CN113278675B - 乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、试剂球及微流控芯片 - Google Patents
乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、试剂球及微流控芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、试剂球及微流控芯片，乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，形成第一试剂球的第一试剂液包括：第一缓冲液40‑200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1‑10g/L、第一赋形剂10‑100g/L和稳定剂0.1‑10g/L，形成第二试剂球的第二试剂液包括：第二缓冲液40‑200mmol/L、乳酸盐10‑100g/L、氧化型辅酶I：10‑50g/L、黄递酶20‑100U/L和第二赋形剂10‑100g/L。检测时，将生成的还原型辅酶I(NADH)进一步反应生成有色稳定的甲臜，从而，可以检测490nm波长处的吸光度来定量乳酸脱氢酶的浓度，使得灵敏度大幅提高，此外，该剂量范围的第一赋形剂和第二赋形剂能分别保证第一试剂球和第二试剂球具有较好的形态及复融溶解性，具有较高的稳定性和精密度。
Description
技术领域
本发明实施例涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、试剂球及微流控芯片。
背景技术
乳酸脱氢酶广泛存在于机体中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺等组织中为最多，这些组织中的乳酸脱氢酶的浓度远高于血清中的乳酸脱氢酶的浓度。所以当少量组织坏死时，坏死组织中的乳酸脱氢酶释放入血液使得血液中脱酸脱氢酶的浓度升高。因此，临床上常通过测定乳酸脱氢酶的浓度，以对心梗、肝病和某些恶性肿瘤进行辅助诊断。
目前，临床上，通常采用L-P速率法测定血清中乳酸脱氢酶的浓度，在L-P速率法中，试剂中的氧化型辅酶I(NAD+)会转化为还原型辅酶I(NADH)，基于乳酸脱氢酶的浓度与还原型辅酶I(NADH)的生成量呈正比，通过监测还原型辅酶I(NADH)的生成量以测定乳酸脱氢酶的浓度。然而，还原型辅酶I(NADH)的活性容易受各种因素的干扰，其自身易被氧化，直接影响乳酸脱氢酶的测定结果，检测准确性低，灵敏度低。此外，还需依赖大型全自动生化分析仪，难以应用在病人身边快速诊断，即POCT诊断。虽然，现有用于检测其它项目的冻干试剂球，但是，现有的冻干试剂球形态较差，难以完全冻干，导致其具有较低的稳定性和准确性。
发明内容
本发明实施例主要解决的技术问题是提供一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、乳酸脱氢酶测定试剂球及微流控芯片，采用该方法制备得到的乳酸脱氢酶测定试剂球具有较高的灵敏度、较好的形态及复融溶解性，同时，还具有较高的稳定性和准确度。
为解决上述技术问题，第一方面，本发明实施例中提供给了一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，所述乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球；
所述方法包括：
分别配置第一试剂液和第二试剂液；
将所述第一试剂液的液滴滴在液氮中，形成第一冰球，将所述第二试剂液的液滴滴在液氮中，形成第二冰球；
将所述第一冰球冷冻干燥制得所述第一试剂球，将所述第二冰球冷冻干燥制得所述第二试剂球；
其中，所述第一试剂液包括以下组分：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、第一赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的PH值在第一预设范围内；
所述第二试剂液包括以下组分：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和第二赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的PH值在第二预设范围内。
在一些实施例中，所述配置第一试剂液的步骤包括：
将所述第一缓冲液加入第一预设定量的水中；
待所述第一缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述碘硝基氯化四氮唑蓝，得到第一溶液，并调节所述第一溶液的PH值至第三预设范围内，其中，所述第三预设范围与所述第一预设范围存在交集，所述第三预设范围的下限大于所述第一预设范围的下限，所述第三预设范围的上限大于所述第一预设范围的上限；
将所述第一赋形剂和所述稳定剂依次加入所述第一溶液中，得到第二溶液，并调节所述第二溶液的PH值至所述第一预设范围内，将第二预设定量的水加入所述第二溶液中，得到第三预设定量的所述第一试剂液。
在一些实施例中，所述配置第二试剂液的步骤包括：
将所述第二缓冲液加入第一预设定量的水中；
待所述第二缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述乳酸盐，得到第三溶液，并调节所述第三溶液的PH值至第四预设范围内，其中，所述第四预设范围与所述第二预设范围存在交集，所述第四预设范围的下限大于所述第二预设范围的下限，所述第四预设范围的上限大于所述第二预设范围的上限；
将所述第二赋形剂加入所述第三溶液中，得到第四溶液，并调节所述第四溶液的PH值至所述第二预设范围内，依次将所述氧化型辅酶I、所述黄递酶、第二预设定量的水加入所述第四溶液中，得到第三预设定量的所述第二试剂液。
在一些实施例中，所述第一缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种；和/或，
所述第二缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种。
在一些实施例中，所述稳定剂包括六水氯化镁，氯化钾，海藻糖，蔗糖，牛血清白蛋白，螯合剂EDTA中的至少一种。
在一些实施例中，所述第一赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种；和/或，
所述第二赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种。
在一些实施例中，所述第一预设范围为7.0-8.0，所述第二预设范围为8.0-9.0。
为解决上述技术问题，第二方面，本发明实施例中提供给了一种乳酸脱氢酶测定试剂球，采用如上第一方面所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法制备得到。
为解决上述技术问题，第三方面，本发明实施例中提供给了一种微流控芯片，包括芯片本体和如上第二方面所述的乳酸脱氢酶测定试剂球，其中，所述乳酸脱氢酶测定试剂球设置于所述芯片本体内部。
为解决上述技术问题，第四方面，本发明实施例中提供给了一种生化分析仪，包括分析仪本体、反应槽以及如上第三方面所述的微流控芯片，其中，所述反应槽开设于所述分析仪本体内，所述微流控芯片安装于所述反应槽。
本发明实施例的有益效果：区别于现有技术的情况，本发明实施例提供的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、乳酸脱氢酶测定试剂球和微流控芯片，其中，乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，形成第一试剂球的第一试剂液的组分包括：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的PH值在第一预设范围内，形成第二试剂球的第二试剂液的组分包括：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的PH值在第二预设范围内。当检测样本(例如血清)与乳酸脱氢酶测定试剂球接触溶解时，乳酸在乳酸脱氢酶催化作用下生成丙酮酸的过程中氧化型辅助酶I(NAD+)会生成还原型辅酶I(NADH)，还原型辅酶I(NADH)进一步与碘硝基氯化四氮唑蓝在黄递酶的催化作用下，生成有色稳定的甲臜，基于甲臜在490nm波长处有吸收峰，从而，可以检测490nm波长处的吸光度来定量乳酸脱氢酶的浓度，该方法检测的吸光度远高于检测还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的吸光度，从而，使得乳酸脱氢酶测定试剂球的灵敏度得到大幅提高，此外，该剂量范围的第一赋形剂和第二赋形剂能够分别保证第一试剂球和第二试剂球具有较好的形态及复融溶解性，从而，具有较高的稳定性和精密度。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
图1为本发明一实施例提供的乳酸脱氢酶测定试剂球制备方法的流程示意图；
图2为图1中所示配置第一试剂液的子流程示意图；
图3为图1中所示配置第二试剂液的子流程示意图；
图4为临床相关性分析中相关方程的拟合线示意图；
图5为线性范围测试中相关方程的拟合线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例中的各个特征可以相互结合，均在本申请的保护范围之内。另外，虽然在装置示意图中进行了功能模块划分，在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于装置中的模块划分，或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。此外，本文所采用的“第一”、“第二”、“第三”等字样并不对数据和执行次序进行限定，仅是对功能和作用基本相同的相同项或相似项进行区分。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例提供一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，请参阅图1，该方法包括如下步骤：
S10：分别配置第一试剂液和第二试剂液。
其中，第一试剂液包括以下组分：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、第一赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的PH值在第一预设范围内。第二试剂液包括以下组分：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和第二赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的PH值在第二预设范围内。
在配置第一试剂液时，分别量取第一缓冲液、碘硝基氯化四氮唑蓝、第一赋形剂和稳定剂，与一定量的水充分混合，得到第一试剂液。可以采用PH试纸等方法测试该第一试剂液的PH值，并通过加入氢氧化钠调节该第一试剂液的PH值至第一预设范围内，使得该第一试剂液符合乳酸脱氢酶测定所需的碱性环境。
为了使得第一试剂液中各组分混合充分以及含量准确，请参阅图2，在一些实施例中，配置第一试剂液的步骤包括：
S11：将所述第一缓冲液加入第一预设定量的水中。
S12：待所述第一缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述碘硝基氯化四氮唑蓝，得到第一溶液，并调节所述第一溶液的PH值至第三预设范围内，其中，所述第三预设范围与所述第一预设范围存在交集，所述第三预设范围的下限大于所述第一预设范围的下限，所述第三预设范围的上限大于所述第一预设范围的上限。
S13：将所述第一赋形剂和稳定剂依次加入所述第一溶液中，得到第二溶液，并调节所述第二溶液的PH值至所述第一预设范围内，将第二预设定量的水加入所述第二溶液中，得到第三预设定量的所述第一试剂液。
具体的，在1L烧杯中加入800ml的水，即第一预设定量为800ml，称取第一缓冲液，加入该盛有800ml水的烧杯中，待第一缓冲液在水中完全后溶解后，加入碘硝基氯化四氮唑蓝，得到第一溶液。可以采用PH试纸等方法测试该第一溶液的PH值，并通过加入氢氧化钠调节该第一溶液的PH值至第三预设范围内。其中，第三预设范围与第一预设范围存在交集，第三预设范围的下限大于第一预设范围的下限，第三预设范围的上限大于所述第一预设范围的上限，例如，第一预设范围为7.0-8.0，第三预设范围为7.5-8.5，也即，第三预设范围为预调节，一方面，为后续加入的第一赋形剂和稳定剂提供碱性环境，使之能保持活性，另一方面，通过两次调节PH值，使得第一试剂液的PH能更准确落于该第一预设范围内。
然后，将第一赋形剂和稳定剂依次加入第一溶液中，得到第二溶液，并调节该第二溶液的PH值至所述第一预设范围内，最后，加入第二预设定量的水以将烧杯中的溶液定容至1L，即得到1L(第三预设定量)的第一试剂液。
基于调节PH值时加入的氢氧化钠的量未定，一次确定加入水的量，容易导致后续总量(即第三预设定量)超标，使得各组分的含量不准确。在此实施例中，通过两次加入预设定量的水，有益于配制出各组分准确的第一试剂液，并且各组分分批次加入，使得各组分能够混合均匀，有利于第一试剂液的稳定性，提高检测精度。此外，通过两次调节PH值，使得第一试剂液的PH能更准确落于该第一预设范围内。
同理，为了使得第二试剂液中各组分混合充分以及含量准确，请参阅图3，在一些实施例中，配置第二试剂液的步骤包括：
S14：将所述第二缓冲液加入第一预设定量的水中。
S15：待所述第二缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述乳酸盐，得到第三溶液，并调节所述第三溶液的PH值至第四预设范围内，其中，所述第四预设范围与所述第二预设范围存在交集，所述第四预设范围的下限大于所述第二预设范围的下限，所述第四预设范围的上限大于所述第二预设范围的上限。
S16：将所述第二赋形剂加入所述第三溶液中，得到第四溶液，并调节所述第四溶液的PH值至所述第二预设范围内，依次将所述氧化型辅酶I、所述黄递酶、第二预设定量的水加入所述第四溶液中，得到第三预设定量的所述第二试剂液。
具体的，在1L烧杯中加入800ml的水，即第一预设定量为800ml，称取第二缓冲液，加入该盛有800ml水的烧杯中，待第二缓冲液在水中完全后溶解后，加入乳酸盐，得到第三溶液。可以采用PH试纸等方法测试该第三溶液的PH值，并通过加入氢氧化钠调节该第三溶液的PH值至第四预设范围内。其中，所述第四预设范围与所述第二预设范围存在交集，所述第四预设范围的下限大于所述第二预设范围的下限，所述第四预设范围的上限大于所述第二预设范围的上限，例如，第二预设范围为8.0-9.0，第四预设范围为8.5-9.5，也即，第四预设范围为预调节，一方面，为后续加入的第二赋形剂提供碱性环境，使之能保持活性，另一方面，通过两次调节PH值，使得第二试剂液的PH能更准确落于该第二预设范围内。
然后，将第二赋形剂加入第三溶液中，得到第四溶液，并调节该第四溶液的PH值至所述第二预设范围内，随后，依次加入氧化型辅酶I、黄递酶，最后，加入第二预设定量的水，以将烧杯中的溶液定容至1L，即得到1L(第三预设定量)的第二试剂液。
基于调节PH值时加入的氢氧化钠的量未定，一次确定加入水的量，容易导致后续总量(即第三预设定量)超标，使得各组分的含量不准确。在此实施例中，通过两次加入预设定量的水，有益于配制出各组分准确的第二试剂液，并且各组分分批次加入，使得各组分能够混合均匀，有利于第二试剂液的稳定性，提高检测精度。此外，通过两次调节PH值，使得第二试剂液的PH能更准确落于该第二预设范围内。
在一些实施例中，第一缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种。可以理解的是，第一缓冲液为第一试剂液提供碱性环境，以使第一试剂液中的其它组分能发挥有效作用。
在一些实施例中，第二缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种。可以理解的是，第二缓冲液为第二试剂液提供碱性环境，以使第二试剂液中的其它组分能发挥有效作用。
在一些实施例中，稳定剂包括六水氯化镁，氯化钾，海藻糖，蔗糖，牛血清白蛋白，螯合剂EDTA中的至少一种。稳定剂用于使得第一试剂液具有良好的稳定性，从而，使得第一试剂球具有良好的稳定性。
在一些实施例中，乳酸盐可以为乳酸锂，提供用于检测反应的乳酸分子。
在一些实施例中，第一赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种。其中，第一赋形剂不会与其它组分发生反应，性质稳定，不产生副作用，即不会影响第一试剂液的精度。并且，该剂量范围的第一赋形剂能够赋予第一试剂球良好的外观，使第一试剂球疏松，易于复溶，从而，能够保证第一试剂球的形态及复融溶解性，良好的形态有益于第一试剂球完全冻干。
在一些实施例中，第二赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种。其中，第二赋形剂不会与其它组分发生反应，性质稳定，不产生副作用，即不会影响第二试剂液的精度。并且，该剂量范围的第二赋形剂能够赋予第二试剂球良好的外观，使第二试剂球疏松，易于复溶，从而，能够保证第二试剂球的形态及复融溶解性，良好的形态有益于第二试剂球完全冻干。
S20：将所述第一试剂液的液滴滴在液氮中，形成第一冰球，将所述第二试剂液的液滴滴在液氮中，形成第二冰球。
在配制好第一试剂液后，可以通过点胶机将第一试剂液的液滴滴在液氮中，使液滴在液氮中凝结成第一冰球。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的第一试剂液的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整第一冰球的体积。可选的，在一些实施例中，第一冰球的体积为2.5ul-3.5ul。
同理，在配制好第二试剂液后，可以通过点胶机将第二试剂液的液滴滴在液氮中，使液滴在液氮中凝结成第二冰球。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的第二试剂液的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整第二冰球的体积。可选的，在一些实施例中，第二冰球的体积为2.5ul-3.5ul。
S30：将所述第一冰球冷冻干燥制得所述第一试剂球，将所述第二冰球冷冻干燥制得所述第二试剂球。
在获得第一冰球和第二冰球后，将第一冰球和第二冰球置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，获得乳酸脱氢酶测定试剂球，可以理解的是，乳酸脱氢酶测定试剂球为一种双试剂球。待氮气复压后将乳酸脱氢酶测定试剂球收集并保存在干燥的铝瓶中。
其中，冷冻干燥是指将第一冰球和第二冰球预先进行降温冻结成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使第一冰球和第二冰球低温脱水而达到干燥目的。冷冻干燥后，第一冰球和第二冰球中除水外的各组分本身留在冻结时的冰架中，因此冷冻干燥后的第一冰球和第二冰球疏松多孔且体积不变，由于第一冰球和第二冰球干燥前始终处于冻结状态，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象。冷冻干燥后得到的第一试剂球和第二试剂球构成乳酸脱氢酶测定试剂球，分别呈海绵状疏松多孔，体积基本与干燥前的第一冰球和第二冰球分别保持不变，极易溶于水而恢复原状。
本发明实施例提供的乳酸脱氢酶测定试剂球的检测原理如下：将检测样本(如血清)，与乳酸脱氢酶测定试剂球接触相溶，从而，乳酸盐中的乳酸分子在乳酸脱氢酶催化作用下生成丙酮酸，在此过程中，氧化型辅酶I(NAD+)作为氢(H+)受体，生成还原型辅酶I(NADH)，还原型辅酶I(NADH)进一步与碘硝基氯化四氮唑蓝在黄递酶的催化作用下，生成氧化型辅酶I(NAD+)和有色稳定的甲臜。基于甲臜在490nm波长下产生吸收峰且甲臜的生成速率(由吸光度变化反映)与乳酸脱氢酶浓度呈线性正相关，从而，采用分光光度法，在490nm处连续监测甲臜的生成量，即可测得检测样本中乳酸脱氢酶的浓度。
在上述检测原理中，基于甲臜在490nm波长处的吸光度远高于传统方法中还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的吸光度，从而，使得乳酸脱氢酶测定试剂球的灵敏度得到大幅提高。此外，该剂量范围的第一赋形剂和第二赋形剂能够分别赋予第一试剂球和第二试剂球良好的外观，使第一试剂球和第二试剂球疏松，易于复溶，从而，能够保证第一试剂球和第二试剂球的形态及复融溶解性，良好的形态有益于第一试剂球和第二试剂球完全冻干，从而，使得乳酸脱氢酶测定试剂球具有较好的形态及复融溶解性，还具有较高的稳定性和精密度。
在本实施例中，乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，形成第一试剂球的第一试剂液的组分包括：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的PH值在第一预设范围内，形成第二试剂球的第二试剂液的组分包括：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的PH值在第二预设范围内。当检测样本(例如血清)与乳酸脱氢酶测定试剂球接触溶解时，乳酸在乳酸脱氢酶催化作用下生成丙酮酸的过程中氧化型辅助酶I(NAD+)会生成还原型辅酶I(NADH)，还原型辅酶I(NADH)进一步与碘硝基氯化四氮唑蓝在黄递酶的催化作用下，生成有色稳定的甲臜，从而，可以检测490nm波长处的吸光度来定量乳酸脱氢酶的浓度，该方法检测的吸光度远高于检测还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的吸光度，从而，使得乳酸脱氢酶测定试剂球的灵敏度得到大幅提高，此外，该剂量范围的第一赋形剂和第二赋形剂能够分别保证第一试剂球和第二试剂球具有较好的形态及复融溶解性，从而，具有较高的稳定性和精密度。
本发明实施例还提供了一种乳酸脱氢酶测定试剂球，该乳酸脱氢酶测定试剂球采用如上实施例中乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法制备得到，与由上实施例中乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法制备得到的乳酸脱氢酶测定试剂球具有相同的结构和功能，在此不再一一赘述。
本发明实施例还提供了一种微流控芯片，该微流控芯片包括芯片本体和上述任一实施例提供的乳酸脱氢酶测定试剂球，其中，乳酸脱氢酶测定试剂球设置于芯片本体内部。在一些实施例中，芯片本体由注塑成型的塑料基底和光学膜通过粘结胶层粘贴而成，芯片本体包括样本槽、稀释液槽、定量槽、混合槽、废液槽、液流通道和比色孔等结构。芯片本体还包括多个可存放试剂球的比色孔，检测样本进入比色孔后与乳酸脱氢酶测定试剂球发生化学反应。
本发明实施例还提供了一种生化分析仪，包括分析仪本体、反应槽以及如上所述的微流控芯片，其中，反应槽开设于分析仪本体内，微流控芯片可安装于反应槽，从而，能够对微流控芯片中的检测样本进行分析检测。其中，微流控芯片与上述各实施例中微流控芯片的结构和作用完全相同，在此不再一一赘述。
为进一步阐述本发明的技术方案，以下提供本发明的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法的若干实施例。
实施例1：
在本实施例中，第一缓冲液包括Tris缓冲液，稳定剂包括六水氯化镁、氯化钾和海藻糖，第一赋形剂包括水溶性淀粉。第二缓冲液包括Tris缓冲液，乳酸盐为乳酸锂，第二赋形剂包括海藻糖和葡聚糖4万。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第一试剂球的制备方法如下：将一定量的Tris缓冲液、碘硝基氯化四氮唑蓝、六水氯化镁、氯化钾、海藻糖、水溶性淀粉和水混合形成第一试剂液，并调整该第一试剂液的PH值为7.0，将第一试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为2.5ul的第一冰球，将该第一冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球。
其中，第一试剂液包括以下组分：Tris缓冲液40-200mmol/L，碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L，六水氯化镁0.1-10g/L，氯化钾0.1-10g/L，海藻糖10-100g/L，水溶性淀粉10-100g/L。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第一试剂球的制备方法如下：将一定量的Tris缓冲液、乳酸锂、氧化型辅酶I、黄递酶、海藻糖、葡聚糖4万和水混合形成第二试剂液，并调整该第二试剂液的PH值为8.0，将第二试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为2.5ul的第二冰球，将该第二冰球进行冷冻干燥制得第二试剂球。
其中，第二试剂液包括以下组分：Tris缓冲液40-200mmol/L，乳酸锂10-100g/L，氧化型辅酶I(10-50g/L)，黄递酶20-100U/L，海藻糖0.1-10g/L，葡聚糖4万10-100g/L。
将该乳酸脱氢酶测定试剂球(第一试剂球和第二试剂球)封装于芯片本体中，制得微流控芯片。
实施例2：
在本实施例中，第一缓冲液包括咪唑缓冲液，稳定剂包括氯化钠、氯化钾，第一赋形剂包括海藻糖。第二缓冲液包括咪唑缓冲液，乳酸盐为乳酸锂，第二赋形剂包括蔗糖和葡聚糖1万。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第一试剂球的制备方法如下：将一定量的咪唑缓冲液、碘硝基氯化四氮唑蓝、氯化钠、氯化钾、海藻糖和水混合形成第一试剂液，并调整该第一试剂液的PH值为7.5，将第一试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为3.0ul的第一冰球，将该第一冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球。
其中，第一试剂液包括以下组分：咪唑缓冲液40-200mmol/L，碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L，氯化钠0.1-10g/L，氯化钾0.1-10g/L，海藻糖10-100g/L。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第一试剂球的制备方法如下：将一定量的咪唑缓冲液、乳酸锂、氧化型辅酶I、黄递酶、蔗糖、葡聚糖1万和水混合形成第二试剂液，并调整该第二试剂液的PH值为8.5，将第二试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为3.0ul的第二冰球，将该第二冰球进行冷冻干燥制得第二试剂球。
其中，第二试剂液包括以下组分：咪唑缓冲液40-200mmol/L，乳酸锂10-100g/L，氧化型辅酶I(10-50g/L)，黄递酶20-100U/L，蔗糖0.1-10g/L，葡聚糖1万10-100g/L。
将该乳酸脱氢酶测定试剂球(第一试剂球和第二试剂球)封装于芯片本体中，制得微流控芯片。
实施例3：
在本实施例中，第一缓冲液包括磷酸盐缓冲液，稳定剂包括氯化钾和蔗糖，第一赋形剂包括水溶性淀粉。第二缓冲液包括磷酸盐缓冲液，乳酸盐为乳酸锂，第二赋形剂包括海藻糖和甘露醇。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第一试剂球的制备方法如下：将一定量的磷酸盐缓冲液、碘硝基氯化四氮唑蓝、氯化钾、蔗糖、水溶性淀粉和水混合形成第一试剂液，并调整该第一试剂液的PH值为8.0，将第一试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为3.5ul的第一冰球，将该第一冰球进行冷冻干燥制得第一试剂球。
其中，第一试剂液包括以下组分：磷酸盐缓冲液40-200mmol/L，碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L，氯化钾0.1-10g/L，蔗糖0.1-10g/L，水溶性淀粉10-100g/L。
乳酸脱氢酶测定试剂球中第二试剂球的制备方法如下：将一定量的磷酸盐缓冲液、乳酸锂、氧化型辅酶I、黄递酶、海藻糖、甘露醇和水混合形成第二试剂液，并调整该第二试剂液的PH值为9.0，将第二试剂液的液滴滴在液氮中形成体积约为3.5ul的第二冰球，将该第二冰球进行冷冻干燥制得第二试剂球。
将该乳酸脱氢酶测定试剂球(第一试剂球和第二试剂球)封装于芯片本体中，制得微流控芯片。
下面结合具体的测试对比实验，对本发明实施例1中制备得到的乳酸脱氢酶测定试剂球的性能进行说明。
在空气湿度8％的环境中，将实施例1中的乳酸脱氢酶测定试剂球装入微流控芯片的芯片本体内，向该微流控芯片中注入检测样本，然后，使用深圳市锦瑞生物有限公司便携式自动生化分析仪vp10进行检测，检测37℃下490nm波长吸光度的变化值。并使用英国朗道公司提供的校准品进行定标，可计算得到检测样本中乳酸脱氢酶浓度。
1)精密度测试：采用本发明实施例1提供的微流控芯片检测已知乳酸脱氢酶浓度的检测样本1#，该检测样本1#的乳酸脱氢酶浓度为170U/L，检测20次，得到20个检测到的浓度值。
计算这20个浓度值的均值、标准差和变异系数，得到均值为171.18U/L，标准差SD＝3.36，变异系数CV＝1.98％。
可知，测得浓度(171.18U/L)与实际浓度(170U/L)十分接近，准确度高，并且，标准差和变异系数均较小，说明乳酸脱氢酶测定试剂球的稳定性好。
2)准确度测试：采用本发明实施例1提供的微流控芯片，测试已知乳酸脱氢酶浓度为178U/L的检测样本2#，重复检测三次，获得浓度值，计算出3次测得的浓度值的平均值为180.10U/L，相对偏差为1.18％。
可知，测得浓度(180.10U/L)与实际浓度(178U/L)接近，准确度高，并且，相对偏差较小。
3)临床相关性分析
准备不同乳酸脱氢酶浓度的血清样本集A1，即A1包括若干份不同乳酸脱氢酶浓度的血清样本，采用实施例1中的微流控芯片检测样本集A1中各血清样本的乳酸脱氢酶浓度，以及，采用自动化分析仪日立7180检测样本集A1中各血清样本的乳酸脱氢酶浓度。检测结果如表1所示，对于同一浓度的样本编号1，采用自动化分析仪日立7180测得的乳酸脱氢酶浓度为987.00U/L，采用本发明实施例1提供的微流控芯片测得的乳酸脱氢酶浓度为994.75U/L。
表1临床相关性分析的检测结果
将表1中日立7180对应的检测浓度值作为X轴的值，将微流控芯片对应的检测浓度值作为Y轴的值，得到两组检测结果之间的相关方程如下：
Y＝0.9837x+6.2213；
该相关方程的拟合线如图4所示，其中，相关系数R＝0.9970，相关系数越接近1代表两组数据之间的相关性越强。因此，本发明实施例提供的微流控芯片与日立7180的测试结果相关性强。
4)线性范围测试
测试方法如下：用接近线性范围([50，3000]U/L)上限的高浓度(活性)样本和接近线性范围下限的低浓度(活性)样本，按表2所示混合成6个稀释浓度的血清样本。
表2
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 高浓度(活性)样本 | 0份 | 1份 | 2份 | 3份 | 4份 | 5份 |
| 低浓度(活性)样本 | 5份 | 4份 | 3份 | 2份 | 1份 | 0份 |
采用本发明实施例1提供的微流控芯片分别测试6个血清样本的乳酸脱氢酶浓度，每个血清样本测试3次，分别求出6个血清样本中乳酸脱氢酶测得浓度值的平均值(yi)。以每个样本稀释后的浓度(xi)为自变量，以每个样本的测得浓度值均值(yi)为因变量求出线性回归方程，如下：
Y＝1.0125x-9.831
该相关方程的拟合线如图5所示，其中，相关系数R＝0.9998，相关系数R越接近1，则说明采用本发明实施例中微流控芯片测得的结果与稀释后的实际结果越接近，即测得值接近实际值。通常，当试剂盒检测LDH浓度在[50，3000]U/L区间内的检测样本时，其线性相关性系数R≥0.990，则满足要求。本发明实施例提供的微流控芯片具有较高的准确度，另一方面，对于不同浓度的样本，都能准确测到，线性范围好。
5)热稳定性测试
在空气湿度8％的环境中，将本发明实施例1中的微流控芯片封袋，在37℃避光环境中贮存0、2、3、4、6、8天。以朗道校准品和质控品为检测样本，测试本发明实施例中微流控芯片的准确度，相对偏差应在±10.0％以内。具体的，由朗道公司提供两组质控品(样本1#和样本2#)，分别采用达到上述存储要求后的微流控芯片分别检测样本1#和样本2#，对于同种类的微流控芯片，检测三次。
表3为样本1#通过存储各天数后的微流控芯片检测到的检测结果，表4为样本2#通过存储各天数后的微流控芯片检测到的检测结果。其中，平均值为三次检测到的浓度的平均值，靶值为样本中乳酸脱氢酶浓度的实际浓度。
从表3和表4中可以得出，本发明实施例提供的微流控芯片在环境中存储2、3、4、6和8天后，相对偏差的绝对值仍在10.0％以内，因此，具有较好的热稳定性，在环境中储存多天后仍能确保其检测结果的准确性。
表3样本1#的检测结果
| 样本1# | 1 | 2 | 3 | 平均值 | 靶值(U/L) | 相对偏差 |
| 0天 | 163.90 | 169.97 | 170.98 | 168.28 | 173 | -2.73％ |
| 2天 | 162.89 | 169.97 | 173.00 | 168.62 | 173 | -2.53％ |
| 3天 | 166.93 | 176.03 | 183.11 | 175.36 | 173 | 1.36％ |
| 4天 | 179.07 | 173.00 | 169.97 | 174.01 | 173 | 0.58％ |
| 6天 | 171.99 | 176.03 | 167.94 | 171.99 | 173 | -0.58％ |
| 8天 | 164.91 | 176.03 | 165.92 | 168.96 | 173 | -2.34％ |
表4样本2#的检测结果
| 样本2# | 1 | 2 | 3 | 平均值 | 靶值(U/L) | 相对偏差 |
| 0天 | 338.84 | 338.84 | 343.94 | 340.54 | 347 | -1.86％ |
| 2天 | 348.02 | 357.20 | 354.14 | 353.12 | 347 | 1.76％ |
| 3天 | 339.86 | 351.08 | 343.94 | 344.96 | 347 | -0.59％ |
| 4天 | 338.84 | 349.04 | 345.98 | 344.62 | 347 | -0.69％ |
| 6天 | 351.08 | 340.88 | 351.08 | 347.68 | 347 | 0.20％ |
| 8天 | 348.02 | 352.10 | 356.18 | 352.10 | 347 | 1.47％ |
6)长期稳定性测试
在空气湿度8％的环境中，将本发明实施例1中的微流控芯片封袋，在2-8℃避光环境中贮存0、3、6、9、12、15个月后。以朗道校准品和质控品为检测样本时，测试该微流控芯片的准确度，相对偏差应在±10.0％以内。具体的，由朗道公司提供两组质控品(样本3#和样本4#)，分别采用在2-8℃避光环境中贮存0、3、6、9、12、15个月后的微流控芯片检测样本3#和样本4#，对于同种类的微流控芯片，检测三次。
表5为在2-8℃避光环境中贮存0、3、6、9、12、15个月后的微流控对样本3#的检测结果，表6为在2-8℃避光环境中贮存0、3、6、9、12、15个月后的微流控对样本4#的检测结果。其中，平均值为三次检测到的浓度的平均值，靶值为样本中乳酸脱氢酶的实际浓度。
从表5和表6中可以得出，本发明实施例提供的微流控芯片在环境中存储0、3、6、9、12、15个月后，相对偏差的绝对值仍在10.0％以内，因此，具有较好的长期稳定性，在环境中储存较长时间后仍能确保其检测结果的准确性。
表5样本3#的检测结果
表6样本4#的检测结果
| 样本4# | 1 | 2 | 3 | 平均值 | 靶值(U/L) | 相对偏差 |
| 0个月 | 348.16 | 348.16 | 348.16 | 348.16 | 340 | 2.40％ |
| 3个月 | 335.92 | 345.10 | 340.00 | 340.34 | 340 | 0.10％ |
| 6个月 | 333.88 | 350.20 | 350.20 | 344.76 | 340 | 1.40％ |
| 9个月 | 330.82 | 341.02 | 343.06 | 338.30 | 340 | -0.50％ |
| 12个月 | 350.20 | 348.16 | 347.14 | 348.50 | 340 | 2.50％ |
| 15个月 | 329.80 | 349.18 | 329.80 | 336.26 | 340 | -1.10％ |
7)抗干扰能力
为了验证乳酸脱氢酶测定试剂球的抗干扰能力，采用本发明实施例1中的微流控芯片，测试混入其它干扰物质的样本5#-样本7#。其中，样本5#的乳酸脱氢酶浓度为172U/L，含30mg/dl的抗坏血酸，样本6#的乳酸脱氢酶浓度为172U/L，含40mg/dl的胆红素，样本7#的乳酸脱氢酶浓度为172U/L，含2000mg/dl的甘油三酯。
表7抗干扰测试结果
| 项目类型 | 测值 | 相对偏差 |
| 样本5#(含30mg/dl的抗坏血酸172U/L样本) | 173.40U/L | 0.81％ |
| 样本6#(含40mg/dl的胆红素172U/L样本) | 172.39U/L | 0.23％ |
| 样本7#(含2000mg/dl甘油三酯172U/L样本) | 174.07U/L | 1.21％ |
从抗干扰测试结果可知，检测结果与实际的相对偏差均较小，在1.5％范围内，从而，可以证明本发明实施例1中的微流控芯片具有较好的抗干扰能力，即本发明实施例中的乳酸脱氢酶测定试剂球具有较好的抗干扰能力。
综上所述，本发明实施例提供的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法、乳酸脱氢酶测定试剂球和微流控芯片，其中，乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球，形成第一试剂球的第一试剂液的组分包括：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的PH值在第一预设范围内，形成第二试剂球的第二试剂液的组分包括：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的PH值在第二预设范围内。当检测样本(例如血清)与乳酸脱氢酶测定试剂球接触溶解时，乳酸在乳酸脱氢酶催化作用下生成丙酮酸的过程中氧化型辅助酶I(NAD+)会生成还原型辅酶I(NADH)，还原型辅酶I(NADH)进一步与碘硝基氯化四氮唑蓝在黄递酶的催化作用下，生成有色稳定的甲臜，从而，可以检测490nm波长处的吸光度来定量乳酸脱氢酶的浓度，该方法检测的吸光度远高于检测还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的吸光度，从而，使得乳酸脱氢酶测定试剂球的灵敏度得到大幅提高，此外，该剂量范围的第一赋形剂和第二赋形剂能够分别保证第一试剂球和第二试剂球具有较好的形态及复融溶解性，从而，具有较高的稳定性和精密度。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述乳酸脱氢酶测定试剂球包括第一试剂球和第二试剂球；
所述方法包括：
分别配置第一试剂液和第二试剂液；
将所述第一试剂液的液滴滴在液氮中，形成第一冰球，将所述第二试剂液的液滴滴在液氮中，形成第二冰球；
将所述第一冰球冷冻干燥制得所述第一试剂球，将所述第二冰球冷冻干燥制得所述第二试剂球；
其中，所述第一试剂液包括以下组分：第一缓冲液40-200mmol/L、碘硝基氯化四氮唑蓝0.1-10g/L、第一赋形剂10-100g/L和稳定剂0.1-10g/L，并且，所述第一试剂液的pH值在第一预设范围内，所述第一预设范围为7.0-8.0；
所述第二试剂液包括以下组分：第二缓冲液40-200mmol/L、乳酸盐10-100g/L、氧化型辅酶I：10-50g/L、黄递酶20-100U/L和第二赋形剂10-100g/L，并且，所述第二试剂液的pH值在第二预设范围内，所述第二预设范围为8.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述配置第一试剂液的步骤包括：
将所述第一缓冲液加入第一预设定量的水中；
待所述第一缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述碘硝基氯化四氮唑蓝，得到第一溶液，并调节所述第一溶液的pH值至第三预设范围内，其中，所述第三预设范围与所述第一预设范围存在交集，所述第三预设范围的下限大于所述第一预设范围的下限，所述第三预设范围的上限大于所述第一预设范围的上限；
将所述第一赋形剂和所述稳定剂依次加入所述第一溶液中，得到第二溶液，并调节所述第二溶液的pH值至所述第一预设范围内，将第二预设定量的水加入所述第二溶液中，得到第三预设定量的所述第一试剂液。
3.根据权利要求1所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述配置第二试剂液的步骤包括：
将所述第二缓冲液加入第一预设定量的水中；
待所述第二缓冲液在所述水中完全溶解后，加入所述乳酸盐，得到第三溶液，并调节所述第三溶液的pH值至第四预设范围内，其中，所述第四预设范围与所述第二预设范围存在交集，所述第四预设范围的下限大于所述第二预设范围的下限，所述第四预设范围的上限大于所述第二预设范围的上限；
将所述第二赋形剂加入所述第三溶液中，得到第四溶液，并调节所述第四溶液的pH值至所述第二预设范围内，依次将所述氧化型辅酶I、所述黄递酶、第二预设定量的水加入所述第四溶液中，得到第三预设定量的所述第二试剂液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种；和/或，
所述第二缓冲液包括Tris缓冲液，咪唑缓冲液，磷酸盐缓冲液，二乙醇缓冲液，N-乙酰-D-葡胺缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求1-3任一项所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括六水氯化镁，氯化钾，海藻糖，蔗糖，牛血清白蛋白，螯合剂EDTA中的至少一种。
6.根据权利要求1-3任一项所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法，其特征在于，所述第一赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种；和/或，
所述第二赋形剂包括甘露醇，PEG3350，PEG8000，葡聚糖1万，葡聚糖4万，水溶性淀粉中的至少一种。
7.一种乳酸脱氢酶测定试剂球，其特征在于，采用如权利要求1-6任意一项所述的乳酸脱氢酶测定试剂球的制备方法制备得到。
8.一种微流控芯片，其特征在于，包括芯片本体和如权利要求7所述的乳酸脱氢酶测定试剂球，其中，所述乳酸脱氢酶测定试剂球设置于所述芯片本体内部。
9.一种生化分析仪，其特征在于，包括分析仪本体、反应槽以及如权利要求8所述的微流控芯片，其中，所述反应槽开设于所述分析仪本体内，所述微流控芯片安装于所述反应槽。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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