可以被用作佐剂。
在某些实施方式中，在本发明的疫苗中包括的佐剂可以诱发TH1型为主的免疫反应。用于引发主要为TH1型反应的合适的佐剂包括例如单磷酰脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷脂质A(3D-MPL)连同铝盐的组合。例如，组合物或疫苗可以与佐剂AS04一起配制，所述佐剂AS04包含氢氧化铝(alum)和3-O-脱酰基单磷酰脂质A(MPL)比如在Thoelen et al.(2001)，“A Prophylactic hepatitis B vaccine with a novel adjuvant system”，Vaccine,19:2400-2403中描述的。优先诱发TH1型免疫反应的其它已知的佐剂包括包含寡核苷酸的CpG。寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸是未甲基化的。这样的寡核苷酸是本领域普通技术人员已知的，并且在例如PCT公布号WO 1996/02555中描述。免疫刺激性DNA序列也在例如Satoet al.,(1996)，“Immunostimulatory DNA sequences necessary for effectiveintradermal gene immunization”，Science,273:352-354中描述。
佐剂的另一个实例的是皂草苷，优选地QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.,Framingham,Mass.)，其可以单独使用或与其它佐剂联合使用。例如，可以利用增强的佐剂系统，其包含单磷酰脂质A和皂草苷衍生物的组合，比如在PCT公布号WO 1994/00153中描述的QS21和3D-MPL的组合，或如在PCT公布号WO 1996/33739中描述的反应原性较差的组合物，其中QS21使用胆固醇猝灭。其它可选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。在PCT公布号WO1995/17210中描述了包含水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂制剂。在本发明的组合物中包括的佐剂可以包括包含水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的制剂，比如在PCT公布号WO 1995/17210中描述的。在一个实施方式中，本发明的组合物包括佐剂Montanide ISA720(M-ISA-720；Seppic,Fairfield,N.J.)——一种基于天然可代谢的油的佐剂。
优选地，佐剂是粘膜佐剂，其对于增强对经由粘膜途径施用的免疫原性组分的粘膜免疫力和/或全身免疫力是有效的。粘膜佐剂可以被广义地分为：促进疫苗递送(例如脂质体、辅助螯合物(cochleate)、减毒的活载体、聚D,L-丙交酯-乙交酯共聚物或PLGA、chitans、DNA疫苗、粘膜粘合剂)以增强诱发由疫苗的其它免疫原性组分诱发的保护免疫力的那些，和具有免疫刺激作用的那些(例如基于先天免疫力相关毒素的、基于细胞因子的等)。不限制于具体的机制，假定粘膜佐剂的有利效果部分地源自帮助疫苗中的免疫原性组分穿过粘膜屏障的能力。在穿越粘膜屏障之后，粘膜佐剂可以例如通过补体活化、诱导细胞因子、刺激抗体产生或抗体类型转换、刺激抗原呈递细胞、和/或影响MHC I类和/或II类表达来增强免疫力。
施用途径
本发明的疫苗可以通过标准途径施用至接受者，所述途径包括但不限于肠胃外(例如皮内、静脉内、脊柱内、腹腔内、皮下或肌肉内)、口服、外用、或粘膜途径(例如鼻内)。
例如，疫苗可以通过粘膜途径施用。可接受的粘膜疫苗施用途径的非限制性实例包括鼻内、眼部、面颊、生殖道(阴道)、直肠、气管内、皮肤和胃肠道。
在一些实施方式中，本发明的疫苗通过鼻内途径施用。不限制于理论或具体的作用模式(一种或多种)，疫苗的鼻内施用对增强针对某些链球菌感染的免疫力可以是有利的，在所述感染中细菌经由上和/或下呼吸道的粘膜表面感染宿主。此外，粘膜接种(例如鼻内接种)可以不仅在呼吸道中而且在包括生殖器粘膜在内的远端粘膜部位中诱发粘膜免疫力。
例如，本发明的鼻内疫苗可以作为鼻滴剂、喷雾以液体形式配制，或作为适于吸入的粉末，作为霜剂，或作为乳剂配制。可以利用雾化的或气溶胶化的鼻内疫苗。还考虑经由吸入烟雾、粉末或喷雾，或通过鼻内施用鼻滴剂、拭子、粉末、喷雾、烟雾、气溶胶等将疫苗施用至上和/或下呼吸道的粘膜。
在一个实施方式中，用于鼻内施用的疫苗以能够在使用之前立刻重构的冻干粉末形式提供。本发明的疫苗和组合物的粉末疫苗制剂提供了克服与基于液体的疫苗的稳定性和递送相关联的冷藏和分配需求的手段。干粉制剂提供了更稳定并且还不支持微生物生长的优势。
冻干疫苗可以诱发与未冻干疫苗类似的异种亚型免疫力的水平。疫苗可以使用本领域已知的任何合适的技术进行冻干。例如，光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物的液体制品可以在干冰-异丙醇浆液中冷冻并且在冻干机(例如Virtis Model 10-324 Bench,Gardiner,NY)中冻干持续合适的时期(例如24小时)。
在一个实施方式中，本发明的干粉鼻疫苗通过生成喷雾冷冻干燥(SFD)颗粒产生(参见，例如，Costantino et al.,(2002),“Protein spray freeze drying.2.Effect offormulation variables on particle size and stability”,J Pharm Sci.,91:388-395；Costantino,et al.,(2000),“Protein spray-freeze drying.Effect ofatomization conditions on particle size and stability”,Pharm Res.,17:1374-1383；Maa et al.,(1999),“Protein inhalation powders:spray drying vs sprayfreeze drying”,Pharm Res,16:249-254；Carrasquillo et al.,(2001)；“Non-aqueousencapsulation of excipient-stabilized spray-freeze dried BSA into poly(lactide-co-glycolide)microspheres results in release of native protein”,JControl Release,76:199-208；Carrasquillo et al.,(2001),“Reduction ofstructural perturbations in bovine serum albumin by non-aqueousmicroencapsulation”,J Pharm Pharmacol.,53:115-120；和美国专利号6,569,458)。
用于疫苗的鼻内施用的优选装置是鼻喷雾装置(例如从Pfeiffer GmBH,Valois和Becton Dickinson商购的装置)。例如，在Bommer,(1999),“Advances in Nasal drugdelivery Technology”,Pharmaceutical Technology Europe,p26-33中描述了合适的装置的非限制性实例。鼻内装置可以产生1至500μm的范围中的液滴。优选地，仅小百分比的液滴(例如<5％)低于10μm以最小化吸入的可能性。鼻内装置可以能够双剂递送，即，递送单个接种剂的两个子剂，每个鼻孔一个子剂。
本发明的疫苗可以独立地或与其它额外的治疗剂(一种或多种)联合地施用至接受者。在疫苗与治疗剂(一种或多种)一起施用的实施方式中，施用可以是同时的或顺序的(即施用疫苗，然后施用药剂(一种或多种)，或反之亦然)。因而，在本发明的疫苗连同另一种药剂一起施用给对象时，二者可以同时以单个组合物中施用，同时以分开的组合物施用，或不同时分开地施用。
剂量
一般而言，以与施用途径和接受者的身体特性(包括健康状态)相容的方式并且以引发期望效果(一种或多种)(即治疗有效的，免疫原性的和/或保护性的)的这样的方式施用本发明的疫苗。
例如，给定的疫苗的适当剂量可以取决于各种因素，其包括但不限于对象的身体特性(例如，年龄、体重、性别)、化合物是否被用作单一药剂或辅助疗法、给定的链球菌感染的进展(即，病理学状态)、和本领域技术人员可以识别的其它因素。当确定本发明的给定疫苗的适当剂量时可能考虑的多种一般考量例如在Gennaro et al.(Eds),(1990),“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USA；and Gilman et al.,(Eds),(1990),“Goodman And Gilman's:ThePharmacological Bases of Therapeutics”,Pergamon Press中描述。
一般而言，本发明的疫苗可以以大约50微克至大约5mg的活性组分(一种或多种)(即光子照射的链球菌细菌和/或其衍生物)的量施用至患者。剂量大约50微克至大约500微克的量中是尤其优选的。
为了期望的治疗结果，本领域技术人员将能够通过常规实验确定包括在本发明的疫苗中的光子照射的链球菌细菌或其衍生物的有效的、无毒的量。
通常地，有效剂量预期在大约0.0001mg至大约1000mg的活性组分(一种或多种)(即光子照射的链球菌细菌或其衍生物)/kg体重/24小时；典型地，大约0.001mg至大约750mg/kg体重/24小时；大约0.01mg至大约500mg/kg体重/24小时；大约0.1mg至大约500mg/kg体重/24小时；大约0.1mg至大约250mg/kg体重/24小时；大约1.0mg至大约250mg/kg体重/24小时的范围中。更典型地，有效剂量范围预期在大约1.0mg至大约200mg/kg体重/24小时；大约1.0mg至大约100mg/kg体重/24小时；大约1.0mg至大约50mg/kg体重/24小时；大约l.0mg至大约25mg/kg体重/24小时；大约5.0mg至大约50mg/kg体重/24小时；大约5.0mg至大约20mg/kg体重/24小时；大约5.0mg至大约15mg/kg体重/24小时的范围中。
可选地，有效剂量可以是高至大约500mg/m2的活性组分(一种或多种)(即光子照射的链球菌细菌或其衍生物)。通常，有效剂量预期在大约25至大约500mg/m2，优选地大约25至大约350mg/m2，更优选地大约25至大约300mg/m2，还更优选地大约25至大约250mg/m2，甚至更优选地大约50至大约250mg/m2，和还甚至更优选地大约75至大约150mg/m2的范围中。
通常，在治疗应用中，治疗将用于感染、疾病状态或病症的持续时间。进一步，对本领域普通技术人员将显而易见的是，个体剂量的最佳数量和间隔将由正在治疗的感染、疾病状态或病症的性质和程度，施用的形式、途径和部位，和正在治疗的特定个体的性质确定。而且，这样的最佳条件可以通过常规技术确定。
在许多情况下，将期望具有本发明的疫苗的数次或多次施用。例如，本发明的疫苗可以被施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用可以是大约一至大约十二周间隔，并且在某些实施方式中是大约一至大约四周间隔。在重复(recurrent)暴露于由本发明的疫苗靶向的特定病原体的情况下，周期性再施用可以是期望的。
还将对本领域普通技术人员显而易见的是，可以使用常规疗程确定测验确定最佳疗程。
本文描述的方法可以包括施用初次剂量的本发明的疫苗。初次剂量之后可以进行加强剂量。加强可以出于再接种的目的。在多种实施方式中，疫苗被施用至少一次、两次、三次或更多次。本发明的疫苗可以被施用至初次接受者，其是对链球菌细菌的特定靶菌株(一种或多种)血清反应阴性的个体。可选地，疫苗可以被施用至接触过抗原的接受者，其是对链球菌细菌的特定靶菌株(一种或多种)血清反应阳性的个体。
本领域普通技术人员将领会可以对如在具体实施方式中公开的本发明做出众多改变和/或修改，而不背离如广义描述的本发明的精神或范围。因此，本实施方式在所有方面均被视为是示例性而非限定性的。
实施例
现在将参考具体的实施例(一个或多个)描述本发明，所述实施例绝不应当解释为限制性的。
实施例1：生成适于作为通用疫苗测试的肺炎球菌菌株。
肺炎链球菌菌株Rx1是血清型2(D39)的衍生物，其缺乏细菌的外部荚膜。如在下面的流程图中显示的，此菌株被遗传修饰以去除自溶素基因(lytA)。如在下面的流程图中显示的，得到的Rx1(ΔLytA)菌株通过将肺炎球菌溶血素基因(ply)替换为类毒素形式的Ply——其被称为PdT——被进一步修饰。
在每个转化步骤后进行PCR和蛋白质印迹以进一步确认成功的转化，并且测序确认了成功地生成lytA缺陷的肺炎球菌溶血素突变体(PdT)Rx1菌株，其被称为肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(图1)。
对每种衍生物进行溶血试验以确认在携带PdT突变体形式的肺炎球菌溶血素的衍生菌株中缺乏溶血活性(图2)。
流程图：修饰菌株Rx1以去除编码自溶素的lytA基因和将编码肺炎球菌溶血素的 ply基因替换为表达PdT的肺炎球菌溶血素的突变体衍生物所采用的程序。
蛋白质印迹、PCR和测序因而确认了成功地生成肺炎链球菌菌株肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)。
实施例二：来自ΔlytA基因的mRNA转录物的二级结构分析。
进行分析以预测ΔlytA基因mRNA转录物的二级结构。
菌株Rx1的lytA基因的DNA序列——在缺失之前，包括侧翼区——在SEQ ID NO:1(参见下面)中显示。从ATG(起始密码子)到TAA(终止密码子)的lytA基因的全部编码区通过剪接重叠延伸PCR被框内缺失。得到的ΔlytA基因序列在SEQ ID NO:2(参见下面)中显示。由ΔlytA基因序列编码的mRNA转录物在SEQ ID NO:3(参见下面)中显示。
使用RNAfold(RNAfold WebServer([http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi])预测mRNA转录物的二级结构并且在图3中显示。在图3中显示的预测的mRNA转录物的二级结构预期具有-52.80kcal/mol的最小自由能。在SEQ ID NO:3中以黑色粗体下划线显示的预测的双链终止茎-环序列被预测具有-18.10kcal/mol的最小自由能。
SEQ ID NO:1
肺炎链球菌的包括侧翼区的LytA基因序列
自溶素(LytA)的lytA编码序列以斜体/下划线显示，其中ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体/斜体进行强调。-35和-10σ70启动子识别序列分别以浅灰色和深灰色遮蔽。加方格/非粗体核苷酸表示RpoD的潜在的转录结合位点(一个或多个)(TFB)。TFB中间的粗体A代表预测的lytA mRNA的转录起始位点(TSS)。直接侧接ATG起始密码子和TAA终止密码子的上游和下游核苷酸是加方格/粗体的。
通过剪接重叠延伸PCR框内缺失lytA基因的全部编码区，以便lytA上游和下游的SEQ ID NO:1中的加方格/粗体核苷酸序列被融合在一起。
SEQ ID NO:2
肺炎链球菌菌株Rx1ΔLytA(和衍生物)在缺失lytA基因之后的基因序列
由ΔlytA基因编码的信使RNA(mRNA)转录物在SEQ ID NO:3中显示。以粗体黑色和下划线显示的核糖核苷酸被预测形成典型的双链(ds)茎-环结构，其允许Rho-依赖性终止。
SEQ ID NO:3
由ΔlytA基因编码的信使RNA(mRNA)转录物
实施例三：γ-照射剂量和条件对肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的生存能力和形态的影响。
测试在不同的照射剂量和条件下γ-照射对浓缩的疫苗样品的生存能力和形态的影响。
在THY肉汤中培养肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)以获得108集落形成单位(CFU)/ml的细胞密度。细菌经由离心被浓缩，使用PBS清洗，重新离心并且以1×1010CFU/ml的终浓度重悬在PBS-10％甘油中。肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(1×1010CFU/ml)原液在冰或干冰(DI)上在多种照射剂量(0.5-25kGy)和温度条件下被γ-照射。在γ-照射之后，疫苗的样品被平板接种(plate out)在血琼脂平板上以评估生存能力和确认灭活(图4A和图4B)。进行革兰氏染色和扫描电子显微术以测定γ-照射对细菌的物理形态的影响(分别地，图5和图6)。
γ-照射不影响细菌的形态。左边图像显示了未照射的对照细菌，而右边图像显示了细菌在12kGy——其是完全灭活在干冰上被照射的样品需要的最小剂量——下的照射后的形态。
实施例四：在使用活的肺炎链球菌菌株D39攻击之后，接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠的存活时间。
进行实验以确定在DI上使用12KGY下的γ-照射制备的γ-照射的Rx1(ΔLytA,PdT)是否能够针对使用活的肺炎链球菌菌株D39(血清型2)的致死攻击给予保护。
以两周间隔，小鼠鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGYDI)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后两周，使用1×106CFU的肺炎链球菌D39攻击小鼠并且在21天的时期内监测存活时间和存活百分数(图7A和图7B)。
疫苗能够针对使用肺炎链球菌D39的致死攻击提供显著的保护。因而观察到γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)针对使用活的肺炎链球菌菌株D39的鼻内攻击提供保护。
实施例五：在使用肺炎链球菌菌株EF3030(血清型19F)或P9(血清型6A)异型攻击之后，接种有肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠的免疫力。
为了确定γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)是否能够针对使用EF3030(血清型19F)或P9(血清型6A)的异型攻击给予保护，小鼠鼻内接种有两剂肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后两周，使用1×107CFU的EF3030或5×106CFU的P9感染小鼠。在EF3030攻击之后，在感染之后96小时，采集肺和鼻咽以确定细菌计数(分别地参见图8A和图8B)。在P9攻击之后，监测小鼠的存活持续21天(图8C)。
疫苗能够针对异型攻击提供保护，如通过肺中肺炎链球菌EF3030计数的显著降低和肺炎链球菌P9攻击之后中数存活的显著差异显示的。
实施例六：在鼻内接种有肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠中诱发肺炎链球菌-特异性血清抗体反应。
实施分析以确定γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)是否能够在鼻内接种之后诱发肺炎链球菌-特异性抗体反应。
小鼠鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGYDI)(1×108CFU/剂)并且在第二个接种剂后两周收集血液。实施ELISA以测定血清中对下列抗原：Ply、NanA、CbpA和GlpO的抗原特异性IgG反应。此外，ELISA被用于测定对PspA和对未照射的全Rx1(ΔLytA,PdT)细菌细胞的IgG和IgA抗体反应。
在鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)之后，存在对CbpA、GlpO、PspA和对全肺炎球菌的可检测到的抗体反应(图9)。
实施例七：在腹腔内接种有肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)的小鼠中诱发肺炎链球菌特异性抗体反应。
实施进一步的实验以确定腹腔内接种是否能够诱发高水平肺炎链球菌-特异性抗体反应。
小鼠腹腔内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)(1×108CFU/剂)并且在第二个接种剂后两周收集血液。ELISA被用于测定血清中对于下列抗原：肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)细胞的全细胞裂解物(WC)(图10A)、Ply(图10B)和CbpA(图10C)的抗原特异性IgG滴度。
当腹腔内注射时，疫苗诱发显著的高水平抗体滴度。
实施例八：B淋巴细胞在由鼻内施用的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发的保护性免疫力中的作用。
评估B-细胞在由肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发的免疫反应中的参与。
野生型C57BL/6小鼠(WT)和B-细胞缺陷C57BL/6(μMT)小鼠(其是B-细胞缺陷的)鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后两周，使用致死剂量的肺炎链球菌D39鼻内攻击小鼠并且监测存活持续21天。存活百分数在图11中显示。
与相对的WT对照小鼠(其接受PBS而不是疫苗)相比，使WT小鼠接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)导致针对使用D39的致死攻击的显著保护。相比之下，相对于各自的μMT对照小鼠(其接受PBS而不是疫苗)，使μMT小鼠接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)显示没有增加保护的证据。这些结果指示B-细胞因此对鼻内施用的γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗诱发针对肺炎链球菌的保护性免疫力是必不可少的。
实施例九：分析由鼻内施用γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发的保护性免疫力中的T-淋巴细胞反应。
在接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)之后评估T-淋巴细胞反应。
小鼠鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGYDI)(1×108CFU/剂)并且在第二个接种剂后两周采集脾。然后使用疫苗抗原、MalX蛋白或单独的培养基(-对照)刺激脾细胞72小时。在72小时之后，收集来自细胞培养物的上清液以通过ELISA测定细胞因子水平(IL-17A和IFN-γ)(图12A和图12B)。
进行细胞内细胞因子染色以检查在抗原刺激之后Th1细胞(使用IFN-γ+)、Th2细胞(IL-4+)、Th17细胞(IL-17+)和T-reg细胞(Foxp3+)的比例(图12C和图12D)。
在使用疫苗抗原或MalX刺激脾细胞之后，如通过ELISA测量的，接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)似乎不提供上清液中IL-17A或IFN-γ水平的增加。类似地，如通过细胞内细胞因子染色测定的，不存在Th1、Th2、Th17或Tregs的比例的改变。
实施例十：在鼻内施用γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)后使用流感病毒的攻击
实施分析以确定先前接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)是否对使用流感的攻击具有任何不良作用。
小鼠鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGYDI)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后，使用流感病毒A/PR8(～100TCID50)攻击小鼠并且监测体重损失和存活(图13B)。对照小鼠被给予PBS而不是被接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)，并且然后使用流感病毒A/PR8(～100TCID50)进行攻击并且监测体重损失和存活(图13A)。
当随后使用活的流感病毒攻击小鼠时，先前接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)显示没有不良作用。如由所有接种的小鼠在使用流感菌株A/PR8的攻击下存活指示的，存在一些证据证明先前接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)对流感攻击提供了一些保护。这表明了一些有益的旁观者效应。
实施例十一：霍乱毒素佐剂对肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)功效的影响
γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)与原型佐剂霍乱毒素(CT)组合以评估佐剂是否可以增加疫苗的功效。
小鼠鼻内接种有两剂1μg CT(作为对照)或两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)(1×108CFU/剂)加1μg CT。
在第二个接种剂后，使用1×107CFU的肺炎链球菌EF3030，使用1×106CFU的肺炎链球菌D39或使用5×106CFU的肺炎链球菌P9攻击小鼠。在EF3030感染之后，七天后采集肺和鼻咽以确定细菌计数(图14A和图14B)。
在D39或P9攻击之后，小鼠监测存活持续21天(图14C和图14D)。
在使用活的EF3030感染之后，与未接种的对照比较，接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)与CT佐剂导致肺中细菌计数的显著降低。疫苗与CT针对使用活的D39和P9的致死攻击提供显著的保护。
为了确定由γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗与作为佐剂的霍乱毒素诱发的免疫反应的类型，在第二个接种剂后，从鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(12KGY DI)(1×108CFU/剂)——添加或不添加1μg CT的情况下——的小鼠采集脾和血清。使用疫苗抗原、MalX或单独的培养基(-对照)刺激脾细胞持续72小时。在72小时之后，进行细胞内细胞因子染色以查看刺激72h后诱发的Th1细胞(使用IFN-γ+)、Th2细胞(IL-4+)、Th17细胞(IL-17+)和T-reg细胞(Foxp3+)的比例。(图15A和图15B)。采集来自细胞培养物的上清液以查看细胞因子(IL-17A和IFN-γ)(图15C和图15D)。
鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)与CT将Th17反应极化(polarise)，如在使用γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)或MalX刺激之后，由细胞内细胞因子染色证明的Th17细胞数目的增加和上清液中IL-17A的增加所指示的。
通过ELISA测定对全Rx1(ΔLytA,PdT)细胞的血清IgA和IgG滴度(图16)。与使用单独的疫苗菌株免疫的小鼠相比，在存在CT佐剂的情况下，使用γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)免疫的小鼠显示提高的抗体反应。
实施例十二：细胞因子在由鼻内施用的γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发的保护性免疫力中的作用。
评估IFN-γ和IL-7在由γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发的免疫反应中的疫苗功效中的参与。
野生型C57BL/6小鼠(WT)鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后两周，在攻击前24h、攻击之后6h和攻击之后48h，小鼠注射有200μg的IFN-γ或IL-17的中和抗体，或相关的同种型对照抗体(图17A和17B)。使用致死剂量的肺炎链球菌D39鼻内攻击小鼠并且监测存活持续21天。显示了存活百分数。
施用同种型对照抗体不改变疫苗针对D39攻击的保护性功效。重要地，当与它们相对的对照相比时，接种在免疫的小鼠中诱发显著的保护，而不管IFN-γ中和(图17A)。相比之下，此保护被IL-17A中和废除(图17B)。这些数据证明由γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)引发的保护的机制是IL-17A-依赖性和IFN-γ-非依赖性的。
实施例十三：γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)诱发先天性IL-17反应。
评估IL-17依赖性保护的来源。野生型C57BL/6小鼠(WT)鼻内接种有两剂γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)(1×108CFU/剂)。在第二个接种剂后两周，使用肺炎链球菌D39攻击小鼠。攻击之后24和48小时，采集肺并且分析T效应细胞(Th1和Th17)、γδT细胞(γδT1和γδT17)和吞噬细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的比例。γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)接种在D39攻击之后24小时不改变肺中T效应细胞的总数目或Th1或Th17细胞的相对群体(图18A)。对于总T效应细胞和Th17细胞，在48小时观察到类似的结果。在攻击之后48小时，相对于PBS-处理的对照，在免疫的小鼠中存在Th1细胞数目的显著降低。与T效应细胞形成对比，在D39攻击之后，鼻内接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)在肺中诱发γδT细胞群体的显著变化(图18A)。同时相对于未免疫的小鼠，接种的小鼠的肺中γδT细胞的总数目没有显著不同，数据指示免疫的小鼠在攻击之后24小时特异性地增强肺中的γδT17细胞数目，其在攻击之后48小时被进一步增强。相对于对照动物，在24小时，在免疫的小鼠中存在γδT1细胞数目的降低，其导致在48小时检测到显著差异。总的来说，这些数据证明γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)疫苗促进与Th1和γδT1细胞的显著降低相关联的γδT17细胞反应的显著增加，并且在Th17群体中没有差异。因此，数据表明γδT17细胞可以是参与调节免疫小鼠中的保护性免疫力的IL-17A的潜在先天性来源。
在已经接种有γ-照射的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT)或未接种(PBS对照)的小鼠中，比较在使用肺炎链球菌D39攻击后24h和48h小鼠的肺中的巨噬细胞和中性粒细胞的相对数目(图18B)。任一种细胞类型的数目在攻击之后24h和48h在接种的动物中保持类似，而在PBS对照小鼠中，在攻击之后24h和48h之间在肺中的巨噬细胞存在显著增加。这对中性粒细胞也是明显的。
实施例十四：生成在编码毒力决定簇的基因中具有遗传改变的肺炎球菌衍生物。
如下面的流程图中显示的，通过去除编码肺炎球菌表面抗原A(PsaA)的基因进一步遗传修饰肺炎链球菌菌株Rx1(ΔLytA,PdT)。
在每个转化步骤后进行PCR、测序和蛋白质印迹以确认已经发生成功的转化，并且确认生成Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)菌株(图19A和图19B)。图19C确认从Rx1(ΔLytA,PdT)成功地缺失psaA基因以生成Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)并且证明Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)菌株在未补充有Mn2+的培养基中的生长缺陷。
流程图：修饰菌株Rx1(ΔLytA,PdT)以去除编码肺炎球菌表面抗原A的psaA基因所 采用的程序。
蛋白质印迹、PCR和测序因而确认成功地生成肺炎链球菌菌株Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)。
实施例十五：来自ΔpsaA基因的mRNA转录物的二级结构分析。
进行分析以预测ΔpsaA基因mRNA转录物的二级结构。
菌株Rx1(ΔLytA,PdT)的psaA基因的DNA序列——在缺失之前，包括侧翼区——在SEQ ID NO:4(参见下面)中显示。总计865个核苷酸通过剪接重叠延伸PCR诱变被缺失，其导致缺失从转录起始位点直到GTAAA开始的序列——终止密码子上游的56个核苷酸——的区域。得到的ΔpsaA基因序列在SEQ ID NO:5(参见下面)中显示。由ΔpsaA基因序列编码的mRNA转录物在SEQ ID NO:6(参见下面)中显示。
使用RNAfold(RNAfold WebServer([http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi])预测mRNA转录物的二级结构并且在图20中显示。在图20中显示的预测的由ΔpsaA基因编码的mRNA转录物的二级结构预期具有-20.20kcal/mol的最小自由能。
SEQ ID NO:4
肺炎链球菌的包括侧翼区的PsaA基因序列
肺炎球菌表面抗原A(PsaA)的psaA编码序列以斜体/下划线显示，其中ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体/斜体进行强调。-35和-10σ70启动子识别序列分别以浅灰色和深灰色遮蔽。ATG起始密码子的上游的粗体G的9个核苷酸是预测的PsaA mRNA的转录起始位点(TSS)。ATG起始密码子直接上游的核苷酸和TAA终止密码子上游的56个核苷酸是加方格/粗体的，并且构成PCR引物退火的位点。
通过剪接重叠延伸PCR缺失psaA基因在引物退火位点之间的编码区，以便psaA中的SEQ ID NO:4中的加方格/粗体核苷酸序列被融合在一起。
SEQ ID NO:5
肺炎链球菌菌株Rx1ΔLytA,PdT,ΔPsaA在缺失psaA基因之后的基因序列。
由ΔpsaA基因编码的信使RNA(mRNA)转录物在SEQ ID NO:6中显示。预测以粗体黑色和下划线显示的核糖核苷酸形成典型的双链(ds)茎-环结构，其允许Rho-依赖性终止。
SEQ ID NO:6
由ΔpsaA基因编码的信使RNA(mRNA)转录物
实施例十六：γ-照射剂量和条件对肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)的生存能力和形态的影响。
在不同的照射剂量下γ-照射对浓缩的疫苗样品的生存能力和形态的影响。
在THY肉汤中培养肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)以获得108集落形成单位(CFU)/ml的细胞密度。细菌经由离心被浓缩，使用PBS清洗，重新离心并且以1×1010CFU/ml的终浓度重悬在PBS-10％甘油中。肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)(1×1010CFU/ml)原液在干冰(DI)上在多种照射剂量(0.5-25kGy)下被γ-照射。在γ-照射之后，疫苗菌株的样品被平板接种在血琼脂平板上以评估生存能力和确认灭活(图21A)。显示了没有被照射(图21B)或在25kGy下被照射(图21C)的肺炎链球菌Rx1(ΔLytA,PdT,ΔPsaA)的物理形态的扫描电子显微术。γ-照射不影响细菌的大体形态。
序列表
<110> 伽玛疫苗有限公司
<120> 链球菌疫苗
<130> P140271C
<150> AU 2015901098
<151> 2015-03-26
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1324
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 1
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tgaaaaggac atatagagac tgtaaaaata tacttttgaa aatcttttta gtctggggtg 120
ttattgtaga tagaatgcag accttgtcag tcctatttac agtgtcaaaa tagtgcgttt 180
tgaagttcta tctacaagcc taatcgtgac taagattgtc ttctttgtaa ggtagaaata 240
aaggagtttc tggttctgga ttgtaaaaaa tgagttgttt taattgataa ggagtagaat 300
atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagtcggcgt gcaaccatat 360
aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat 420
tatcactggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggttgc 480
atcatgcagg taggacctgt tgataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 540
gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ccaaagaaga gttcatgacg 600
gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 660
acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 720
ccaaacaacc actcagacca cgttgaccct tatccatatc ttgctaaatg gggcattagc 780
cgtgagcagt ttaagcatga tattgagaac ggcttgacga ttgaaacagg ctggcagaag 840
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Claims (63)

1.用于预防或治疗对象中链球菌细菌的感染的方法，所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的光子照射的链球菌细菌以从而预防或治疗所述感染。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法预防或治疗多种不同的链球菌物种和/或血清型的感染。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括不同的：链球菌物种、链球菌血清型、和/或链球菌衍生物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述链球菌感染包括肺炎链球菌的一种或多种血清型的感染。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中链球菌细菌的所述感染是呼吸道感染、肺炎、耳部感染、耳痛、中耳感染、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、结膜炎、菌血症、败血症、关节感染、骨感染、脓毒性关节炎、脓毒症、骨髓炎、软组织感染、蜂窝组织炎、肌炎、眶周蜂窝组织炎、脓肿、坏死性筋膜炎、脓疱病、腹膜炎、心脏感染、心内膜炎和/或心包炎中的任一种或多种。
6.针对对象中的链球菌细菌诱发免疫反应的方法，所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的光子照射的链球菌细菌以从而诱发所述免疫反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫反应包括针对施用给所述对象的不同的链球菌物种和/或血清型的异型免疫反应。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量的光子照射的链球菌细菌包括不同的：链球菌物种、链球菌血清型、和/或链球菌衍生物。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述不同的链球菌物种和/或血清型是肺炎链球菌血清型。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包括如下的任一种或多种：
(i)B-淋巴细胞反应；
(ii)至少部分地通过来自所述光子照射的链球菌细菌的双链RNA与Toll样受体的相互作用诱发的先天免疫反应；
(iii)T-淋巴细胞反应。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括至少一种肺炎链球菌血清型，或肺炎链球菌血清型的至少一种未被囊的衍生物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括突变体链球菌细菌，其包括：
(i)一种或多种缺陷DNA修复蛋白；和/或
(ii)引起缺陷DNA修复能力的遗传改变。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述光子照射的突变体链球菌细菌包括编码DNA修复蛋白的至少一种基因的缺陷。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述光子照射的突变体链球菌细菌是肺炎链球菌突变体，其包括选自编码DNA烷基化修复蛋白的基因、编码DNA聚合酶4的基因、hexA、hexB、mutS、radC、recA、recF、recN、recO、uvrA、uvrB、uvrC或uvrD的一种或多种基因的缺陷。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述缺陷DNA修复蛋白在所述光子照射的突变体链球菌细菌中是突变的、截短的或不存在。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述光子照射的突变体链球菌细菌包括链球菌Rx1菌株衍生物，其中：
(i)自溶素、溶血素、肺炎球菌溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种是缺陷的；和/或
(ii)不存在自溶素、溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷自溶素蛋白的基因、编码缺陷溶血素的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和/或编码缺陷PsaA蛋白的基因中的任一种或多种；或
(ii)是衍生物，其中不存在编码自溶素的基因、编码溶血素的基因、和/或编码PsaA蛋白的基因中的任一种或多种。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述自溶素是LytA。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因，和编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因；或
(ii)不包含lytA基因，并且包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中与对应的非突变体链球菌细菌需要的相比，所述光子照射的突变体链球菌细菌需要减小剂量的光子照射用于灭活。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中一些或所有所述光子照射的链球菌细菌包括修饰的链球菌细菌，其包括编码RNA转录物的DNA序列，其中所述RNA转录物包括能够在转录后形成双链部分的自互补性区域。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA转录物的部分的长度是至少：10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个碱基对。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述双链RNA转录物引发所述对象中的先天免疫反应，其包括Toll样受体活化。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述Toll样受体是Toll样受体-3(TLR-3)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括营养突变体链球菌细菌。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括编码抗原或其组分的至少一种重组DNA部分，所述抗原或其组分：
(i)灭活或减毒所述细菌；和/或
(ii)诱发或增强所述对象中的免疫反应。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述重组DNA部分替换或破坏病原性、感染、增殖、体内生长、或其任意组合必需的内源基因。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括全杀死的链球菌细菌。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌被粘膜或鼻内施用至所述对象。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌联合佐剂被施用至所述对象。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中一个、两个或三个单独剂量的所述光子照射的链球菌细菌被施用至所述对象。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌被施用至少：8千戈瑞(kGy)、9kGy、10kGy、11kGy、12kGy、15kGy、20kGy、25kGy、30kGy、40kGy或50kGy的总剂量的光子照射。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的链球菌细菌、X-照射的链球菌细菌或其组合。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括X-照射的链球菌细菌。
36.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的链球菌细菌和X-照射的链球菌细菌的组合。
37.根据权利要求20或权利要求33所述的方法，其中所述光子照射是γ-照射。
38.根据权利要求20或权利要求33所述的方法，其中所述光子照射是X-照射。
39.根据权利要求20或权利要求33所述的方法，其中所述光子照射是γ-照射和X-照射的组合。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述光子照射的链球菌细菌包括如下链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和编码缺陷PsaA蛋白的基因；
(ii)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因；
(iii)包括编码缺陷PsaA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码LytA蛋白的基因；或
(iv)包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，其中不存在编码LytA蛋白的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因。
41.疫苗组合物，其包括光子照射的链球菌细菌和药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体，其中：
(i)所述光子照射的链球菌细菌包括包含一种或多种缺陷DNA修复蛋白的突变体链球菌细菌，和/或其中不存在至少一种类型的DNA修复蛋白的突变体链球菌细菌；和/或
(ii)所述光子照射的链球菌细菌包括修饰的链球菌细菌，其包括编码RNA转录物的DNA序列，其中所述RNA转录物包括能够在转录后形成双链部分的自互补性区域。
42.根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述突变体链球菌细菌是肺炎链球菌突变体，其包括选自编码DNA烷基化修复蛋白的基因、编码DNA聚合酶4的基因、hexA、hexB、mutS、radC、recA、recF、recN、recO、uvrA、uvrB、uvrC或uvrD的一种或多种基因的缺陷。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的疫苗组合物，其中所述修饰的链球菌细菌是修饰的肺炎链球菌细菌并且所述双链RNA转录物的部分的长度是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个碱基对。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的疫苗组合物，其中所述光子照射的链球菌细菌包括编码抗原或其组分的至少一种重组DNA部分，所述抗原或其组分：
(i)灭活或减毒所述细菌；或
(ii)诱发或增强所述对象中的免疫反应。
45.根据权利要求44所述的疫苗组合物，其中所述重组DNA部分替换或破坏病原性、感染、繁殖或其任意组合必需的内源基因。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的疫苗，其中所述光子照射的链球菌细菌包括链球菌Rx1菌株衍生菌株，其中：
(i)自溶素、溶血素、肺炎球菌溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种是缺陷的；和/或
(ii)不存在自溶素、溶血素、和/或PsaA蛋白中的任一种或多种。
47.根据权利要求46所述的疫苗，其中所述光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷自溶素蛋白的基因、编码缺陷溶血素的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和/或编码缺陷PsaA蛋白的基因中的任一种或多种；或
(ii)是衍生物，其中不存在编码自溶素的基因、编码溶血素的基因、和/或编码PsaA蛋白的基因中的任一种或多种。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的疫苗，其中所述光子照射的链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因，和编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因；或
(ii)不包含lytA基因，并且包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因。
49.根据权利要求41至48中任一项所述的疫苗，其中所述光子照射的突变体链球菌细菌包括如下链球菌Rx1菌株衍生物：
(i)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因、和编码缺陷PsaA蛋白的基因；
(ii)包括编码缺陷LytA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因；
(iii)包括编码缺陷PsaA蛋白的基因、编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，并且其中不存在编码LytA蛋白的基因；或
(iv)包括编码缺陷肺炎球菌溶血素的基因，其中不存在编码LytA蛋白的基因，并且其中不存在编码PsaA蛋白的基因。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的疫苗组合物，其中所述光子照射的链球菌细菌包括全减毒的或全杀死的链球菌细菌。
51.根据权利要求41至50中任一项所述的疫苗组合物，进一步包括佐剂。
52.根据权利要求41至51中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物被配制用于粘膜或鼻内施用或被配制用于肌肉内、皮下或皮内注射。
53.根据权利要求41至52中任一项所述的疫苗组合物，其中所述光子照射的链球菌细菌包括γ-照射的突变体链球菌细菌和/或γ-照射的修饰的链球菌细菌。
54.根据权利要求41至52中任一项所述的疫苗组合物，其中所述光子照射的链球菌细菌包括X-照射的突变体链球菌细菌和/或X-照射的修饰的链球菌细菌。
55.根据权利要求41至52中任一项所述的疫苗组合物，其中所述光子照射的链球菌细菌包括：
(i)γ-照射的和X-照射的突变体链球菌细菌的组合；和/或
(ii)γ-照射的和X-照射的修饰的链球菌细菌的组合。
56.用于制备根据权利要求41至55中任一项所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：
(i)光子照射链球菌细菌的制品以从而减毒或杀死所述细菌；和
(ii)将所述光子照射的链球菌细菌与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述光子照射所述链球菌细菌的制品包括将所述细菌暴露于γ-辐射。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述光子照射所述链球菌细菌的制品包括将所述细菌暴露于X-辐射。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述光子照射所述链球菌细菌的制品包括将所述细菌暴露于γ-辐射和X-辐射。
60.通过权利要求56至59中任一项所述的方法制备的疫苗组合物。
61.根据权利要求41至55或60中任一项所述的疫苗组合物，其用于预防或治疗链球菌细菌的感染。
62.光子照射的链球菌细菌在制备用于预防或治疗链球菌细菌的感染的药物中的用途，其中所述药物是根据权利要求41至55或60中任一项所述的疫苗组合物。
63.根据权利要求61所述的疫苗组合物或根据权利要求62所述的用途，其中链球菌细菌的所述感染是呼吸道感染、肺炎、耳部感染、耳痛、中耳感染、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、结膜炎、菌血症、败血症、关节感染、骨感染、脓毒性关节炎、骨髓炎、软组织感染、蜂窝组织炎、肌炎、眶周蜂窝组织炎、脓肿、腹膜炎、心脏感染、心内膜炎和心包炎中的任一种或多种。
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