CN117368454B - 一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡、及制备方法和应用 - Google Patents
一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡、及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包含样本仓、微流通道、定量室、激活剂通道、检测通道、废液仓和微流控芯片，所述样本仓与所述微流通道连通，所述微流通道与所述定量室连通，所述定量室与所述废液仓连通；所述定量室与所述激活剂通道、所述检测通道连通；所述通道含有内源性和外源性激活剂包被的冻干球和氯化钙包被的冻干球；所述冻干球中包含冻干保护剂。本发明提供的冻干球有效解决了冷链运输和低温保存，储存效期短等问题。采用全封闭的配套仪器配合完成检测，期间只需将采集的枸橼酸钠抗凝的静脉全血采血管插入到试剂卡内，可直接操作，操作简便，检测快速。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体而言，涉及一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡、及制备方法和应用。
背景技术
血栓弹力图（Thrombelastograghy，TEG）仪是整体评价凝血和纤溶过程的分析仪。它不需要血标本处理，用少量全血监测血小板，凝血因子、纤维蛋白原、纤溶系统和其他细胞成分之间的相互作用，准确的提供病人的凝血概况。它能够动态反映凝血因子、纤维蛋白、血小板功能及纤溶情况。
TEG于1948年由Hartert发明，20世纪80年代开始应用于临床，现已成为临床上监测凝血功能的重要检查方法。TEG的出现是个性化凝血的里程碑，使得各科能够更加合理应用，在血资源日益紧张的今天，其地位必将更加重要。目前常规凝血功能检测（如：PT，APTT）只能检测血浆中凝血因子活性，反映凝血过程中某一阶段或某种凝血产物。凝血过程中血小板与凝血因子相互作用，无血小板参与的凝血检测不能反应凝血全貌。TEG检测能够全面展现血凝块发生发展的全过程，从凝血因子的激活到牢固的血小板-纤维蛋白凝块形成再到纤维蛋白溶解，展示患者凝血状况的全貌和血凝块形成的速率、血凝块的强度，血凝块的纤溶水平。快速TEG同时激活内源性和外源性凝血通路，时间更短，因此可能更适合用于急诊科外伤后凝血功能的异常的诊断和实时地检测。
现有技术CN201810488554.9公开了一种凝血激活剂及其应用，所述凝血激活剂包括：内源性凝血激活剂，外源性凝血激活剂，磷脂、缓冲盐和保护剂。解决了试剂保质期短、需要冻干操作、试剂复溶不完全、液体试剂干涸等问题。
现有技术CN202211399664.0公开了一种血栓弹力图凝血激活检测试剂，该试剂包括以下组分：缓冲液、盐离子化合物、高岭土、磷脂、组织因子酯化物、抗氧化剂、水解明胶、冻干保护剂以及防腐剂。在常用冻干保护剂基础上添加水解明胶，使得冻干后试剂不但稳定性好，抗潮能力也大大增加，无需对测试杯进行压膜密封处理，可以直接将试剂冻干于测试杯中。
而快速激活凝血试剂里面的成分含有生物活性物质，现有技术一般做成冻干粉状，操作需要复溶，且冻干粉的储存或者运输不当或者复溶不完全都会造成检测结果的不准，另外都需要冷链运输和低温保存，储存效期较短。
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡的制备方法及应用。
发明内容
本发明首先提供了一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡，所述试剂卡包含样本仓、微流通道、定量室、激活剂通道、检测通道、废液仓和微流控芯片，所述样本仓与所述微流通道连通，所述微流通道与所述定量室连通，所述定量室与所述废液仓连通；所述定量室与所述激活剂通道、所述检测通道连通；
所述通道含有内源性和外源性激活剂包被的冻干球和氯化钙包被的冻干球；
任选地，所述冻干球中包含冻干保护剂，所述保护剂包含甘露醇、PVP、牛血清白蛋白、Proclin950。
优选地，所述试剂卡还包括样品杯。
优选地，所述冻干球采用液氮预冷冻的技术，将上述激活剂、氯化钙分别进行冻干，存储在微流控芯片中，进行真空铝箔袋双层密封。
优选地，所述真空铝箔袋材料为PP、PET、AL、CPE、NY中的两种或者三种。
优选地，所述冻干球的直径为1-3mm。
优选地，所述冻干球安装在微流控芯片中直接进行高温热压焊接，温度为100-140℃，热压焊接时间为4-10s。
优选地，所述内源性激活剂包括鞣花酸、高岭土、硅藻土、白陶土中的一种或几种混合；
优选地，所述外源性凝血途径的激活试剂是人重组组织因子脂化物。
任选地，所述激活剂配制的质量体积终浓度为0.02-0.06mg/ml；
任选地，氯化钙的摩尔体积比终浓度为0.2M。
优选地，所述保护剂包含甘露醇18%、PVP 2%、牛血清白蛋白2%、Proclin9500.03%。
本发明还提供了上述的血栓弹力图快速激活凝血试剂卡的制备方法，包含以下步骤：（1）制备含有激活剂包被的冻干球、氯化钙包被的冻干球；
（2）组装冻干球和试剂卡。
本发明还提供了一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡的应用，所述应用为a）制备检测试剂或试剂盒；或b）检测血管栓塞性疾病的方法，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
1.快速激活凝血试剂制备的冻干球外观：呈球状，圆润，光滑。
2.快速激活凝血试剂制备的冻干球水分含量低，溶解性好，避免水分高影响冻干球浓度的稳定性，提高冻干球性能的稳定性。
3.快速激活凝血试剂冻干球的制备有效解决了现有同类试剂冷链运输和低温保存，储存效期短等问题。
4.采用全封闭的配套仪器配合完成检测，期间只需将采集的枸橼酸钠抗凝的静脉全血采血管插入到试剂卡内，即可实现全血直接操作，不需要人工加样等复杂程序，只需等待10min即可显示结果，操作简便，检测快速。
5.同时解决了检测过程中血栓弹力图普通检测样品杯中内表面与血块粘附脱落的问题，提高了血栓弹力图普通凝血检测的准确性及稳定性，为临床诊断提供可靠依据。
附图说明
图1快速激活凝血试剂卡的结构示意图；1为保护鞘；2为针；3为样本仓；4为废液仓；5为激活剂；6为定量室，7为氯化钙；
图2快速激活凝血试剂冻干球的图片。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1 一种快速激活凝血试剂卡
1.该检测试剂卡包括如图1所示，试剂卡包含样本仓3、微流通道、定量室6、激活剂5通道、检测通道、废液仓4和微流控芯片，所述样本仓3与所述微流通道连通，所述微流通道与所述定量室6连通，所述定量室6与所述废液仓4连通；所述定量室6与所述激活剂5通道、所述检测通道连通；所述通道含有内源性和外源性激活剂5包被的冻干球和氯化钙7包被的冻干球；所述冻干球中包含冻干保护剂。
实施例2 冻干的操作方法
1.根据激活剂、氯化钙的浓度及冻干保护剂的浓度配制成待冻干的S1（激活剂试剂：鞣花酸，厂家：sigma、人重组组织因子脂化物，厂家：北京博尔西科技有限公司）、S2（氯化钙试剂）及冻干保护剂：甘露醇18%、PVP 2%、牛血清白蛋白2%、Proclin950 0.03%。
2.冻干参数信息：
2.1将配好的S1、S2用液氮预冷冻技术冻成体积是2-10uL的小球转入到冻干机中；
表1冻干的操作方法
冻干机可以选用：Pilot10-15ES，生产厂家为博医康(北京)仪器有限公司。
实施例3利用血栓弹力图快速激活凝血试剂卡的检测
1.使待测全血样本通过样本仓进入到试剂卡中，全血样本沿着微流通道最终流入检测通道，通道一和微流通道二中的冻干试剂溶解于样本中，配合ST-1000全自动血栓弹力图仪检测，其检测方法为：
1.1采集静脉全血至少2mL于枸橼酸钠抗凝采血管；
1.2采集的样本应在室温保存，检测前，温和颠倒采血管至少5次，确保样本彻底混匀，不应使用明显凝血的样本。
1.3从真空铝箔袋中取出检测卡，用手握住检测卡，拔下检测卡上针的保护鞘。
1.4将装有静脉全血的采血管温和颠倒至少5次混匀样本后插入到试剂卡的针孔中，采血管橡皮塞朝下使针彻底刺破。
1.5根据软件的通道使用弹窗提示，将试剂卡插入仪器检测槽内，待屏幕提示患者测试项目与试剂卡匹配无误，点击确认，跳转实验界面，全自动血栓弹力图仪自动完成试剂卡检测。
1.6凝血过程约5-12min结束，如观察完整纤溶过程需延长至30min。
2.其检测指标为：
2.1.快速激活凝血了解内、外源凝血 激活途径凝血全貌的功能，其检测指标有表2：
表2检测指标
2.2.激活凝血时间(ACT)能够快速预测输血的需求，其延长提示凝血因子缺乏或血液稀释
2.3.R值是从凝血的一开始，到开始形成纤维蛋白的时间。表现了凝血酶等凝血因子充分激活、纤维蛋白生成所需的时间。R值延长：使用抗凝剂，凝血因子缺乏；R值缩短：血液呈高凝状态。
2.4.K值是从R时间终点至描记图幅度达20mm所需的时间。反映纤维蛋白和血小板在凝血块开始形成时的相互作用，即血凝块形成的速率。K值的长短受纤维蛋白原水平高低的影响，抗凝剂可延长K值。
2.5.Angle角是纤维蛋白和血小板在血凝块开始形成时的相互作用。描记图最大曲线弧度的切线与水平线的夹角，角与K值都是反映血凝块聚合的速率。当凝血处于重度低凝状态时，血块幅度达不到20mm，此时K值无法确定。因此，角比K值更有价值。
2.6.血凝块的强度 (MA)是纤维蛋白和血小板通过GPIIb/IIIa受体结合，表现了纤维蛋白/血小板凝块的最大强度。主要受纤维蛋白原及血小板两个因素的影响，其中血小板的作用（约占80%）要比纤维蛋白原（约占20%）大，血小板质量或数量的异常都会影响到MA值。
实施例4血栓弹力图快速激活凝血试剂的准确性检测
1.选取不同凝血功能的5份新鲜全血样本及取质控水平1（0min<血凝时间（R）≤2.0min；0min<血块形成时间（K）≤5.0min；60°<血凝速率（Angle）<90°；10.00mm<血块强度（MA）≤50.00mm；主要成分：枸橼酸钠抗凝猪血浆冻干粉。厂家：普迈德（北京）科技有限公司）、质控II（2.0min<血凝时间（R）；0min<血块形成时间（K）≤5.0min；60°<血凝速率（Angle）<90°；50.00mm<血块强度（MA）≤90.00mm；主要成分：枸橼酸钠抗凝猪血浆冻干粉。厂家：普迈德（北京）科技有限公司），分别用自己的血栓弹力图快速激活凝血试剂和已上市的激活凝血检测试剂盒对样本及质控品I、质控品II进行测定，将所得结果进行对比。
2.其中，激活凝血检测试剂盒(对照试剂)：R1为高岭土、组织因子激活剂试剂，R2为CaCl2试剂，以及样品杯，厂家为北京乐普诊断科技股份有限公司，试剂盒批号为21SH06007。对比试剂采用其试剂盒对应的流程进行操作。
3.针对上述获得的血栓弹力图快速激活凝血试剂，检测流程如上述描述流程测试。
4.测定ACT、R、K、Angle、MA，5份样本及质控品I、质控品II的检测结果如下表。
从下表中，可以看出本试剂和对比试剂的检测结果偏差都在±10%以下重复性都小于10%，准确性良好。
表3血栓弹力图快速激活凝血试剂的准确性检测
表4血栓弹力图快速激活凝血试剂的准确性检测质控检测结果
实施例5血栓弹力图快速激活凝血试剂的测试
1.分别2℃、8℃、14℃、20℃、25℃，取质控水平1、质控水平2，用血栓弹力图快速激活凝血试剂进行测试ACT、R、K、Angle、MA。
2.针对上述获得的血栓弹力图快速激活凝血试剂，检测流程如上述描述流程测试。
3.从下表中，可以看出本试剂的测试R值在2℃、8℃、14℃、20℃、25℃检测结果重复性测试均在10％以内，结果良好。说明本试剂存储温度是2-25℃，能够解决低温存储、冷链运输，优于市面上已存在试剂的存储条件。
表5血栓弹力图快速激活凝血试剂在2℃的测试
表6血栓弹力图快速激活凝血试剂在8℃的测试
表7血栓弹力图快速激活凝血试剂在14℃的测试
表8血栓弹力图快速激活凝血试剂在20℃的测试
表9血栓弹力图快速激活凝血试剂在25℃的测试
实施例6血栓弹力图快速激活凝血试剂组装覆膜不同温度的测试
1.在140℃覆膜4s、7s、10s，取质控水平1、质控水平2，用血栓弹力图快速激活凝血试剂进行测试ACT、R、K、Angle、MA。
2.针对上述获得的血栓弹力图快速激活凝血试剂，检测流程如上述描述流程测试。
3.从下表中，可以看出本试剂在140℃覆膜4s、6s、8s、10s，检测结果重复性均在10％以内，说明在高温接触10s内性能良好。
表10在140℃覆膜4s的检测结果
表11在140℃覆膜7s的检测结果
表12在140℃覆膜10s的检测结果
实施例7血栓弹力图快速激活凝血试剂的加速测试
1.在37℃恒温箱中加速0、2、6、15、30、60天，取质控水平1、质控水平2，用血栓弹力图快速激活凝血试剂进行测试ACT、R、K、Angle、MA。
2.针对上述获得的血栓弹力图快速激活凝血试剂，检测流程如上述描述流程测试。
3.从下表中，可以看出本试剂在37℃加速60天后，检测结果重复性均在10％以内，加速稳定性良好。说明本试剂存储温度是2-25℃，能够解决低温存储、冷链运输，优于市面上已存在试剂的效期期限。
表13在37℃加速0天的检测结果
表14在37℃加速2天的检测结果
表15在37℃加速6天的检测结果
表16在37℃加速15天的检测结果
表17在37℃加速30天的检测结果
表18在37℃加速60天的检测结果
实施例8血栓弹力图快速激活凝血试剂的长期稳定性测试
1.分别在2-25℃环境下贮存0、3、6、12、18、24个月，取同一批质控水平1和质控水平2，用血栓弹力图快速激活凝血试剂进行测试ACT、R、K、Angle、MA。
2.针对上述获得的血栓弹力图快速激活凝血试剂，检测流程如上述描述流程测试。
3.从下表中，可以看出本试剂的检测结果在2-25℃存放24个月后，重复性能测试都在10％以内，说明本试剂长期稳定性很好，优于市面上已存在试剂的效期稳定性。
表19在2-25℃贮存0个月的检测结果
表20在2-25℃贮存3个月的检测结果
表21在2-25℃贮存6个月的检测结果
表22在2-25℃贮存12个月的检测结果
表23在2-25℃贮存18个月的检测结果
表24在2-25℃贮存24个月的检测结果
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种血栓弹力图快速激活凝血试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包含样本仓、微流通道、定量室、激活剂通道、检测通道、废液仓和微流控芯片，所述样本仓与所述微流通道连通，所述微流通道与所述定量室连通，所述定量室与所述废液仓连通；所述定量室与所述激活剂通道和所述检测通道连通；
所述通道含有内源性和外源性激活剂包被的冻干球和氯化钙包被的冻干球；
所述内源性激活剂是鞣花酸；
所述外源性激活剂是人重组组织因子脂化物；
所述冻干球中包含冻干保护剂，所述保护剂为甘露醇18%、PVP 2%、牛血清白蛋白2%和Proclin950 0.03%；
所述冻干球的制备方法包括以下步骤：
（1）配制待冻干的S1和S2及冻干保护剂；所述冻干保护剂为甘露醇18%、PVP 2%、牛血清白蛋白2%和Proclin950 0.03%；所述S1为鞣花酸和人重组组织因子脂化物；所述S2为氯化钙试剂；
（2）将配好的S1和S2用液氮预冷冻技术冻成体积是2-10uL的小球转入到冻干机中；
（3）冻干的操作方法如下表所示；
。
2.根据权利要求1所述的血栓弹力图快速激活凝血试剂卡，其特征在于，所述试剂卡还包括样品杯。
3.根据权利要求1所述的血栓弹力图快速激活凝血试剂卡，其特征在于，所述冻干球的直径为1-3mm。
4.一种如权利要求1-3任一所述的血栓弹力图快速激活凝血试剂卡的应用，其特征在于，所述应用为a）制备检测试剂或试剂盒；或b）检测血管栓塞性疾病的方法，所述方法用于非诊断目的或者非治疗目的。
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