CN108169499A - 一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,在凝血试剂原液中加入赋形剂,搅匀后将凝血试剂滴定成2.0μl/滴—5.0μl/滴的试剂,在液氮作用下速冻后,然后在冻干机中冷冻干燥成凝血试剂冻干微球,最后装载到生化试剂盘上进行凝血分析。本发明所述凝血分析方法将凝血试剂冻干为结构稳定、不易于崩塌的微球,装载到生化试剂盘中进行测试,而采用的冻干赋形剂,可以保证微球外观稳定,同时能达到与成本高的检测分析仪分析效果,不影响试剂性能。
Description
技术领域
本发明涉及检验分析技术领域,具体涉及一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法及操作方法。
背景技术
凝血四项为手术前、血栓患者及监控临床口服抗凝药物患者的必查项目,进行凝血检测对于手术检测具有重要的意义。
凝血项目是通过凝血仪检测完成的,凝血仪的主要检测方法为凝固法,即将凝血试剂或激活剂加入到血浆中,使血浆发生凝固,在凝固过程中,纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白,并形成半固体凝块,凝血仪记录血浆凝固过程中一系列的变化,如光、电等,并将这些变化的信号转变成数据,计算机处理分析后得出检测结果。
凝血仪分为全自动凝血仪和半自动凝血仪。全自动凝血仪需要将被检者血液样本经单独的离心机离心后,置于全自动凝血仪中进行相应项目检测。其中,全自动凝血仪和离心机价格昂贵、占地面积大,只有大中型医疗机构才能开展该检测项目。半自动凝血仪价格便宜,但仍需要单独购买离心机,需要人工添加试剂,人工按键操作,易出现操作失误,且对操作人员的实验操作技能要求较高。基于以上原因,很多小型医院、乡镇卫生所不能够开展凝血检测,大量患者集中于大型医院,造成医疗资源浪费。
同时,现行的手术室无法单独检测凝血项目,需要由检验科来完成,而检验科检验是个复杂完整的过程,包括检验申请、样本采集和运送、检验、结果报告、结果传送等环节,现实中检验科无专门的急诊检验通道,急诊标本也未单独采集、送检,而是与普通检验标本一起送至检验科,导致样本得不到及时检测,遇到紧急情况需要马上手术的患者,医生不能即时拿到结果报告,进行临床判断,可能导致错失最佳手术时机。
目前国内外均无将生化分析与凝血分析置于同一检测平台的先例,基于此,研究开发了一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法。
发明内容
本发明提供一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,通过将凝血试剂冻干为结构稳定、不易崩塌的微球结构,装载到生化试剂盘中进行测试,解决了现有技术中进行凝血检验分析所使用的设备价格昂贵,仪器占用空间大,试剂成本高,血液用量大,操作复杂等问题。
本发明通过下述技术方案实现:
一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,在凝血试剂原液中加入赋形剂,搅匀后将凝血试剂滴定成2.0μl/滴试剂—5.0μl/滴试剂,并在液氮作用下速冻,在冻干机中冷冻干燥,凝血试剂冻干成微球,装载到生化试剂盘上进行凝血分析。
本技术方案中采用的凝血分析方法,不同于传统的冻干凝血试剂,本发明中将凝血试剂冻干为结构稳定、不易崩塌的微球,微球结构能够装载到生化试剂盘中,即凝血试剂的这种处理方式最终形成的微球结构与生化分析仪的反应腔的结构相适配,最终检测结果达到与采用全自动凝血仪检测的结构一样准确,检测效率提高。
而本发明中,将凝血试剂冻干为微球结构,以现有的生化试剂盘作为反应容器,然后置于生化分析仪上进行分析测试。整个凝血分析过程中,减少了购买分析仪购机成本,节约试剂成本,减少血液用量,减少人工操作造成的误差。
其中,本发明在凝血试剂配方中加入赋形剂,滴定成2.0μl/滴—5.0μl/滴的试剂,表示凝血试剂冻干微球在冻干前呈液滴状一滴体积为2.0μl—5.0μl。
其中,在凝血试剂原液中加入赋形剂,在液氮作用下速冻后的结构为冰球,然后在冻干机中冷冻干燥成凝血试剂冻干微球。
且本技术方案中所述的冻干机的结构及其作用为本领域技术人员公知,不再详述。
优选地,在生化试剂盘上进行凝血分析的方法为:向加样腔中加入90—120μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘置于生化分析仪上进行测试,生化试剂盘高速旋转,枸橼酸钠抗凝全血样本和稀释液向远离生化试剂盘中心的外周运动,枸橼酸钠抗凝全血样本分离成靠近生化试剂盘圆心的样本定容腔中的血浆,靠外周的血细胞;一部分稀释液进入稀释液定容腔内,其余的稀释液进入生化试剂盘最外端的空白孔,在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的枸橼酸钠抗凝血浆样本和稀释液进入混合腔,混合均匀;
继续在毛细管吸力和离心力的交替作用下,稀释后的枸橼酸钠抗凝血浆样本进入装有凝血试剂微球的反应腔中,凝血试剂微球溶解,开始反应,进行检测。
本技术方案中操作步骤中:向加样腔中加入90—120ul枸橼酸钠抗凝全血样本;在凝血试剂原液中加入赋形剂,搅匀后将凝血试剂滴定成2.0μl/滴—5.0μl/滴,然后经液氮作用速冻、冻干机冷冻干燥成凝血试剂冻干微球,再装载到生化试剂盘上进行凝血分析;本凝血分析方法中,加入的样本量与传统采用凝血仪相比,加入量为传统加入量的1/10,可见整个过程减少了试剂样本用量,且操作过程中对样本进行稀释,检测后通过数学模型计算,测试结果与传统凝血仪结果一致。
优选地,所述赋形剂包括以下组分及浓度,按重量份数计,3-6份聚乙二醇-20000、10-25份甘露醇、3-10份海藻糖。
优选地,所述赋形剂包括以下组分及浓度,按重量份数计,1-8份BSA、10-15份甘氨酸、1-5份木糖醇。
优选地,所述赋形剂包括以下组分及浓度,按重量份数计,1-8份BSA、6-12份乳糖、1-5份PVP。
优选地,所述赋形剂包括以下组分及浓度,按重量份数计,1-5份PEG-20000、5-15份甘氨酸、1-5份PVP。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
(1)本发明所述凝血分析方法将凝血试剂冻干为结构稳定、不易崩塌的微球,装载到生化试剂盘中进行测试,而采用的冻干赋形剂,可以保证微球外观稳定,同时能达到与常规的凝血分析仪相同的分析效果,不影响试剂性能,冻干试剂有利于长期保存。
(2)本发明所述分析方法中,加入的样本量约为传统凝血分析的1/10,却能够达到与传统凝血分析一样的效果。
(3)本发明所述分析方法将传统复杂的凝血分析过程创新改进为不需要另外的离心血液样本,且中间不需要人工操作,不需要液体试剂盒其他耗材,整个操作过程简单化,利于很多小型医院、乡镇卫生所开展凝血检测。
附图说明
图1为本发明生化试剂盘的结构示意图;
其中:1—加样腔,2—稀释液定容腔,3—混合腔,4—样本定容腔,5—反应腔,6-空白孔。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
下述实施例中所述的稀释液的主要成分为巴比妥钠和氯化钠,具体可为0.0285mol/L巴比妥钠,0.126mol/LNaCl。
下述实施例及技术方案中所述生化试剂盘的结构为:该试剂盘上除有多个用于检测项目的反应孔和空白孔外,还有两个用于光路检测的通孔和盲孔,一个血液样本余液收集腔,一个稀释液余液收集腔,一个混合样本余液收集腔,上述结构均位于试剂盘的外周圆上,并均匀分布。
生化试剂盘包括上盖和底座,两者材质均为透明的亚克力材料组成,并焊接为一体结构。使用时,一个样本使用一个试剂盘。且下述实施例所述的生化试剂盘结构为现有技术,不再详述。
实施例1:
一种基于生试剂盘进行凝血分析方法,利用本发明测试样本APTT值,包括以下操作步骤:
1)制备APTT原液后,按重量份数加入赋形剂:3份聚乙二醇-20000、10份甘氨酸、3份海藻糖,置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀;配置CaCl2溶液后按重量份数加入赋形剂:3份聚乙二醇-20000、10份甘露醇、3份海藻糖,置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀;
2)通过一种微量精密分液泵将凝血试剂滴定成2.0μl/滴,并在液氮作用下速冻,随后装入西林瓶中进行冷冻干燥,将一人份冻干品APTT试剂和CaCl2试剂装载到生化试剂盘上;一人份冻干品中一人份指一个人一次测试的用量,也可表述为一次测试所需的用量。且一人份冻干品的量为本领域技术人员所公知,不再详述。
3)如图1所示,向加样腔1中加入90μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘放入生化分析仪上进行测试,生化分析仪将稀释杯撕裂一个可以供液体溢出的小口,随后测试盘高速运转,在离心力作用下,样本和稀释液向远离测试盘中心的外周运动,在高速运转一段时间后,样本在离心力作用下,分离成靠圆心样本定容腔4中的血浆,靠外周的血细胞,本实施例体积为19.37μl,稀释液保留一定容积在环形腔内,其余进入稀释液定容腔2,多余的稀释液进入生化试剂盘最外端的空白孔6。在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的血浆样本和稀释液进入混合腔3,采用加、减速交替作用的运动方式使血浆样本和稀释液混合均匀;
4)在虹吸力和离心力的共同作用下将稀释好的血浆样本分配到装有凝血试剂微球的反应腔5中,试剂迅速溶解,启动反应,随着血浆样品中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白并产生凝块,透射光逐渐减少,即光线吸收逐渐增加,当样品完全凝固后,吸光度不再发生变化,仪器把吸光度变化描绘成凝固曲线。通常把凝固起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为反应时间。光探测器接受这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到检测器上进行处理,描出凝固曲线,并计算出凝固时间。
实施例2:
一种基于生试剂盘进行凝血分析方法,利用本发明测试样本PT值,包括以下操作步骤:
1)制备PT原液后,按重量份数计,加入赋形剂:8份BSA、15份甘氨酸、5份木糖醇,置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀;
2)通过一种微量精密分液泵将凝血试剂滴定成3.2μl/滴,并在液氮作用下快速冷冻,随后装入冻干瓶中进行冷冻干燥;
3)将一人份冻干品PT试剂装载到生化试剂盘上;
4)如图1所示,向加样腔1中加入120μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘放入生化分析仪上进行测试,生化分析仪将稀释杯向上顶升并通过一个尖刺刺破稀释液杯上的密封薄膜,可以供液体溢出,随后测试盘高速旋转,在离心力作用下,样本和稀释液向远离测试盘中心的外周运动,在高速运转一段时间后,样本在离心力作用下,分离成靠圆心样本定容腔4中的血浆,靠外周的血细胞,本实施例样本定容腔的体积为19.37μl;同时一部分稀释液进入稀释液定容腔2内,多余的稀释液进入生化试剂盘最外端的空白孔6。在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的血浆样本和稀释液进入混合腔3,采用加、减速交替作用的运动方式使血浆样本和稀释液混合均匀;
5)在虹吸力和离心力的共同作用下将稀释好的血浆样本分配到装有凝血试剂微球的反应腔5中,试剂迅速溶解,启动反应,随着血浆样本中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白并产生凝块,透射光逐渐减少,即光线吸收逐渐增加,当样品完全凝固后,吸光度不再发生变化,仪器把吸光度变化描绘成凝固曲线。通常把凝固起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为反应时间。光探测器接受这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到检测器上进行处理,描出凝固曲线,并计算出凝固时间。
实施例3:
一种基于生试剂盘进行凝血分析方法,利用本发明测试样本TT值,包括以下操作步骤:
1)制备TT原液后,按重量份数计,加入赋形剂:1份BSA、10份乳糖、2份PVP,置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀;
2)通过一种微量精密分液泵将凝血试剂滴定成4.0μl/滴,并在液氮作用下快速冷冻,随后装入冻干瓶中进行冷冻干燥;
3)将一人份冻干品TT试剂装载到生化试剂盘上;
4)如图1所示,向加样腔1中加入100μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘放入生化分析仪上进行测试,生化分析仪将稀释杯向上顶升并通过一个尖刺刺破稀释液杯上的密封薄膜,可以供液体溢出,随后测试盘高速旋转,在离心力作用下,样本和稀释液向远离测试盘中心的外周运动,在高速运转一段时间后,样本在离心力作用下,分离成靠圆心样本定容腔4中的血浆,靠外周的血细胞,本实施例样本定容腔的体积为19.37μl;同时一部分稀释液进入稀释液定容腔2内,多余的稀释液进入生化试剂盘最外端的空白孔6,本实施例稀释液定容腔的体积为366.225μl。在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的血浆样本和稀释液进入混合腔3,采用加、减速交替作用的运动方式使血浆样本和稀释液混合均匀;
5)在虹吸力和离心力的共同作用下将稀释好的血浆样本分配到装有凝血试剂微球的反应腔5中,试剂迅速溶解,启动反应,随着样品中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白并产生凝块,透射光逐渐减少,即光线吸收逐渐增加,当样品完全凝固后,吸光度不再发生变化,仪器把吸光度变化描绘成凝固曲线。通常把凝固起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为反应时间。光探测器接受这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到检测器上进行处理,描出凝固曲线,并计算出凝固时间。
实施例4:
一种基于生试剂盘进行凝血分析方法,利用本发明测试样本Fib含量,包括以下操作步骤:
1)制备Fib原液后,按重量份数计,加入赋形剂:2份PEG-20000、10份甘氨酸、2份PVP,置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀;
2)在制珠机上将凝血试剂滴定成5.0μl/滴,并在液氮作用下快速冷冻,随后装入西林瓶中进行冷冻干燥;
3)将一人份冻干品Fib试剂装载到生化试剂盘上;
4)如图1所示,向加样腔1中加入120μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘放入生化分析仪上进行测试,生化分析仪将稀释杯向上顶升并通过一个尖刺刺破稀释液杯上的密封薄膜,可以供液体溢出,随后测试盘高速旋转,在离心力作用下,样本和稀释液向远离测试盘中心的外周运动,在高速运转一段时间后,样本在离心力作用下,分离成靠圆心样本定容腔4中的血浆,靠外周的血细胞,本实施例样本定容腔的体积为19.37μl;同时一部分稀释液进入稀释液定容腔2内,多余的稀释液进入生化试剂盘最外端的空白孔6,本实施例稀释液定容腔的体积为366.225μl。在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的血浆样本和稀释液进入混合腔3,采用加、减速交替作用的运动方式使血浆样本和稀释液混合均匀;
5)在虹吸力和离心力的共同作用下将稀释好的血浆样本分配到装有凝血试剂微球的反应腔5中,试剂迅速溶解,启动反应,随着样品中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白并产生凝块,透射光逐渐减少,即光线吸收逐渐增加,当血浆样本完全凝固后,吸光度不再发生变化,仪器把吸光度变化描绘成凝固曲线。通常把凝固起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为反应时间。光探测器接受这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到检测器上进行处理,描出凝固曲线,并计算出凝固时间,将该凝固时间代入Fib标准曲线,便能计算出样本Fib含量。
实施例1到实施例4中,生化试剂盘的工作过程如下:
第一步:从加样腔加入90-120μl全血样本后,将生化试剂盘放入仪器伸缩仓,仪器伸缩仓将生化试剂盘运载到工作位置后,仪器升降装置再将生化试剂盘夹持固定的同时将生化试剂盘中集成的稀释杯向上顶并刺破一个可以供液体溢出的小口;
第二步:直流无刷电机带动生化试剂盘高速旋转,在离心力作用下,样本和稀释液向远离生化试剂盘中心的外周运动;
第三步:在高速运转一段时间后,一方面样本在离心力作用小,分离成靠圆心为定容积的血浆,靠外周为血细胞,另一方面,稀释液保留一定容积在环形腔内,其余进入空白孔和多余稀释液收集腔;
第四步:在毛细管的虹吸力和离心力的交替作用下定容积后的样本和稀释液进入混合腔;
第五步:采用加、减速交替作用的运动方式使样本和稀释液混合均匀,然后在虹吸力和离心力的共同作用下将稀释好的样本分配到带有不同项目的反应孔5中;
第六步:各反应孔5开始发生反应,仪器检测样本各凝血项目的凝固时间。
对比实施例:
以Siemens PT试剂和普朗半自动凝血仪PUN-2048B为例进行说明:4ml/瓶装量的PT试剂在西林瓶中冻干,使用前加入4ml蒸馏水/去离子水进行复溶,试剂37℃保温30分钟左右,取离心后的枸橼酸钠抗凝血浆50μl加入测试杯,放入半自动凝血仪测试孔保温3分钟,加入100μl PT试剂,启动反应,随着样品中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白并产生凝块,透射光逐渐减少,即光线吸收逐渐增加,当样品完全凝固后,吸光度不再发生变化,仪器把吸光度变化描绘成凝固曲线。通常把凝固起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为反应时间。光探测器接受这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到检测器上进行处理,描出凝固曲线,并计算出凝固时间,仪器显示屏上显示测试结果。
实施例与传统方法测试凝血项目比对:
测试正常值凝血质控品比对,如下表,
凝固时间 | 加入样本量 | 对比市售试剂 | 对比试剂样本量 | |
实施例1:APTT(s) | 31.7 | 2.0μl/滴 | 33.2 | 100μl |
实施例2:PT(s) | 12.9 | 3.2μl/滴 | 12.5 | 100μl |
实施例3:TT(s) | 16.5 | 3.2μl/滴 | 16.2 | 100μl |
实施例4:Fib(g/L) | 2.80 | 5.0μl/滴 | 2.78 | 100μl |
从上述表格分析可得,采用本发明所述分析方法与常规凝血分析方法相比,本技术方案所述的凝血分析方法所达到的凝固时间相同,但所用到的样本试剂量极大的减少。
实施例1—4所述的凝血分析方法中,凝血检测项目集成到生化试剂盘中,配合斯马特系列便携式生化分析仪,可应用于各级医院急诊科室和乡镇社区医院。生化试剂盘与常规血凝项目的结合,使传统复杂的血凝分析操作变得简单,且无需同时购买专用的凝血分析仪,降低购机成本的同时,也随之减少购买多个仪器占用的空间。
实施例1—4所述的凝血分析方法,操作简单,可应用于需要随时进行凝血监控的危重病人的床旁监测、口服抗凝剂常规家庭监控,也可应用于手术室,有助于医生即时作出临床判断,提高检测效率。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:在凝血试剂原液中加入赋形剂,搅匀后将凝血试剂滴定成2.0μl/滴—5.0μl/滴的试剂,在液氮作用下速冻后,然后在冻干机中冷冻干燥成凝血试剂冻干微球,最后装载到生化试剂盘上进行凝血分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:在生化试剂盘上进行凝血分析的方法为:向加样腔(1)中加入90—120μl枸橼酸钠抗凝全血样本,将生化试剂盘置于生化分析仪上进行测试,生化试剂盘高速旋转,枸橼酸钠抗凝全血样本和稀释液向远离生化试剂盘中心的外周运动,枸橼酸钠抗凝全血样本分离成靠近生化试剂盘的圆心样本定容腔(4)中的血浆,靠外周的血细胞;一部分稀释液进入稀释液定容腔(2)内,其余的稀释液进入最外端的空白孔(6)内,在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,定容积后的枸橼酸钠抗凝血浆样本和稀释液进入混合腔(3),混合均匀;
继续在毛细管虹吸力和离心力的交替作用下,稀释后的枸橼酸钠抗凝血浆样本进入装有凝血试剂微球的反应腔(5)中,凝血试剂微球溶解,开始反应,进行检测。
3.根据权利要求1所述的一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:所述赋形剂包括以下组分,按重量份数计,3-6份聚乙二醇-20000、10-25份甘露醇、3-10份海藻糖。
4.根据权利要求1所述的一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:所述赋形剂包括以下组分,按重量份数计,1-8份BSA、10-15份甘氨酸、1-5份木糖醇。
5.根据权利要求1所述的一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:所述赋形剂包括以下组分,按重量份数计,1-8份BSA、6-12份乳糖、1-5份PVP。
6.根据权利要求1所述的一种基于生化试剂盘进行凝血分析的方法,其特征在于:所述赋形剂包括以下组分,按重量份数计,1-5份PEG-20000、5-15份甘氨酸、1-5份PVP。
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