CN117159480B - 一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组人IFN‑γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用，所述重组人IFN‑γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN‑γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。本发明提供的重组人IFN‑γ蛋白冻干小球，能提高检测的准确性、特异性，降低检测空白限，同时不同冻干小球间保持高度均一性，保存期达5年以上，可作为人体血液中分泌的IFN‑γ蛋白检测的标准品。

Description

一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及冻干技术领域，具体涉及一种冻干小球的制备方法，尤其涉及一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用。
背景技术
干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)是一种在有丝分裂素、特定的抗原刺激作用下，主要由活化的T细胞和NK细胞分泌的细胞因子，也是一种可溶性糖蛋白，不耐热和酸，其在pH=2时不稳定。IFN-γ不仅能影响包括抗病毒、抗肿瘤细胞生长和分化等方面的细胞功能，而且在免疫调节中起重要作用，如促进r RNA合成，促进Ⅰ类和Ⅱ类组织相容性抗原的表达，调节同种K细胞、NK细胞、巨噬细胞的功能活性。IFN-γ也具有抗病毒活性，其抗病毒活性较Ⅰ型低，但它的免疫调节和抗细胞增殖的作用较强，所以又称免疫干扰素。
重组人IFN-γ蛋白通常作为抗原，用于人体血液中分泌的IFN-γ蛋白检测的标准品。目前国内市场中抗原蛋白多以液态储存或者冻干成粉末状为主，冻干成小球的较少。液态储存存在以下缺陷：（1）液态多以冻存为主，使用时难以避免反复冻融，这会导致抗原降解，含量下降；（2）运输储存较困难。而冻干成粉末状的抗原蛋白存在以下缺陷：（1）易黏连管壁，复溶时会出现复溶不完全，导致结果测试不准确；（2）多个抗原蛋白混合冻干成粉末状，冻干粉内，每个抗原蛋白的量差异较大，不便于试剂的检测。
为了方便储存、运输及检测过程中更加简便易操作，需要将重组人IFN-γ蛋白制备成冻干小球。专利公开号为CN114159555A的中国发明专利中公开了一种抗原蛋白冻干小球及其制备方法，所述抗原蛋白冻干小球中包括冻干保护溶液和抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白冻干小球由所述冻干保护溶液与所述抗原蛋白溶液混合后冻干获得。但针对本发明中的重组人IFN-γ蛋白，由于重组人IFN-γ蛋白较不稳定，而且抗冻能力弱，当采用前述专利中提及的制备方法将重组人IFN-γ蛋白制备成重组人IFN-γ蛋白冻干小球时，在冻干过程中容易出现不同小球间生物活性差异大，不均衡等问题，从而严重影响后续检测过程的准确性。
因此急需找到一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法，使制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球均一性好，稳定性高，还能保证重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ 蛋白含量检测的准确性和灵敏度。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用，通过添加封闭剂（包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸），提高检测的准确性和特异性，同时降低检测的空白限；通过在冻干保护溶液中添加抗氧化剂维生素E、维生素C和表面活性剂PVP40，使重组人IFN-γ蛋白在制备成冻干小球的过程中保持活性不会降解，提高重组人IFN-γ蛋白的低温耐受能力，同时还改进了冻干保护溶液中的多元醇、缓冲液等的配方，并提高重组人IFN-γ蛋白的稳定性，从而制得冻干得率高、稳定性好，不同冻干小球间保持高度均一性，保存期5年以上的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，可用于人体血液中分泌的IFN-γ蛋白检测的标准品。
本发明的重组人IFN-γ蛋白冻干小球作为标准品使用，因此需严格保证其含量的准确性、稳定性与操作过程的准确性。在保证重组人IFN-γ蛋白冻干小球中重组人IFN-γ蛋白的稳定性的基础上，更为重要的是，能够实现对重组人IFN-γ蛋白冻干小球中重组人IFN-γ蛋白的含量进行精确检测。
因为随着冻干小球中多种不同成分的加入，将有可能导致最终产生交叉影响、背景或噪声增大的问题，影响检测结果。
因此，在本发明中，需检测加入不同成分后的空白限，严格控制其在限度以下，从而提高本发明重组人IFN-γ蛋白冻干小球作为标准品使用时，检测冻干小球中重组人IFN-γ蛋白含量的准确性与稳定性。
一方面，本发明提供了一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸；所述冻干保护溶液包括糖类、多元醇、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲液和胎牛血清；所述糖类包括葡聚糖和海藻糖；所述多元醇包括甘露醇；所述抗氧化剂包括维生素E和维生素C；所述表面活性剂包括PVP40；所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液；所述封闭剂包括牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L；所述冻干保护溶液包括葡聚糖5-100g/L，海藻糖40-100g/L，甘露醇5-100g/L，维生素E2-5g/L，维生素C 1-3g/L，PVP40 5-100g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L，pH值为7.2-7.4。
重组人IFN-γ蛋白被制备成冻干小球后，需要通过检测重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白，从而评估冻干小球的稳定性和生物活性，但是实验结果发现，冻干保护溶液对重组人IFN-γ蛋白的检测存在明显的干扰作用，导致检测结果存在假阳性，难以准确检测其中的重组人IFN-γ蛋白含量。
本发明经研究证明，额外添加由牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸制备的封闭剂，将其先与重组人IFN-γ蛋白溶液制成混合溶液，室温下静置30min后，再将所述混合溶液与冻干保护溶液组合后，既能保证重组人IFN-γ蛋白的稳定性，又能防止检测结果出现假阳性。
由牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸组成的封闭剂，具有封闭作用，能有效阻断后续使用时冻干小球中的某些成分与试剂盒抗体之间的非特异性反应，具有减小实验误差、避免产生假阳性的作用，可显著提高检测的准确性、特异性与灵敏度。而且该封闭剂不会影响重组人IFN-γ蛋白冻干小球的稳定性，使其可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性。
理论上，每颗重组人IFN-γ蛋白冻干小球中抗原蛋白含量应该是一致的，因此在使用过程中，只需每次取出一颗或数颗进行使用，无需额外检测每颗重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的抗原蛋白含量，即可实现对抗体的精确检测，检测过程非常方便。
但由于重组人IFN-γ蛋白相对不稳定，在制备成冻干小球过程中非常容易降解，从而导致在冻干过程容易出现小球间差异很大的问题，严重影响重组人IFN-γ蛋白的后续应用。
本发明通过在重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干保护溶液中，添加抗氧化剂维生素E、维生素C和表面活性剂PVP40（聚乙烯吡咯烷酮40），能够较好地解决重组人IFN-γ蛋白冻干过程中容易降解且分布不均匀的问题。其中，维生素E和维生素C使重组人IFN-γ蛋白在冻干过程中保持稳定，不容易发生降解；PVP40能够促使重组人IFN-γ蛋白分子分散，从而在冻干小球中均匀分布。因此，本发明制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球中重组人IFN-γ蛋白的冻干得率高，且小球间保持很好的均一性，并能提高稳定性。
另外，重组人IFN-γ蛋白制备的冻干小球在放置一段时间后还会存在粘连的情况，本发明通过在重组人IFN-γ蛋白冻干小球中添加抗氧化剂维生素E、维生素C和表面活性剂PVP40还具有防止小球之间粘连的效果。
同时，重组人IFN-γ蛋白的低温耐受能力也相对较弱，本发明通过在冻干保护溶液中添加葡聚糖和海藻糖，并适当提高海藻糖的含量，从而提高重组人IFN-γ蛋白的抗冻能力。
所述冻干保护溶液中的甘露醇主要起到填充剂的作用，也有助于提高重组人IFN-γ蛋白的稳定性，可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性。
所述冻干保护溶液中的磷酸盐缓冲液能帮助维持酸碱平衡，使重组人IFN-γ蛋白在更合适的pH条件下冻干，有助于提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率和稳定性。
所述冻干保护溶液中的胎牛血清能起到更好的帮助维持重组人IFN-γ蛋白稳定的作用，提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的均一性。
进一步地，所述维生素E和维生素C的质量比为3：2。
进一步地，所述冻干保护溶液包括葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L，pH值为7.2-7.4。
进一步地，所述封闭剂和重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液与冻干保护溶液的体积比为1:1，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/mL。
另一方面，本发明提供了一种如上技术方案所述的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）配制封闭剂溶液：取牛血清白蛋白15g、酪蛋白15g、甘氨酸15g和谷氨酸15g，向其中加入浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成500mL的封闭剂溶液；
（2）配制封闭剂溶液与重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液；
（3）配制冻干保护溶液：取葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清，配制成pH值为7.2-7.4的冻干保护溶液；
（4）冻干保护溶液与步骤（2）中的混合溶液混合，制备成重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液；
（5）通过滴珠设备将重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人IFN-γ蛋白冻珠；
（6）通过冷冻干燥工艺将重组人IFN-γ蛋白冻珠制备成重组人IFN-γ蛋白冻干小球。
进一步地，步骤（3）所述配制冻干保护溶液：取葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清，并采用0.01mol/L的盐酸溶液或0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节冻干保护溶液的pH值为7.2-7.4。
进一步地，步骤（5）所述滴珠设备的参数设置为：液滴体积为13μL。
进一步地，步骤（6）所述通过冷冻干燥工艺将重组人IFN-γ蛋白冻珠制备成重组人IFN-γ蛋白冻干小球，具体步骤包括：
a：开启冷冻干燥机，并对冷冻干燥机预冷至预冷温度后将重组人IFN-γ蛋白冻珠置于冷冻干燥机中；
b：设置冷冻干燥机中的搁板的温度以进行第一阶段干燥；
c：调节搁板的温度以进行第二阶段干燥；
d：调节搁板的温度以进行第三阶段干燥。
再一方面，本发明提供了一种封闭剂在制备提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测准确性的试剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
进一步地，所述冻干保护溶液包括葡聚糖5-100g/L，海藻糖40-100g/L，甘露醇5-100g/L，维生素E 2-5g/L，维生素C 1-3g/L，PVP40 5-100g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L；所述封闭剂包括牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L。
再一方面，本发明提供了一种冻干保护溶液在制备提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率和复溶稳定性的制剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
再一方面，本发明提供了一种封闭剂在制备降低重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测的空白限的试剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
再一方面，本发明提供了一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球在制备提高重组人IFN-γ蛋白检测灵敏度的试剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
再一方面，本发明提供了一种冻干保护溶液在制备防止IFN-γ蛋白冻干小球粘连的制剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
再一方面，本发明提供了一种冻干保护溶液在制备降低重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测的空白限的试剂中的应用，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述冻干保护溶液包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清；所述封闭剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸。
本发明取得的有益效果：
1、通过在重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干保护溶液中，添加抗氧化剂维生素E、维生素C和表面活性剂PVP40，解决了重组人IFN-γ蛋白冻干过程中容易降解且分布不均匀的问题，其中，维生素E和维生素C使重组人IFN-γ蛋白在冻干过程中保持稳定，不容易发生降解；PVP40促使重组人IFN-γ蛋白分子分散，从而在冻干小球中均匀分布；
2、通过在重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干保护溶液中添加葡聚糖和海藻糖，并优化其含量，提高重组人IFN-γ蛋白的低温耐受能力，提高抗冻能力；
3、改进了冻干保护溶液中的多元醇、缓冲液等的配方，并添加胎牛血清，起到更好的帮助维持重组人IFN-γ蛋白稳定的作用，提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的均一性；
4、通过在重组人IFN-γ蛋白冻干小球中添加封闭剂，包括牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸，能有效的阻断后续使用时重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的某些成分与试剂盒抗体之间的非特异性反应，具有减小实验误差、避免产生假阳性的作用，可显著提高检测的准确性、特异性与灵敏度，还能保证重组人IFN-γ蛋白的稳定性，使其可长期储存，且复溶后也能在一定期限内保持较好的稳定性；
5、制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率高（90%以上）、稳定性好，不同冻干小球之间保持高度均一性，保存期可达5年以上，且复溶后24h内保持稳定；
6、制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球用于人体血液中分泌的IFN-γ蛋白检测时，空白限可达到0.67pg/ml或更低。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的的通常意义。本实施例中使用的试剂，除特别声明外，均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中所述封闭剂不仅包含了普通封闭剂的作用，可以避免重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的某些成分与试剂盒中的抗体发生非特异性反应，造成检测结果出现假阳性。同时，还可以消除检测过程中的基质效应，显著降低检测的空白限。
实施例1：本发明提供的重组人IFN-γ蛋白冻干小球
1、本实施例提供的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法如下：
（1）配制封闭剂溶液：
取牛血清白蛋白15g、酪蛋白15g、甘氨酸15g和谷氨酸15g，向其中加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L）配制成500mL的封闭剂溶液；
（2）配制封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液：
采用采购的重组人IFN-γ蛋白（重组人IFN-γ蛋白名称：Recombinant HumanIFN-γ (carrier-free)；厂家：biolegend；货号：570206；浓度：1mg/ml），用蛋白稀释液（0.01mol/L 磷酸盐缓冲液，pH为7.2±0.2，含3%牛血清白蛋白）稀释500倍，配制成浓度为2μg/ml 的重组人IFN-γ蛋白溶液；
取封闭剂溶液与重组人IFN-γ蛋白溶液按照体积比1:1混合，制得封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液，室温下静置30min。
（3）配制冻干保护溶液：
取葡聚糖40g、海藻糖70g、甘露醇（多元醇）40g、维生素E 3g、维生素C 2g、PVP40（表面活性剂）40g和胎牛血清10ml，向其中加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L）配制成1L的冻干保护溶液，并采用0.01mol/L的盐酸溶液或0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节冻干保护溶液的pH值为7.2-7.4（本实施例优选为7.3）。
（4）配制重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液：
取冻干保护溶液与步骤（2）中制得的封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液按照体积比1:1混合，制得重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液。
（5）通过滴珠设备将重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人IFN-γ蛋白冻珠；滴珠设备的参数设置为：液滴体积为13μL（即每滴液滴的体积为13μL）。
（6）通过冷冻干燥工艺将重组人IFN-γ蛋白冻珠制备成重组人IFN-γ蛋白冻干小球，具体步骤为：
a：开启冷冻干燥机，并对冷冻干燥机预冷至预冷温度（小于-20℃，本实施例优选为-35℃）后将重组人IFN-γ蛋白冻珠置于冷冻干燥机中；
b：设置冷冻干燥机中的搁板的温度以进行第一阶段干燥，具体步骤为：
b-1：将搁板的温度设置为-45℃，并保持该温度4h；
b-2：将搁板的温度设置为-35℃，并对冷冻干燥机抽真空（真空度小于20 pa，本实施例优选为10 pa）后保持该温度8-12h。其有益效果在于：避免破坏抗原蛋白的性能，有利于保障抗原蛋白的稳定性。
c：调节搁板的温度以进行第二阶段干燥，具体步骤为：
c-1：将搁板的温度设置为-30℃，并保持该温度8-12h；
c-2：将搁板的温度设置为-25℃，并保持该温度8-12h；
c-3：将搁板的温度设置为-20℃，并保持该温度1-2h；
c-4：将搁板的温度设置为-10℃，并保持该温度1-2h；
c-5：将搁板的温度设置为0℃，并保持该温度1-8h。
d：调节搁板的温度以进行第三阶段干燥，具体步骤为：
d-1：将搁板的温度设置为10℃，并保持该温度1-2h；
d-2：将搁板的温度设置为25℃，并保持该温度2-8h。
制备得到的重组人IFN-γ蛋白冻干小球均表面洁白，光滑平整，大小一致，且各个重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间不发生粘连。检测重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率、复溶稳定性以及热加速稳定性，以及用于检测时的灵敏度测试。
冻干得率测试方法：将重组人IFN-γ蛋白冻干小球取3个加入稀释液溶解并测试，即重组人IFN-γ蛋白冻干小球测试值（ng/球），同时，测试抗原蛋白冻干前的含量，计算重组人IFN-γ蛋白冻干后相对冻干前的比值，即为冻干得率，因在长时间的存储中不可避免会存在一定的蛋白损失，因此满足冻干得率大于90%即可认为符合要求。其中重组人IFN-γ蛋白活性的测试方法为：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（十二联检）对其含量进行测试，同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV（变异系数），来考察重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性，变异系数值越小，说明冻干小球之间差异性越小，均一性越高。
复溶稳定性试验方法：将重组人IFN-γ蛋白冻干小球取3个加入稀释液溶解，分别在溶解后的0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h检测并记录检测结果，即冻干小球测试值（ng/球）。计算各个时间点相对于0h的相对偏差，24h相对偏差满足小于等于±15%即满足要求。同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV，来考察重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性。
热加速稳定性试验方法：将重组人IFN-γ蛋白冻干小球取3个进行检测，并记录检测结果，即重组人IFN-γ蛋白冻干小球测试值（ng/球）。然后将重组人IFN-γ蛋白冻干小球取15个放入37℃恒温箱中。然后在第3天、第10天、第17天、第24天、第31天分别从37℃恒温箱中取3个进行检测，并记录检测结果。计算各个时间点相对于0天的相对偏差，31天相对偏差满足小于等于±15%即满足要求。同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV，来考察重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性。
空白限的测试方法：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（免疫荧光法，型号：十二联检）将重组人IFN-γ蛋白取3份作为标准品，绘制3条标准曲线，同时重复测试20例空白样本（冻干保护溶液）并记录检测结果，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD计算出相应的浓度，即为检测的空白限。
本发明的重组人IFN-γ蛋白冻干小球作为标准品使用，因此需保证其含量的准确性、稳定性与操作过程的准确性，防止其他不同成分的加入导致最终产生交叉影响、背景或噪声增大的问题，因此，在下述实施例中，对空白限的检测也作为本发明的一个检测指标，在抗氧化剂和表面活性剂的组合、表面活性剂、缓冲液和封闭剂的筛选中，均对空白限进行检测，从而提高最终检测结果的准确性。
经检测，本实施例制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率、复溶稳定性、热加速稳定性以及空白限检测结果分别如表1-表4所示。
表1、冻干得率检测结果
表2、复溶稳定性
表3、热加速稳定性
表4、检测空白限
根据表1-表4，本实施例制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率为97.61%，复溶稳定性在24h相对于0h的相对偏差为-4.62%，热加速稳定性在第31天相对于0天的相对偏差为-4.19%，且不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异非常小，均一性非常高，无粘连情况发生。用于检测时的空白限可达到0.67pg/ml或更低，显著降低检测的空白限，同时提高检测灵敏度。经长期跟踪研究发现，本实施例制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的保存期可长达5年，保存条件为干燥环境，2-8℃，5年后重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白活性为10.31ng，相对偏差为-12.5%（本实施例中，还在40℃高温加速条件环境中放置1年，实验结果表明，仍可达到优益效果，结果不产生显著差异，此条件相当于保存条件为2-8℃，干燥环境下的5年）。
实施例2：抗氧化剂和表面活性剂的组合对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
由于重组人IFN-γ蛋白相对不稳定，在制备成冻干小球过程中非常容易降解，从而导致在冻干过程容易出现小球间差异很大的问题，本实施例针对目前存在的问题，从抗氧化剂和表面活性剂着手，希望能找到好的解决办法。
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别按照表5所述方式添加抗氧化剂和表面活性剂，从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率，考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%，同时测试其在检测时的空白限；将20个重组人IFN-γ蛋白冻干小球在37℃放置15天，观察是否存在粘连的情况。计算检测结果如表5所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表5、不同抗氧化剂和表面活性剂的组合的筛选
根据表5可以看出，采用不同的抗氧化剂和表面活性剂的组合制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球时，对冻干得率、均一性与粘连情况都有着完全不同的影响。
相比于单独添加抗氧化剂或单独添加表面活性剂的情况，同时添加抗氧化剂和表面活性剂能更有效改善重组人IFN-γ蛋白在冻干过程中易降解且均一性差的问题，对于冻干小球之间的粘连问题也能有效解决，同时对于人体IFN-γ蛋白的检测空白限显著降低，可达到0.52 pg/ml。
不同的抗氧化剂和不同表面活性剂对提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的稳定性效果也完全不同，经多次实验发现，采用维生素E、维生素C和PVP40组合制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球稳定性更好，冻干得率更高，制备的小球之间差异性也更小，均一性更好，而且还不容易发生粘连情况，同时对人体IFN-γ蛋白的检测空白限也显著下降，说明检测灵敏度显著提高。
实施例3：抗氧化剂对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
1、抗氧化剂的选择
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察未添加抗氧化剂，以及添加不同抗氧化剂配制成同浓度的冻干保护溶液（详见表6），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表6所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表6、抗氧化剂对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表6可以看出，重组人IFN-γ蛋白在制备冻干小球过程中很不稳定，易出现降解的情况，且批间差异很大，在制备成冻干小球后，复溶后或是高温储存也都会出现重组人IFN-γ蛋白活性明显下降的情况；而当在冻干保护溶液中加入抗氧化剂，能明显提高重组人IFN-γ蛋白的稳定性，还能显著改善冻干小球之间的差异性问题。
同时，添加不同抗氧化剂，对提高重组人IFN-γ蛋白的稳定性也存在不同的影响。实验证明，相比于其他抗氧化剂，添加维生素E、维生素C、谷胱甘肽作为抗氧化剂，可有效改善重组人IFN-γ蛋白在制备冻干小球过程中的稳定性，但其结果依然不尽如人意。本实施例尝试将多种抗氧化剂组合，发现采用维生素E和维生素C组合作为抗氧化剂，可显著改善重组人IFN-γ蛋白在制备冻干小球过程中的稳定性，冻干得率能达到96%以上，不同冻干小球之间均一性非常好，而且制备的冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况，稳定性显著提高，其原因可能是维生素E和维生素C组合后更有助于改善重组人IFN-γ蛋白在冻干过程中易降解的性能。
2、维生素E和维生素C添加量的优化
本实施例选择维生素E和维生素C为抗氧化剂，继续考察了维生素E和维生素C的不同添加量对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响，具体按照表7所示的方案制备冻干保护溶液。
表7、维生素E和维生素C添加量的优化
根据表7，维生素E和维生素C的添加量不同，制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的稳定性存在较大差异，最优选的添加量为维生素E 3g/L、维生素C 2g/L，此时的重组人IFN-γ蛋白冻干小球冻干得率最高，复溶稳定性最好，热加速稳定性也为最高。
实施例4：表面活性剂的筛选及其与抗氧化剂的组合
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，以维生素E和维生素C（3g/L+2g/L）作为抗氧化剂，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察未添加表面活性剂，以及添加5种不同表面活性剂配制成同浓度的冻干保护溶液（详见表8），从而制备得到6组不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），并测试其在检测时的空白限，检测结果如表8所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表8、表面活性剂对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表8可以看出，添加表面活性剂可以显著改善重组人IFN-γ蛋白冻干小球的稳定性问题，并且能帮助消除不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性，其原因可能是由于表面活性剂能帮助重组人IFN-γ蛋白分子在冻干保护溶液中均匀分散，从而改善重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的均一性，提高稳定性。但是不同表面活性剂，对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球存在着明显不同的效果，这可能是因为不同表面活性剂本身性质存在差异，从而对重组人IFN-γ蛋白产生不同的影响，并且不同表面活性剂与重组人IFN-γ蛋白之间的相容性不同。研究证明，表面活性剂PVP40可以显著改善重组人IFN-γ蛋白冻干小球在制备冻干小球过程中的稳定性，不同冻干小球之间均一性也明显改善，而且制备的冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况，稳定性显著提高，还有助于降低空白限，提高冻干小球中重组人IFN-γ蛋白含量检测的准确性。
采用吐温20作为表面活性剂虽然也具有不错的效果，但制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球在热加速实验过程中，颜色由白变黄，对产品外观造成影响，因此不考虑采用吐温20，最优选采用PVP40制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球。
实施例5：糖类对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了添加不同糖类对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响（详见表9），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表9所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表9、糖类的选择对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表9可以看出，糖类的选择对于制备重组人IFN-γ蛋白也有着非常重要的作用，相比之下，蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖、果糖比乳糖、半乳糖、麦芽糖等糖类，在制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球方面更有利。
多次实验证明，相比于采用一种糖，采用两种糖类组合能显著提高重组人IFN-γ蛋白在冻干过程中的抗冻能力，尤其是采用葡聚糖和海藻糖的组合，能明显提高重组人IFN-γ蛋白的稳定性，还能显著改善重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性问题，同时制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球经复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天也依然没有明显活性下降的情况。
本实施例还进一步优化了葡聚糖和海藻糖的组合中的比例关系，发现提高海藻糖的含量还能明显提高重组人IFN-γ蛋白在制备冻干小球过程中的耐低温能力，制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球稳定性更好，复溶及高温储存的稳定性也更高，具体实验结果详见表10。
表10、海藻糖含量对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表10可以看出，最合适的糖类组合为葡聚糖（40g/L）+海藻糖（70g/L），制备得到的重组人IFN-γ蛋白冻干小球性能更加优异。
实施例6：多元醇对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了添加不同多元醇对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响（详见表11），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），计算检测结果如表11所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表11、多元醇的选择对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表11可以看出，最优选的多元醇为甘露醇，制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球方面稳定性更高，不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，复溶后24h内都能保持高度稳定，同时经37℃高温储存31天，重组人IFN-γ蛋白活性也不会下降。
实施例7：缓冲液的筛选
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制冻干保护溶液时，分别考察了不同缓冲液对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响（详见表12），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）、热加速稳定性（37℃高温加速31天）以及对人体IFN-γ蛋白的检测空白限，计算检测结果如表12所示（实验过程中，每次用于制备抗体的抗原的含量保持一致，其中，抗原的含量保持一致为抗原中的活性蛋白的含量保持一致）。
表12、缓冲液的选择对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
根据表12可以看出，缓冲液也会影响重组人IFN-γ蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，最优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球方面稳定性更高，不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人IFN-γ蛋白活性没有明显下降，同时检测空白限也显著降低。
实施例8：添加不同封闭剂对重组人IFN-γ蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在配制封闭剂溶液时，分别考察了不同封闭剂对制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响（详见表13和表14），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），并测试其在检测时的空白限，空白限的测试方法为：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（十二联检），将重组人IFN-γ蛋白取3份作为标准品，绘制3条标准曲线，同时重复测试20例空白样本（冻干保护溶液）并记录检测结果，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD计算出相应的浓度，即为检测的空白限。计算检测结果如表13和表14所示。
表13、封闭剂对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
注：1）所述IFN-γ蛋白冻干后含量指刚刚制备完成的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，未经过长时间冷冻储藏，因此不会发生明显的蛋白含量损失；2）满足冻干得率在90%~110%的范围认为符合要求；3）此处封闭剂为牛血清白蛋白+酪蛋白+甘氨酸+谷氨酸，组分浓度均为30g/L。
表14、封闭剂的选择对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
注：1）所述IFN-γ蛋白冻干后含量指刚刚制备完成的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，未经过长时间冷冻储藏，因此不会发生明显的蛋白含量损失；2）满足冻干得率在90%~110%的范围认为符合要求；3）上述封闭剂浓度均为30g/L；4）每次检测结果之间存在一定偏差为正常结果，并非每次测定结果都为相同，只要不存在显著差异（当存在显著差异时，p＜0.05），即可认为是在合理范围内的偏差；5）所述空白对照中，不添加封闭剂为不添加封闭剂，只添加冻干保护溶液。
根据表13可以看出，当不添加封闭剂和冻干保护溶液时，重组人IFN-γ蛋白冻干后对其进行检测，发现其中重组人IFN-γ蛋白的含量发生了明显的下降，冻干得率仅为62.48%；而当不添加封闭剂，只添加冻干保护溶液时，在重组人IFN-γ蛋白冻干前后分别对其进行检测，发现在冻干前重组人IFN-γ蛋白的含量已经发生了明显的上升，而冻干后重组人IFN-γ蛋白的含量在其基础上继续发生明显的上升，最终冻干得率达到127.20%；而当添加封闭剂和冻干保护溶液时，重组人IFN-γ蛋白冻干后对其进行检测，其中重组人IFN-γ蛋白的含量基本不变，冻干得率为97.85%。这可能是因为1）当不添加冻干保护溶液时，在制备过程中即会有部分蛋白发生损失，从而导致蛋白含量发生明显的下降；2）当不添加封闭剂，只添加冻干保护溶液时，重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的某些成分和试剂盒中的抗体发生了非特异性结合，使检测得到的重组人IFN-γ蛋白含量偏高，最终检测到假阳性结果；3）而当添加封闭剂和冻干保护溶液时，重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的成分均不会和试剂盒中的抗体发生非特异性结合，因此最终检测得到的重组人IFN-γ蛋白含量与冻干前相近，极大地提高了检测的准确性、特异性，同时降低了检测的空白限，从而提高了检测的灵敏度。
根据表14可以看出，封闭剂的选择可以显著降低检测的空白限，同时也会影响重组人IFN-γ蛋白制备冻干小球的稳定性及均一性，最优选的封闭剂为牛血清白蛋白+酪蛋白+甘氨酸+谷氨酸的组合，其浓度均为30g/L，加入此封闭剂后，制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球冻干得率为97.88%，重组人IFN-γ蛋白含量与冻干前的重组人IFN-γ蛋白含量最接近，不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人IFN-γ蛋白活性没有明显下降，同时检测的空白限达到0.50pg/ml，显著提高了检测的准确性、特异性，同时降低了检测的空白限。而当选择其他氨基酸的组合或在上述最佳组合的基础上继续增加表格中所述氨基酸时，其冻干得率等测定结果反而产生更大的偏差，检测的空白限相较于最佳封闭剂组合也显著增大，因此，本实施例中，优选封闭剂为牛血清白蛋白+酪蛋白+甘氨酸+谷氨酸，其浓度均为30g/L。
实施例9：封闭剂的加入顺序与其配制过程对重组人IFN-γ蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响
本实施例按照实施例1提供的方法制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其中在与重组人IFN-γ蛋白溶液混合时，分别考察了封闭剂的加入顺序与其配制过程对制备的重组人IFN-γ蛋白冻干小球用于降低检测时空白限的影响（详见表15与表16），从而制备得到不同的重组人IFN-γ蛋白冻干小球，按照实施例1提供的方法检测各组重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率（同时考察3个小球之间重复检测的偏差，计算CV%）、复溶稳定性（复溶后24h）以及热加速稳定性（37℃高温加速31天），并测试其在检测时的空白限，空白限的测试方法为：采用江西赛基生物技术有限公司生产的细胞因子联合检测试剂盒（十二联检），将重组人IFN-γ蛋白取3份作为标准品，绘制3条标准曲线，同时重复测试20例空白样本（冻干保护溶液）并记录检测结果，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD计算出相应的浓度，即为检测的空白限。计算检测结果如表15与表16所示（本实施例中封闭剂为最佳成分组合：牛血清白蛋白+酪蛋白+甘氨酸+谷氨酸，其浓度均为30g/L）。
表15、封闭剂的加入顺序对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
注：1）满足冻干得率在90%~110%的范围认为符合要求；2）上述封闭剂浓度均为30g/L；3）每次检测结果之间存在一定偏差为正常结果，并非每次测定结果都为相同，只要不存在显著差异（当存在显著差异时，p＜0.05），即可认为是在合理范围内的偏差；5）所述空白对照中，不添加封闭剂为不添加封闭剂，只添加冻干保护溶液。
表16、封闭剂的配制过程对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球的影响
注：1）满足冻干得率在90%~110%的范围认为符合要求；2）上述封闭剂浓度均为30g/L；3）每次检测结果之间存在一定偏差为正常结果，并非每次测定结果都为相同，只要不存在显著差异（当存在显著差异时，p＜0.05），即可认为是在合理范围内的偏差；5）所述空白对照中，不添加封闭剂为不添加封闭剂，只添加冻干保护溶液。
根据表15可以看出，封闭剂的加入顺序对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球有明显的影响：当先加入封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀得到混合溶液后，再加入冻干保护溶液与混合溶液混合均匀时，此时制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球均符合要求，同时检测的空白限也产生明显的降低；而当封闭剂加入冻干保护溶液中，再取冻干保护溶液与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀，或先加入冻干保护溶液与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀后，再加入封闭剂混合均匀时，这两种操作顺序下，最终制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球均不符合要求，且最终检测的空白限也发生明显的上升。这可能是因为只要封闭剂不先与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀，后加入的冻干保护溶液中的成分均可能会和试剂盒抗体之间产生非特异性反应，易产生假阳性结果。而当先加入封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀，即可避免此种情况，同时可显著降低检测的空白限，提高检测的准确性、特异性与灵敏度。
根据表16可以看出，封闭剂的配制过程对制备重组人IFN-γ蛋白冻干小球有明显的影响：当先将实施例1中的最佳4种成分按照最佳配比配制成封闭剂，再将封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀后，然后再加入冻干保护溶液，此时最终制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球冻干得率为95.98%，重组人IFN-γ蛋白含量与冻干前的重组人IFN-γ蛋白含量最接近，不同重组人IFN-γ蛋白冻干小球之间的差异性更小，均一性更好，而且复溶后24h内都能保持高度稳定，经37℃高温储存31天，重组人IFN-γ蛋白活性没有明显下降，同时检测的空白限达到0.61pg/ml，显著提高了检测的准确性、特异性，同时降低了检测的空白限。而当选择其他配制过程时，最终制得的重组人IFN-γ蛋白冻干小球其冻干得率等测定结果反而产生更大的偏差，检测的空白限相较于最佳封闭剂最佳配制过程也显著增大，因此，本实施例中，优选封闭剂的配制过程为先将实施例1中的最佳4种成分按照最佳配比配制成封闭剂，再将封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合均匀后，再加入冻干保护溶液。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (8)

1.一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸和谷氨酸组成；所述冻干保护溶液由糖类、多元醇、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲液和胎牛血清组成；所述糖类由葡聚糖和海藻糖组成；所述多元醇为甘露醇；所述抗氧化剂由维生素E和维生素C组成；所述表面活性剂为PVP40；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
2.如权利要求1所述的重组人IFN-γ蛋白冻干小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制封闭剂溶液：取牛血清白蛋白15g、酪蛋白15g、甘氨酸15g和谷氨酸15g，向其中加入浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成500mL的封闭剂溶液；
（2）配制封闭剂溶液与重组人IFN-γ蛋白溶液的混合溶液；
（3）配制冻干保护溶液：取葡聚糖、海藻糖、甘露醇、维生素E、维生素C、PVP40、磷酸盐缓冲液和胎牛血清，配制成pH值为7.2-7.4的冻干保护溶液；
（4）冻干保护溶液与步骤（2）中的混合溶液混合，制备成重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液；
（5）通过滴珠设备将重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液滴至液氮中，使液滴状的重组人IFN-γ蛋白冻干原溶液在液氮中冻结形成球体状结构的重组人IFN-γ蛋白冻珠；
（6）通过冷冻干燥工艺将重组人IFN-γ蛋白冻珠制备成重组人IFN-γ蛋白冻干小球。
3.一种封闭剂在制备提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测准确性的试剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
4.一种冻干保护溶液在制备提高重组人IFN-γ蛋白冻干小球的冻干得率和复溶稳定性的制剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
5.一种封闭剂在制备降低重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测的空白限的试剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
6.一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球在制备提高重组人IFN-γ蛋白检测灵敏度的试剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
7.一种冻干保护溶液在制备防止重组人IFN-γ蛋白冻干小球粘连的制剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
8.一种冻干保护溶液在制备降低重组人IFN-γ蛋白冻干小球中的重组人IFN-γ蛋白含量检测的空白限的试剂中的应用，其特征在于，所述重组人IFN-γ蛋白冻干小球由封闭剂、重组人IFN-γ蛋白溶液和冻干保护溶液混合冻干成球状，所述封闭剂由牛血清白蛋白30g/L，酪蛋白30g/L，甘氨酸30g/L，谷氨酸30g/L组成；所述冻干保护溶液由葡聚糖40g/L，海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，维生素E 3g/L，维生素C 2g/L，PVP40 40g/L，磷酸盐缓冲液0.01mol/L，胎牛血清10ml/L组成，pH值为7.2-7.4；所述封闭剂与重组人IFN-γ蛋白溶液混合得到混合溶液后，再将所述冻干保护溶液与所述混合溶液按照体积比为1:1混合均匀，所述重组人IFN-γ蛋白溶液中含有重组人IFN-γ蛋白浓度为2μg/ml。
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