CN111707625A - 一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法、试剂球及检测芯片 - Google Patents

一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法、试剂球及检测芯片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及总胆汁酸检测技术领域，特别是涉及一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法、试剂球及检测芯片。本发明实施例提供了一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，本发明实施例提供了一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，该总胆汁酸测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，本发明实施例是将试剂A和试剂B的的液滴分别滴在液氮中，使试剂A和试剂B的液滴分别形成第一冰球和第二冰球；再将第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球和第二试剂球，该总胆汁酸测定试剂球可置于检测芯片中，并用于总胆汁酸的即时检测。

Description

一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法、试剂球及检测芯片
技术领域
本发明涉及总胆汁酸检测技术领域，特别是涉及一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法、试剂球及检测芯片。
背景技术
人体血清总胆汁酸(TBA)是由肝脏合成并分解代谢，从而维持人体胆汁酸的相对稳定，它的调控是肝脏的一个主要功能。正常人肝脏合成的胆汁酸主要有胆酸、鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸等。当肝细胞发生病变或患胆管疾病时可引起胆汁的代谢障碍，使进入血中的胆汁酸含量显著升高，血清中胆汁酸的升高与肝细胞损伤程度成正比。
血清总胆汁酸的测定方法主要有层析法、免疫法和酶法等，其中，酶法又包括酶荧光法、酶比色法和酶循环法。酶比色法由于即适用于人工操作，又适用于机器自动分析，应用范围较广。近年来发展起来的酶循环法灵敏度高、特异性好，成为目前推荐的血清总胆汁酸检测方法。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中，采用酶循环法检测定血清总胆汁酸的浓度时，通常需要依赖大型全自动生化分析仪进行分析，难以实现对病人血清总胆汁酸的快速诊断。
发明内容
为了实现对病人血清总胆汁酸的快速诊断，本发明实施例提供一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，能够使血清总胆汁酸的检测试剂形成冻干的总胆汁酸测定试剂球，该总胆汁酸测定试剂球可置于检测芯片中，适用于总胆汁酸的即时检测。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：
第一方面，本发明实施例提供一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，所述总胆汁酸测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球；
所述方法包括：
将试剂A的液滴滴在液氮中，使所述试剂A的液滴形成第一冰球；
将试剂B的液滴滴在液氮中，使所述试剂B的液滴形成第二冰球；
将所述第一冰球进行冷冻干燥制得所述第一试剂球；
将所述第二冰球进行冷冻干燥制得所述第二试剂球；其中，
所述试剂A包括以下组份：第一缓冲液20umol/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸4.0-8.0g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L、吐温20 5.00-10.00g/L和第一赋形剂80-150g/L；
所述试剂B包括以下组份：第二缓冲液200umol/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00-4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.0-10.0KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L和第二赋形剂80-150g/L。
可选的，所述第一冰球和所述第二冰球的体积为2.5-3.5ul。
可选的，所述将试剂A的液滴滴在液氮中之前，所述方法还包括：配制所述试剂A；
所述配置试剂A包括以下步骤：
将所述第一缓冲液加入盛有水的容器中；
待所述第一缓冲液在水中溶解完全后，往所述容器中加入所述乙二胺四乙酸二钠、所述β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸和所述聚乙二醇单辛基苯基醚；
调节所述容器中溶液的PH值至4.5；
往所述容器中加入所述第一赋形剂。
可选的，所述将试剂B的液滴滴在液氮中之前，所述方法还包括：配制所述试剂B；
所述配置所述试剂B包括以下步骤：
将所述第二缓冲液加入盛有水的容器中；
待所述第二缓冲液在水中溶解完全后，往所述容器中加入所述牛血清白蛋白、所述聚乙二醇6000、所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和所述聚乙二醇单辛基苯基醚；
调节所述容器中溶液的PH值至8.9；
往所述容器中加入所述第二赋形剂。
可选的，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液包括甘氨酸、三乙醇胺、一水合柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种。
可选的，所述第一缓冲液为所述一水合柠檬酸，所述第一赋形剂包括甘露醇和聚乙二醇8000，所述第二缓冲液为所述三羟甲基氨基甲烷，所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和水溶性淀粉；
所述试剂A包括以下组份：一水合柠檬酸4.10g/L、乙二胺四乙酸二1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸8.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、吐温20 10.00g/L、甘露醇50g/L、聚乙二醇800050g/L；
所述试剂B包括以下组份：
三羟甲基氨基甲烷24.20g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶10.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、甘露醇50g/L、海藻糖50g/L、水溶性淀粉20g/L。
可选的，所述第一缓冲液为所述甘氨酸，所述第一赋形剂包括海藻糖和葡聚糖4万，所述第二缓冲液为所述三乙醇胺，所述第二赋形剂包括甘露醇、葡聚糖1万和水溶性淀粉；
所述试剂A包括以下组份：甘氨酸3.00g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型6.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.50g/L、吐温20 8.00g/L、海藻糖80g/L和葡聚糖4万10g/L；
所述试剂B包括以下组份：三乙醇胺35.00g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶8.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、葡聚糖1万10g/L、水溶性淀粉20g/L。
可选的，所述第一缓冲液为所述甘氨酸，所述第一赋形剂包括海藻糖和聚乙二醇8000，所述第二缓冲液为所述三羟甲基氨基甲烷，所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和葡聚糖4万；
所述试剂A包括以下组份：甘氨酸2.50g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型5.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、吐温20 5.00g/L、海藻糖50g/L、聚乙二醇800050g/L；
所述试剂B包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.2g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、海藻糖30g/L、葡聚糖4万10g/L。
第二方面，本发明实施例还提供一种应用本发明第一方面提供的总胆汁酸测定试剂球的制备方法制备得到的总胆汁酸测定试剂球。
第三方面，本发明实施例还提供一种总胆汁酸检测芯片，所述总胆汁酸检测芯片包括芯片本体和本发明第二方面提供的总胆汁酸测定试剂球，其中，所述总胆汁酸测定试剂球设置于所述芯片本体内部。
本发明实施方式的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明实施例提供了一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，该总胆汁酸测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，本发明实施例是将试剂A和试剂B的的液滴分别滴在液氮中，使试剂A和试剂B的液滴分别形成第一冰球和第二冰球；再将第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球和第二试剂球，该总胆汁酸测定试剂球可置于检测芯片中，并用于总胆汁酸的即时检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的总胆汁酸试剂球的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例中的各个特征可以相互组合，均在本发明的保护范围之内。另外，虽然在装置示意图中进行了功能模块的划分，在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于装置示意图中的模块划分，或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，能够制备出球形的总胆汁酸测定试剂，请参阅图1，该方法包括如下步骤：
S11、配制试剂A和试剂B；
本实施例中，试剂A包括以下组份：第一缓冲液20umol/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸4.0-8.0g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L、吐温20 5.00-10.00g/L和第一赋形剂80-150g/L。试剂B包括以下组份：第二缓冲液200umol/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00-4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.0-10.0KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L和第二赋形剂80-150g/L。
可选的，在一些实施例中，试剂A的配置方法包括以下步骤：量取一定体积的第一缓冲液加入盛有800ml水的容器中；待第一缓冲液在水中溶解完全后，往容器中加入一定量的乙二胺四乙酸二钠、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸和聚乙二醇单辛基苯基醚；调节容器中溶液的PH值至4.5后，再将第一赋形剂加入容器中；最后将水加入到容器中，以将容器中溶液的体积定容至1L。
可选的，在一些实施例中，试剂B的配置方法包括以下步骤：量取一定体积的第二缓冲液加入盛有800ml水的容器中；待第二缓冲液在水中溶解完全后，往容器中加入一定量牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和聚乙二醇单辛基苯基醚；调节容器中溶液的PH值至8.9后，再将第二赋形剂加入容器中；最后将水加入到容器中，以将容器中溶液的体积定容至1L。具体的，第一缓冲液和第二缓冲液包括甘氨酸、三乙醇胺、柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种。
赋形剂能够赋予冻干药品良好的外观，使冻干药品疏松，易于复溶。赋形剂主要包括多元醇类、糖类，氨基酸类、无机盐类以及蛋白质和肽类赋形剂，其中，多元醇类赋形剂包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、侧金盏花醇、乙二醇和聚乙二醇等；糖类赋形剂包括葡聚糖(例如，葡聚糖1万和葡聚糖4万)、麦芽糊精、水溶性淀粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和葡萄糖等；氨基酸类赋形剂包括：谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸和丙氨酸等；无机盐类赋形剂包括：磷酸盐、碳酸钙、硫酸锰、胆酸钠和乙酸钠等；蛋白质和肽类赋形剂包括粘多糖蛋白、酪蛋白，牛血清蛋白等。为了使冻干试剂球可以呈现出更好的形态，本发明实施例中的第一赋形剂和第二赋形剂包括葡聚糖1万、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇8000、水溶性淀粉和葡聚糖4万中的至少一种。
S12、将试剂A的液滴滴在液氮中，使试剂A的液滴形成第一冰球；
S13、将试剂B的液滴滴在液氮中，使试剂B的液滴形成第二冰球；
本实施例中，可以通过点胶机将试剂A和试剂B的液滴分别滴在液氮中，使试剂A和试剂B的液滴在液氮中分别凝结成第一冰球和第二冰球。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的混合液的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整冰球的体积。可选的，在一些实施例中，第一冰球和第二冰球的体积为2.5-3.5ul。
S14、将第一冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球；
S14、将第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥制得第二试剂球。
本实施例中，将第一冰球和第二冰球置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，获得第一试剂球和第二试剂球，待氮气复压后将第一试剂球和第二试剂球收集并保存在干燥的铝瓶中。
冷冻干燥是指将含水药品预先进行降温冻结成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物质低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥后，药品本身留在冻结时的冰架中，因此冷冻干燥后的药品疏松多孔且体积不变，由于药品干燥前始终处于冻结状态，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象。冷冻干燥后的物质呈海绵状疏松多孔，体积基本与干燥前保持不变，极易溶于水而恢复原状。
本发明实施例还提供一种应用上述总胆汁酸测定试剂球的制备方法制备得到的总胆汁酸测定试剂球。
本发明实施例提供的总胆汁酸测定试剂球的制备方法通过先将反应试剂的液滴冻成冰球，再将冰球进行冷冻干燥制备总胆汁酸测定试剂球，制备出的总胆汁酸测定试剂球均一性好，该方法适用于总胆汁酸测定试剂球的大批量生产。
本发明实施例提供的总胆汁酸测定试剂球的检测原理如下：血清中胆汁酸在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)及β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型(Thio-NAD)的作用下被氧化，生成3-酮类固醇和β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸还原型(Thio-NADH)，生成的3-酮类固醇在3α-HSD及β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸还原型(NADH)的作用下，生成胆汁酸及β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型(NAD)。通过酶的循环反应，微量的胆汁酸被扩增，通过测定生成的Thio-NADH吸光度的变化而求得血清中胆汁酸的浓度。在405nm处连续监测吸光度的上升反应速率，该反应速率与样本中总胆汁酸的含量成正比。因此，通过吸光度的上升反应速率即可计算出样本中总胆汁酸的浓度。
本发明实施例还提供一种总胆汁酸检测芯片，该总胆汁酸检测芯片包括芯片本体和本发明任一实施例提供的总胆汁酸测定试剂球。在一些实施例中，芯片本体由注塑成型的塑料基底和光学膜通过粘结胶层粘贴而成，芯片本体包括样本槽、稀释液槽、定量槽、混合槽、废液槽、液流通道和比色孔等结构。芯片本体还包括多个可存放总胆汁酸检测试剂球的比色孔，检测样本进入比色孔后与总胆汁酸检测试剂球发生化学反应。
使用总胆汁酸检测芯片进行检测时无需对样本进行离心等预处理即可进行检测，因而血清、血浆或全血都可用于检测。通常经静脉穿刺获得血样本可在采集后60min内进行分析，而指尖末梢血样本应在采集后立即进行分析。使用移液器将样本经总胆汁酸检测芯片的样本孔中，芯片自带稀释液与样本混匀后进行测试。。其中，检测用的稀释液为蒸馏水。
为进一步阐述本发明的技术方案，以下提供本发明的总胆汁酸测定试剂制备方法的若干实施例。
实施例1：
本实施例中，第一缓冲液为一水合柠檬酸，第一赋形剂包括甘露醇和聚乙二醇8000，第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和水溶性淀粉。总胆汁酸测定试剂球的制备方法如下：配制一定量试剂A和试剂B；将试剂A和试剂B的液滴滴在液氮中形成第一冰球和第二冰球，且第一冰球和第二冰球的体积约为2.5ul；将第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥制得所述总胆汁酸测定试剂球。并采用该总胆汁酸测定试剂球置于芯片本体中制得总胆汁酸检测芯片。
具体的，本实施例中，试剂A包括以下组份：一水合柠檬酸4.10g/L、乙二胺四乙酸二1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸8.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、吐温2010.00g/L、甘露醇50g/L、聚乙二醇800050g/L；试剂B包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.20g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶10.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、甘露醇50g/L、海藻糖50g/L、水溶性淀粉20g/L。
实施例2：
本实施例中，第一缓冲液为甘氨酸，第一赋形剂包括海藻糖和葡聚糖4万，第二缓冲液为三乙醇胺，第二赋形剂包括甘露醇、葡聚糖1万和水溶性淀粉。总胆汁酸测定试剂球的制备方法如下：配制一定量试剂A和试剂B；将试剂A和试剂B的液滴滴在液氮中形成第一冰球和第二冰球，且第一冰球和第二冰球的体积约为3.0ul的冰球；将第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥制得所述总胆汁酸测定试剂球。并采用该总胆汁酸测定试剂球置于芯片本体中制得总胆汁酸检测芯片。
具体的，本实施例中，试剂A包括以下组份：甘氨酸3.00g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型6.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.50g/L、吐温20 8.00g/L、海藻糖80g/L和葡聚糖4万10g/L；试剂B包括以下组份：三乙醇胺35.00g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶8.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、葡聚糖1万10g/L、水溶性淀粉20g/L。
实施例3：
本实施例中，第一缓冲液为甘氨酸，所述第一赋形剂包括海藻糖和聚乙二醇8000，所述第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和葡聚糖4万。总胆汁酸测定试剂球的制备方法如下：配制一定量试剂A和试剂B；将试剂A和试剂B的液滴滴在液氮中形成第一冰球和第二冰球体积，且第一冰球和第二冰球的体积约为3.5ul的冰球；将第一冰球和第二冰球分别进行冷冻干燥制得总胆汁酸测定试剂球。并采用该总胆汁酸测定试剂球置于芯片本体中制得总胆汁酸检测芯片。
具体的，试剂A包括以下组份：甘氨酸2.50g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型5.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、吐温20 5.00g/L、海藻糖50g/L、聚乙二醇800050g/L；试剂B包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.2g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、海藻糖30g/L、葡聚糖4万10g/L。
下面结合表格对本发明实施例1所得总胆汁酸测定试剂球(或总胆汁酸检测芯片)的性能进行说明。需要说明的是，通过深圳市锦瑞生物有限公司生产的vp10便携式生化分析仪检测37℃下，注入血清样本的检测芯片在405nm波长吸光度的变化值。使用英国朗道公司提供的校准品进行定标，可计算得到血清样本中总胆汁酸的浓度。
1)、精密度测试：采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片测试已知总胆汁酸浓度为45.3umol/L的血清样本中的总胆汁酸浓度20次，并通过以下公式计算测得浓度值的平均值
Figure BDA0002541619880000091
标准差(SD)和变异系数(CV)：
Figure BDA0002541619880000101
Figure BDA0002541619880000102
Figure BDA0002541619880000103
其中，Xi为第i次测得浓度值，n为测试次数。
得到测试同一血清样本20次获得的测得浓度值的平均值
Figure BDA0002541619880000104
Figure BDA0002541619880000105
标准差SD＝0.792，变异系数CV＝1.76％。通常，若标准差较大，代表大部分测试结果和其平均值之间差异较大；若标准差较小，则代表这些测试结果较接近平均值。
2)、准确度测试：采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片测试已知总胆汁酸浓度为23.6umol/L的血清样本三次，获取测得的总胆汁酸浓度值，计算出3次测得总胆汁酸浓度值的平均值为23.4umol/L，相对偏差为-0.85％。
3)、临床相关性分析：
采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片与Abaxis试剂盘同时检测对多个不同总胆汁酸浓度的血清样本的总胆汁酸含量。相应的测得总胆汁酸浓度值(单位umol/L)如表一所示，表一中，X列数值为Abaxis试剂盘测得的血清样品中的总胆汁酸浓度，Y列数值为本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片测得的血清样品中的总胆汁酸浓度。例如，对于1号血清样本，采用为Abaxis试剂盘测试的总胆汁酸浓度为19.1umol/L，而采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片测试的1号血清样本中的总胆汁酸浓度为19.7umol/L。
表一：
Figure BDA0002541619880000106
Figure BDA0002541619880000111
通过表一中的数据可以得到本发明实施例提供的总胆汁酸检测芯片与Abaxis试剂盘的两组测试结果之间的相关方程如下：
Y＝1.0024X-0.1057
相关系数R＝0.9997，相关系数越接近1代表两组数据之间的相关性越强。因此，本发明实施例提供的总胆汁酸检测芯片与Abaxis试剂盘的测试结果相关性强。
4)、线性范围测试
测试方法如下：用接近线性范围上限的高浓度(活性)样本和接近线性范围下限的低浓度(活性)样本，按表二所示混合成6个稀释浓度的血清样本。
表二：
样本号 1 2 3 4 5 6
高浓度(活性)血清样本 0份 1份 2份 3份 4份 5份
低浓度(活性)样本 5份 4份 3份 2份 1份 0份
采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片分别测试6个血清样本的总胆汁酸浓度，每个血清样本测试3次，分别求出6个血清样本中总胆汁酸测得浓度值的平均值(yi)。以每个样本稀释后的浓度(xi)为自变量，以每个样本的测得浓度值均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(4)计算线性回归的相关系数r；公式(4)如下：
Figure BDA0002541619880000121
其中，n为测定样品的数量，xi为稀释浓度，yi为测定结果的平均值。
用稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。
通常，要求在[2umol/L，180umol/L]区间内，其线性相关系数r≥0.990。同时，相对偏差或绝对偏差应符合表三中的要求。
表三：
Figure BDA0002541619880000122
表四为表二中1号至6号血清样本稀释后总胆汁酸的实际浓度和采用本发明实施例1提供的总胆汁酸检测芯片对1号至6号血清样本进行检测后测得的测试浓度值和分析结果。
表四：
Figure BDA0002541619880000131
5)、热稳定性测试
在8％空气湿度环境中，将本发明实施例1提供的总胆汁酸检测试剂球装入芯片本体内形成多个检测芯片，并包装袋进行密封。将多个检测芯片在37℃避光环境中贮存0、2、3、4、6和8天后，分别对英国朗道公司提供的两组质控品(样本1和样本2)中的总胆汁酸浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位：umol/L)，从而分析检测芯片的检测准确度。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在10.0％以内。表5和表6分别为存储不同时间后的检测芯片对样本1和样本2中总胆汁酸浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，靶值为样本1和样本2中总胆汁酸的实际浓度。从表5和表6中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在环境中储存2、3、4、6或8天后，相对偏差的绝对值仍在10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片稳定性好，在环境中储存多天后仍能确保其检测结果的准确性。
表5：
样本1 1 2 3 平均值 靶值 相对偏差
0天 46.7 45.4 44.8 45.63 45.3 0.73％
2天 45.1 46.2 44.5 45.29 45.3 -0.02％
3天 45.7 44.5 45.6 45.26 45.3 -0.09％
4天 41.2 44.1 44.4 43.23 45.3 -4.56％
6天 43.7 41.7 44.3 43.23 45.3 -4.58％
8天 41.2 44.0 45.9 43.66 45.3 -3.62％
表6：
样本2 1 2 3 平均值 靶值 相对偏差
0天 23.0 23.7 24.4 23.69 23.6 0.37％
2天 21.6 22.1 22.2 21.95 23.6 -6.98％
3天 21.0 21.5 21.9 21.50 23.6 -8.92％
4天 21.4 21.6 21.2 21.41 23.6 -9.30％
6天 21.2 21.5 21.9 21.52 23.6 -8.80％
8天 21.3 21.5 22.2 21.70 23.6 -8.07％
现有的胆汁酸检测试剂热稳定性较差，37度高温环境下保存1天即检测浓度下降80％，本发明实施例提供的胆汁酸检测试剂球热稳定性好，37度高温环境下可保存8天，在存储过程中不易变质。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述总胆汁酸测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球；
所述方法包括：
将试剂A的液滴滴在液氮中，使所述试剂A的液滴形成第一冰球；
将试剂B的液滴滴在液氮中，使所述试剂B的液滴形成第二冰球；
将所述第一冰球进行冷冻干燥制得所述第一试剂球；
将所述第二冰球进行冷冻干燥制得所述第二试剂球；其中，
所述试剂A包括以下组份：第一缓冲液20umol/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸4.0-8.0g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L、吐温20 5.00-10.00g/L和第一赋形剂80-150g/L；
所述试剂B包括以下组份：第二缓冲液200umol/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00-4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.0-10.0KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00-2.00g/L和第二赋形剂80-150g/L。
2.根据权利要求1所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一冰球和所述第二冰球的体积为2.5-3.5ul。
3.根据权利要求1所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述将试剂A的液滴滴在液氮中之前，所述方法还包括：配制所述试剂A；
所述配置所述试剂A包括以下步骤：
将所述第一缓冲液加入盛有水的容器中；
待所述第一缓冲液在水中溶解完全后，往所述容器中加入所述乙二胺四乙酸二钠、所述β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸和所述聚乙二醇单辛基苯基醚；
调节所述容器中溶液的PH值至4.5；
往所述容器中加入所述第一赋形剂。
4.根据权利要求1所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述将试剂B滴在液氮中之前，所述方法还包括：配制所述试剂B；
所述配置所述试剂B包括以下步骤：
将所述第二缓冲液加入盛有水的容器中；
待所述第二缓冲液在水中溶解完全后，往所述容器中加入所述牛血清白蛋白、所述聚乙二醇6000、所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和所述聚乙二醇单辛基苯基醚；
调节所述容器中溶液的PH值至8.9；
往所述容器中加入所述第二赋形剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液包括甘氨酸、三乙醇胺、一水合柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液为所述一水合柠檬酸，所述第一赋形剂包括甘露醇和聚乙二醇8000，所述第二缓冲液为所述三羟甲基氨基甲烷，所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和水溶性淀粉；
所述试剂A包括以下组份：一水合柠檬酸4.10g/L、乙二胺四乙酸二1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸8.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、吐温20 10.00g/L、甘露醇50g/L、聚乙二醇800050g/L；
所述试剂B包括以下组份：
三羟甲基氨基甲烷24.20g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸4.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶10.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚2.00g/L、甘露醇50g/L、海藻糖50g/L、水溶性淀粉20g/L。
7.根据权利要求5所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液为所述甘氨酸，所述第一赋形剂包括海藻糖和葡聚糖4万，所述第二缓冲液为所述三乙醇胺，所述第二赋形剂包括甘露醇、葡聚糖1万和水溶性淀粉；
所述试剂A包括以下组份：甘氨酸3.00g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型6.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.50g/L、吐温20 8.00g/L、海藻糖80g/L和葡聚糖4万10g/L；
所述试剂B包括以下组份：三乙醇胺35.00g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶8.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、葡聚糖1万10g/L、水溶性淀粉20g/L。
8.根据权利要求5所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液为所述甘氨酸，所述第一赋形剂包括海藻糖和聚乙二醇8000，所述第二缓冲液为所述三羟甲基氨基甲烷，所述第二赋形剂包括甘露醇、海藻糖和葡聚糖4万；
所述试剂A包括以下组份：甘氨酸2.50g/L、乙二胺四乙酸二钠1.56g/L、β-硫烟酰胺腺苷二核苷酸氧化型5.00g/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、吐温20 5.00g/L、海藻糖50g/L、聚乙二醇800050g/L；
所述试剂B包括以下组份：三羟甲基氨基甲烷24.2g/L、牛血清白蛋白0.28g/L、聚乙二醇60005.61g/L、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2.00g/L、3α-羟类固醇脱氢酶6.00KU/L、聚乙二醇单辛基苯基醚1.00g/L、甘露醇80g/L、海藻糖30g/L、葡聚糖4万10g/L。
9.一种应用如权利要求1-8任一所述的总胆汁酸测定试剂球的制备方法制备得到的总胆汁酸测定试剂球。
10.一种总胆汁酸检测芯片，其特征在于，所述总胆汁酸检测芯片包括芯片本体和如权利要求9所述的总胆汁酸测定试剂球，其中，所述总胆汁酸测定试剂球设置于所述芯片本体内部。
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