CN108169467A - 一种血栓弹力图仪质控品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于凝血检测质量控制领域，具体涉及一种血栓弹力图质控品及其制备方法和应用。本发明提供的质控品包括质控品L1和L2，分别采用不同配比的血清基质液、纤维蛋白原基质液、组织因子、抗凝剂、凝血激活剂组成，将血小板控制在特定范围内，并加入塑形剂，且不含凝血因子，使得检测结果更为准确，具备校准品的功能。本发明还提供一种质控品的制备方法，对全血中的血清、纤维蛋白原和血小板依次进行了分离，并精确控制其含量，由此制备的质控品具备良好的准确性和稳定性；而且采用的血清、纤维蛋白原均来自统一的血液体系，产品的相容性好，进一步增加了稳定性。该制备方法简单，所使用的添加剂、调制物少，便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于凝血检测质量控制领域，具体涉及一种血栓弹力图仪质控品及其制备方法和应用。
背景技术
常规实验室检查凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(PTT)或D-Dimer等指标仅是检查离体血浆和凝血级联反应中一个部分，即内或外源性凝血旁路或纤维蛋白溶解部分的情况，是凝血全过程片段地、部分地描记，而且其结果常常受肝素类物质的影响。血栓弹力图仪(thrombelastography，TEG)能够完整地监测血样从凝血至血凝块形成及纤维蛋白溶解的全过程，实现对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估。由于其监测时间短，15-20分钟即可出现结果，且结果不受肝素类物质的影响，已广泛应用于心脏外科、器官移植、肿瘤和放射治疗中或后期的术后出血和(或)血栓形成的情况监测。
血栓弹力图样本为患者的全血标本，仪器采用凝固法，即模拟生理血液凝固条件，加入某种试剂，启动血液凝集反应，使样品中的纤维蛋白原转化为交联纤维蛋白，样品发生凝固。仪器内部的电机驱动承载血样品的样品杯以一定的角度(4度45分)和周期(如10秒)转动，样品一旦凝固，置于样品杯中的金属探针收到样品的切应力作用，随之出现左右旋动。金属探针的旋被非接触式角度旋动传感器感应，仪器的软件会自动记录所测样品的动力学变化，并产生记录图(凝血曲线图)。
凝血曲线图所涉及的重要的参数有R值、K值、Angle值、MA值，其分别代表的意义如下：
R值为凝血阶段，检测起至曲线振幅上升至2mm所需要的时间，对应多种凝血因子逐步激活导致纤维蛋白开始形成的过程；
K值为曲线振幅由2mm上升到20mm所需要的时间，对应纤维蛋白交联及其与血小板的相互作用，因此K用来评估凝血块强度达到某一水平的速度或者动力学特征；
Angle值为最大曲线弧度切线与水平的夹角，与K值共同反映纤维蛋白与血小板的相互作用，在患者严重低凝K值无法测出的时候成为重要的替代指标；
MA值为最大振幅，对应血块最大强度，影响因素有纤维蛋白原和血小板，其中血小板的作用比纤维蛋白原的作用大。
随着血栓弹力图仪检测项目不断拓展到疾病诊断和治疗的各个领域，对检测仪器进行检验室内的质量控制尤为重要。目前，取得血栓弹力图仪质控品注册批文的公司仅有两家：一家为进口，市场上供应限制，且价格不菲；一家为国产，没有商品化供应。为此，中国专利文献CN105652022A公开了一种血栓弹力图仪质控品及其制备方法，以猪全血为原料，将分离得到的血浆分为两部分，一部分用于提取纤维蛋白原和凝血因子，另一部分进行稀释，然后将纤维蛋白原和凝血因子加至稀释血浆中，调节R值、K值、Angle值、M值得到两种规格的质控品。由于全血中成分复杂，各成分对质控品的准确性和稳定性至关重要，而该方法制备的质控品中所含成分以及含量不明确，所制备的质控品的准确性和稳定性较差，影响血栓弹力图仪的检测结果。因此，寻找一种能够快速有效检测血栓弹力图仪准确性、重复性和稳定性的质控品，用来校准和调试血栓弹力图仪，以期获得质量更优、检测效果更好的血栓弹力图仪具有重要的意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是克服现有技术中弹力图仪质控品准确性、稳定性差这一缺陷，进而提供一种能够快速有效检测血栓弹力图仪准确性、重复性和稳定性的质控品，用来校准和调试血栓弹力图仪，以期获得更好的检测效果。
为此，本申请采取的技术方案为：
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，所述质控品包括质控品L1和质控品L2；
所述质控品L1包括以下体积比的原料：
血清基质液400～580，纤维蛋白原基质液120～300，组织因子1～2，凝血激活剂6～10；
所述质控品L2包括以下体积比的原料：
血清基质液620～680，纤维蛋白原基质液20～80，组织因子1～2，凝血激活剂6～10；
所述质控品L1和质控品L2中还包括抗凝剂；
其中，所述血清基质液为血清和塑形剂的混合液，所述纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原和血小板的混合液；所述质控品L1中，血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数为3.8‰；所述质控品L2中血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数为3.8‰。
可选的，所述塑形剂为甘露醇和牛血清蛋白，或者，甘氨酸和蔗糖。
可选的，所述抗凝剂为枸橼酸钠；所述凝血激活剂为浓度为1mg/mL高岭土水溶液。
可选的，所述纤维蛋白原基质液还含有缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.2～7.6，所述缓冲液含NaCl质量分数为0.9％。
本发明还提供上述质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)采集新鲜猪全血，先分离得到血浆，然后再除去所述血浆中的一部分血小板，得到贫血小板血浆；
(2)将步骤(1)所述贫血小板血浆经冷冻、解冻，分离得到血清和纤维蛋白原基质液；
(3)向步骤(2)所述血清中加入塑形剂，得到血清基质液；
(4)向步骤(3)所述血清基质液中加入不同比例的所述纤维蛋白原基质液、组织因子、凝血激活剂，得到不同水平的质控品溶液。
可选的，制备得到的所述质控品L1的R值为0～3min、K值为0～3min、Angle值为77～89deg、MA值为44～63mm；
所述质控品L2的R值为0～3min、K值为0～4min、Angle值为68～85deg、MA值为24～43mm。
可选的，步骤(1)所述贫血小板血浆的制备方法为：将所述血浆在3500～3700r/m条件下离心6～8分钟以除去部分血小板，得到所述贫血小板血浆。
可选的，步骤(2)所述纤维蛋白原基质液的制备方法为：将所述贫血小板血浆置于6～8℃环境下解冻18～22h，然后在0～4℃环境下、3800～4000r/m离心4～6min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液。
可选的，还包括在步骤(2)所述纤维蛋白原基质液中加入缓冲液形成纤维蛋白原饱和溶液的步骤。
本发明还提供上述质控品在检测血栓弹力图仪准确性和稳定性中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，包括质控品L1和质控品L2，分别采用不同配比的血清基质液、纤维蛋白原基质液、组织因子、抗凝剂、凝血激活剂，其中，血清基质液为血清和塑形剂的混合液，纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原和血小板的混合液；质控品L1中，血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数≥3.8‰；质控品L2中血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数≥3.8‰。
相比于现有的血栓弹力图仪质控品，此组分的质控品L1和质控品L2中抗凝剂质量分数≥3.8‰，且不含凝血因子，控制在凝血阶段检测起至曲线振幅上升至2mm所需要的时间(即R值)在合理范围，从而有利于调出R值的高值和低值；控制血小板浓度均为(97～156)×109个/L，以准确评估凝血块强度达到某一水平的速度或者动力学特征；加入塑形剂，使得质控品L1和质控品L2形成特定空间结构。此血栓弹力图仪质控品的R值、K值、Angle值、MA值四项凝血参数定值区间范围窄，区分度大，结果准确，对检测仪器变化敏感，检测快速，具备校准品的功能。
2.本发明还提供质控品的制备方法，先采集新鲜猪全血，分离得到血浆，再除去血浆中的一部分血小板，得到贫血小板血浆；将贫血小板血浆经冷冻、解冻，分离得到血清和纤维蛋白原基质液；向血清中加入塑形剂，得到血清基质液；向血清基质液中加入不同比例的所述纤维蛋白原基质液、组织因子、凝血激活剂，得到不同水平的质控品溶液。
本发明提供的制备方法对全血中的血小板、纤维蛋白原、血清依次进行了分离，并严格控制其含量，使得质控品的R值、K值、Angle值、MA值四项凝血参数定值精准，由此制备的质控品具备良好的准确性和稳定性；而且采用的血清、纤维蛋白原均来自统一的血液体系，产品的相容性好，进一步增加了稳定性。本发明提供的制备方法简单，所使用的添加剂、调制物少，便于工业化生产。
3.本发明提供的质控品的制备方法中，以猪全血为原料，来源充足且成本低廉，而且基本可以排除以人血为基质的可能存在传染性病毒的潜在风险，安全可靠。
附图标记
图1为实施例1制备的血清基质液、质控品L1、质控品L2的血栓弹力图的复合图谱；
附图标记：
1-质控品L1；2-质控品L2；3-血清基质液。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案和要点，下面将对本发明的实施方式作进一步详细描述。本发明可以多种不同的形式实施，而不应该被理解为仅限于在此阐述的实施例。相反，提供此实施例，使得本发明将是彻底的和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
下述实施例中涉及到的试剂以及购置厂家信息如下：
枸橼酸钠二水合物，国药集团化学试剂有限公司；
甘露醇，上海源叶生物科技有限公司；
牛血清蛋白，上海源叶生物科技有限公司；
甘氨酸，国药集团化学试剂有限公司；
蔗糖，国药集团化学试剂有限公司；
组织因子，北京博尔西科技有限公司；
高岭土，Sigma-aldrich。
实施例1
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，包括质控品L1和质控品L2；
质控品L1包括以下体积比的原料：
血清基质液490，纤维蛋白原基质液210，组织因子1.5，凝血激活剂高岭土水溶液10；
质控品L2包括以下体积比的原料：
血清基质液650，纤维蛋白原基质液50，组织因子1.5，凝血激活剂高岭土水溶液10；
其中，血清基质液为含塑形剂甘露醇8％、牛血清蛋白5％的混合液；纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原、血小板溶解在pH＝7.4的Tris缓冲液形成的纤维蛋白原饱和溶液；高岭土水溶液质量浓度为1.0mg/mL；质控品L1中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为121×109个/L；质控品L2中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为134×109个/L。
本发明提供一种采用上述原料制备得到的血栓弹力图仪质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪血浆的制备
称取3.8g枸橼酸钠二水合物，溶于80mL蒸馏水配制成质量分数为3.8％的枸橼酸钠水溶液，置于总体积1000mL的容器杯中。宰杀生猪，割破动脉取血至枸橼酸钠水溶液的容器杯中，直至总体积达到800mL(此时枸橼酸钠的最终质量分数为3.8‰)。取血时顺时针温和晃动容器杯，以保证枸橼酸钠与猪新鲜血液混合均匀，然后用保鲜膜将容器杯密封，置于5℃冰箱中冷藏，静置18小时。待血液分层后取出，在低温环境下操作，用移液枪小心吸取上层血浆，分装，然后在1500r/m条件下离心12min，弃除红细胞等沉淀物，保留上层含枸橼酸钠的血浆400mL，然后再在3600r/m条件下离心7min，除去底层的绝大部分血小板，保留上清液，此时上清液还含有少量的血小板，即滞留在纤维蛋白原中的血小板，得到贫血小板血浆(PPP)，体积为400mL。
(2)纤维蛋白原的分离
先取步骤(1)所得的贫血小板血浆400mL，采用50mL PE管分装6管，置于-20℃冷冻库中冷冻24小时以冻成坚硬的冰块，然后将此已结成冰块的血浆置于7℃的冷藏库中保存20小时缓慢解冻，出现的白色絮状物即为纤维蛋白原；控制溶液温度2℃，在3900r/m条件下离心5min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液，向含血小板的纤维蛋白原基质液中加入含NaCl 0.9％、pH为7.4的Tris缓冲液以得到纤维蛋白原饱和溶液，即得到饱和的纤维蛋白原基质液。
(3)血清基质液的配制
取上述步骤(2)的血清10mL，加入塑形剂甘露醇0.92g、牛血清蛋白0.575g，制备含甘露醇8％、牛血清蛋白5％的血清基质液，然后用自制的弹力图仪复钙测试。
(4)质控品的配制
高值调配：血清基质液490μL+饱和的纤维蛋白原基质液210μL+高岭土水溶液10μL+组织因子1.5μL，混合均匀即得质控品L1溶液；其中，质控品L1溶液中，血小板含量为121×109个/L；
低值调配：血清基质液650μL+饱和的纤维蛋白原基质液50μL+高岭土水溶液10μL+组织因子1.5μL，混合均匀即得质控品L2溶液；其中，质控品L2溶液中，血小板含量为134×109个/L。
(5)成品制备
将步骤(4)所得质控品L1和L2溶液进行分装，每瓶1mL，-80℃冷冻，然后冻干机冻干，贴上标签，5～6℃冷藏储存。
实施例2
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，包括质控品L1和质控品L2；
质控品L1包括以下体积比的原料：
血清基质液580，纤维蛋白原基质液120，组织因子1.0，凝血激活剂高岭土水溶液6；
质控品L2包括以下体积比的原料：
血清基质液620，纤维蛋白原基质液80，组织因子2.0，凝血激活剂高岭土水溶液8；
其中，血清基质液为含塑形剂甘露醇8％、牛血清蛋白5％的混合液；纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原、血小板的混合液；高岭土水溶液质量浓度为1.0mg/mL；质控品L1中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为97×109个/L；质控品L2中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为156×109个/L。
本发明提供一种采用上述原料制备得到的血栓弹力图仪质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪血浆的制备
称取3.8g枸橼酸钠二水合物，溶于80mL蒸馏水配制成质量分数为3.8％的枸橼酸钠水溶液，置于总体积1000mL的容器杯中。宰杀生猪，割破动脉取血至枸橼酸钠水溶液的容器杯中，直至总体积达到800mL(此时枸橼酸钠的最终质量分数为3.8‰)。取血时逆时针温和晃动容器杯，以保证枸橼酸钠与猪新鲜血液混合均匀，然后用保鲜膜将容器杯密封，置于8℃冰箱中冷藏，静置24小时。待血液分层后取出，在低温环境下操作，用移液枪小心吸取上层血浆，分装，然后在1600r/m条件下离心10min，弃除红细胞等沉淀物，保留上层含枸橼酸钠的血浆400mL，然后再在3700r/m条件下离心6min，除去底层的绝大部分血小板，保留上清液，此时上清液还含有少量的血小板，即滞留在纤维蛋白原中的血小板，得到贫血小板血浆(PPP)，体积为400mL。
(2)纤维蛋白原的分离
先取步骤(1)所得的贫血小板血浆400mL，采用50mL PE管分装6管，置于-20℃冷冻库中冷冻24小时以冻成坚硬的冰块，然后将此已结成冰块的血浆置于6℃的冷藏库中保存18小时缓慢解冻，出现的白色絮状物即为纤维蛋白原；控制溶液温度0℃，在3800r/m条件下离心6min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液。
(3)血清基质液的配制
取上述步骤(2)的血清10mL，加入塑形剂甘露醇0.92g，牛血清蛋白0.575g，制备含甘露醇8％、牛血清蛋白5％的血清基质液，然后用自制的弹力图仪复钙测试。
(4)质控品的配制
高值调配：血清基质液580μL+纤维蛋白原基质液120μL+高岭土水溶液6μL+组织因子1μL，混合均匀即得质控品L1溶液；其中，质控品L1溶液中，血小板含量为97×109个/L；
低值调配：血清基质液620μL+纤维蛋白原基质液80μL+高岭土水溶液6μL+组织因子2μL，混合均匀即得质控品L2溶液；其中，质控品L2溶液中，血小板含量为156×109个/L；。
(5)成品制备
将步骤(4)所得质控品L1和L2溶液进行分装，每瓶1mL，-80℃冷冻，然后冻干机冻干，贴上标签，2～4℃冷藏储存。
实施例3
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，包括质控品L1和质控品L2；
质控品L1包括以下体积比的原料：
血清基质液400，纤维蛋白原基质液300，组织因子2.0，凝血激活剂高岭土水溶液8；
质控品L2包括以下体积比的原料：
血清基质液680，纤维蛋白原基质液20，组织因子2.0，凝血激活剂高岭土水溶液6；
其中，血清基质液为含塑形剂甘氨酸5.6)％、蔗糖4.8％的混合液；纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原、血小板溶解在pH＝7.6的Tris缓冲液形成的纤维蛋白原饱和溶液；高岭土水溶液质量浓度为1.0mg/mL；质控品L1中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为156×109个/L；质控品L2中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为97×109个/L。
本发明提供一种采用上述原料制备得到的血栓弹力图仪质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪血浆的制备
称取3.8g枸橼酸钠二水合物，溶于80mL蒸馏水配制成质量分数为3.8％的枸橼酸钠水溶液，置于总体积1000mL的容器杯中。宰杀生猪，割破动脉取血至枸橼酸钠水溶液的容器杯中，直至总体积达到800mL(此时枸橼酸钠的最终质量分数为3.8‰)。取血时顺时针温和晃动容器杯，以保证枸橼酸钠与猪新鲜血液混合均匀，然后用保鲜膜将容器杯密封，置于8℃冰箱中冷藏，静置12小时。待血液分层后取出，在低温环境下操作，用移液枪小心吸取上层血浆，分装，然后在1400r/m条件下离心15min，弃除红细胞等沉淀物，保留上层含枸橼酸钠的血浆400mL，然后再在3500r/m条件下离心10min，除去底层的绝大部分血小板，保留上清液，此时上清液还含有少量的血小板，即滞留在纤维蛋白原中的血小板，得到贫血小板血浆(PPP)，体积为400mL。
(2)纤维蛋白原的分离
先取步骤(1)所得的贫血小板血浆400mL，采用50mL PE管分装6管，置于-20℃冷冻库中冷冻24小时以冻成坚硬的冰块，然后将此已结成冰块的血浆置于8℃的冷藏库中保存22小时缓慢解冻，出现的白色絮状物即为纤维蛋白原；控制溶液温度4℃，在4000r/m条件下离心4min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液，向含血小板的纤维蛋白原基质液中加入含NaCl 0.9％、pH为7.6的Tris缓冲液以形成纤维蛋白原的饱和的溶液，即得到饱和的纤维蛋白原基质液。
(3)血清基质液的配制
取上述步骤(2)的血清10mL，加入塑形剂甘露醇0.92g、牛血清蛋白0.575g，制备含甘露醇8％、牛血清蛋白5％的血清基质液，然后用自制的弹力图仪复钙测试。
(4)质控品的配制
高值调配：血清基质液400μL+饱和的纤维蛋白原基质液300μL+高岭土水溶液8μL+组织因子2μL，混合均匀即得质控品L1溶液；其中，质控品L1溶液中，血小板含量为156×109个/L；；
低值调配：血清基质680μL+饱和的纤维蛋白原基质液20μL+高岭土水溶液6μL+组织因子2μL，混合均匀即得质控品L2溶液；其中，质控品L2溶液中，血小板含量为156×109个/L。
(5)成品制备
将步骤(4)所得质控品L1和L2溶液进行分装，每瓶1mL，-80℃冷冻，然后冻干机冻干，贴上标签，6～8℃冷藏储存。
对比例1
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪血浆的制备
在生猪屠宰时，割破动脉取得猪全血3L，将此猪全血和0.33L的3.8wt％的枸橼酸钠溶液混合，混匀后的全血在2～8℃条件下放置48小时分层，吸取上层血浆1.4L，下层红细胞舍去不用。
(2)提取纤维蛋白原和凝血因子
首先取步骤(1)所得的血浆1L，置于-20℃冷冻库中24小时，直至冻成冰块，然后将其置于4～8℃冷藏20小时，熔融的血浆中出现白色凝块，用丝网将此白色凝块从血浆中过滤分离，分离的白色凝块即为纤维蛋白原，约100g(湿重)，将此纤维蛋白原冲洗后溶解于生理盐水中，冻干备用；
上述丝网过滤液0.8L，用冷冻离心机2-4℃9000转/分，离心10分钟收集沉淀物，即得凝血因子粗品20g(湿重)，将此沉淀物溶解于生理盐水中，冻干备用；
(3)配制基质血浆
取步骤1所得的血浆0.3L，首先用血栓弹力图仪复钙测试R、K、Angle、MA四项参数基础值，该血浆的MA值一般在65～85mm之间，然后根据MA值的大小，用稀释液进行适当稀释，使得稀释血浆的MA值在40～45mm之间，该血浆可作为血栓弹力图仪质控品的基质血浆使用；
(4)配制质控品母液
将所得的纤维蛋白冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为0.5～2g/ml的溶液，即为纤维蛋白溶液；
将所得的凝血因子冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为0.1～0.5g/ml的溶液，即为凝血因子溶液；
按照基质血浆使用体积的5～10％加入纤维蛋白溶液，搅匀后得混合溶液1，取样测试，控制混合溶1的MA值控制在55～60mm之间，K值控制在0.5～1.5min之间；
将已调制符合要求的混合溶液1，按照基质血浆使用体积的0.5～2％加入凝血因子溶液，搅匀后得混合溶液2。取样测试，控制混合溶2的R值在0.5～1.5min之间，K值控制在0～1.5min之间，Angle值控制在81～89deg之间，MA值控制在55～63mm之间。
所得的混合溶液2即为血栓弹力图仪质控品。所得的混合溶液2可以作为质控品母液使用，用于调配L1或L2。
对比例2
本发明提供一种血栓弹力图仪质控品，包括质控品L1和质控品L2；
质控品L1包括以下体积比的原料：
血清490，纤维蛋白原基质液210，组织因子1.5，凝血激活剂高岭土水溶液10；
质控品L2包括以下体积比的原料：
血清650，纤维蛋白原基质液50，组织因子1.5，凝血激活剂高岭土水溶液10；
其中，纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原、血小板溶解在pH＝7.4的Tris缓冲液形成的纤维蛋白原饱和溶液；高岭土水溶液质量浓度为1.0mg/mL；质控品L1中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为121×109个/L；质控品L2中，所含枸橼酸钠质量分数为3.8‰，血小板含量为134×109个/L。
本发明提供一种采用上述原料制备得到的血栓弹力图仪质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪血浆的制备
称取3.8g枸橼酸钠二水合物，溶于80mL蒸馏水配制成质量分数为3.8％的枸橼酸钠水溶液，置于总体积1000mL的容器杯中。宰杀生猪，割破动脉取血至枸橼酸钠水溶液的容器杯中，直至总体积达到800mL(此时枸橼酸钠的最终质量分数为3.8‰)。取血时顺时针温和晃动容器杯，以保证枸橼酸钠与猪新鲜血液混合均匀，然后用保鲜膜将容器杯密封，置于5℃冰箱中冷藏，静置18小时。待血液分层后取出，在低温环境下操作，用移液枪小心吸取上层血浆，分装，然后在1500r/m条件下离心12min，弃除红细胞等沉淀物，保留上层含枸橼酸钠的血浆400mL，然后再在3600r/m条件下离心7min，除去底层的绝大部分血小板，保留上清液，此时上清液还含有少量的血小板，即滞留在纤维蛋白原中的血小板，得到贫血小板血浆(PPP)，体积为400mL。
(2)纤维蛋白原的分离
先取步骤(1)所得的贫血小板血浆400mL，采用50mL PE管分装6管，置于-20℃冷冻库中冷冻24小时以冻成坚硬的冰块，然后将此已结成冰块的血浆置于7℃的冷藏库中保存20小时缓慢解冻，出现的白色絮状物即为纤维蛋白原；控制溶液温度2℃，在3900r/m条件下离心5min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液，向含血小板的纤维蛋白原基质液中加入含NaCl 0.9％、pH为7.4的Tris缓冲液中以形成纤维蛋白原饱和的溶液，即得到饱和的纤维蛋白原基质液。
(3)质控品的配制
高值调配：血清490μL+饱和的纤维蛋白原基质液210μL+高岭土水溶液10μL+组织因子1.5μL，混合均匀即得质控品L1溶液；其中，质控品L1溶液中，血小板含量为121×109个/L；
低值调配：血清650μL+饱和的纤维蛋白原基质液50μL+高岭土水溶液10μL+组织因子1.5μL，混合均匀即得质控品L2溶液；其中，质控品L2溶液中，血小板含量为134×109个/L。
(4)成品制备
将步骤(3)所得质控品L1和L2溶液进行分装，每瓶1mL，-80℃冷冻，然后冻干机冻干，贴上标签，5～6℃冷藏储存。
测试例1
一、凝血曲线图四项参数基础值的影响因素
凝血曲线图所涉及的重要的参数有R值、K值、Angle值、MA值，其分别代表的意义如下：
R值为凝血阶段，检测起至曲线振幅上升至2mm所需要的时间，对应多种凝血因子逐步激活导致纤维蛋白开始形成的过程；
K值为曲线振幅由2mm上升到20mm所需要的时间，对应纤维蛋白交联及其与血小板的相互作用，因此K用来评估凝血块强度达到某一水平的速度或者动力学特征；
Angle值为最大曲线弧度切线与水平的夹角，与K值共同反映纤维蛋白与血小板的相互作用，在患者严重低凝K值无法测出的时候成为重要的替代指标；
MA值为最大振幅，对应血块最大强度，影响因素有纤维蛋白原和血小板，其中血小板的作用比纤维蛋白原的作用大。
通过试验发现，其影响因素如表1所示：
表1影响因素对参数的影响
| 序号 | 参数 | 影响因素(影响趋势) |
| 1 | R(min) | 凝血因子(--)，抗凝剂(+) |
| 2 | K | 纤维蛋白原(-) |
| 3 | Angel | 纤维蛋白原(+) |
| 4 | MA | 血小板(+) |
注明：“+”表示影响因素的浓度增大，所对应的参数值会变大；“-”表示表示影响因素的浓度增大，所对应的参数值会变小。其中，“+”或“-”的个数表示影响程度大小。
二、血清基质液四项参数基础值的测定
取实施例1-3制备的血清基质液各700μL，分别加入高岭土水溶液10μL、组织因子2μL，混合均匀后进行测试：用20μL移液枪取20μLCaCl2溶液到样品杯中，然后分别加入340μL实施例1-3的混合液进行测试R值、K值、Angle值、MA值，如表2所示：
表2实施例1-3制备的血清基质液的四项参数基础值
表2说明，通过实施例1-3制备的血清基质液的MA值比较稳定，可作为血栓弹力图仪质控品的基质液使用。
三、质控品L1和L2四项参数基础值的测定
用20μL移液枪取20μLCaCl2溶液到样品杯中，然后分别加入340μL实施例1-3的制备的质控品L1、L2进行测试R值、K值、Angle值、MA值，如表3和表4所示：
表3实施例1-3制备质控品L1的四项参数基础值
| 序号 | R(min) | K(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
| 实施例1 | 0.8 | 0.8 | 79.9 | 45 |
| 实施例2 | 0.8 | 0.8 | 79.2 | 46.2 |
| 实施例3 | 0.8 | 0.8 | 83.4 | 46.6 |
表3说明，通过实施例1-3制备的质控品L1的R值、K值、Angle值、MA值均在高值要求范围内，可直接作为高值使用。
表4实施例1-3制备质控品L2的四项参数基础值
| 序号 | R(min) | K(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
| 实施例1 | 1.1 | 2.2 | 75.8 | 25.3 |
| 实施例2 | 1.2 | 2.5 | 74.5 | 25.2 |
| 实施例3 | 1.2 | 2.3 | 74.8 | 25.4 |
表4说明，通过实施例1-3制备的质控品L2的R值、K值、Angle值、MA值均在低值要求范围内，可直接作为低值使用。
四、质控品L1和L2的准确度和精密度测定
分别取实施例1-3冻干产品各三瓶，每瓶测试三次，实施例1-3冻干产品的测试结果分别为编号1-3、4-6、7-9，对比例1-2制备的质控品L1和L2的冻干产品各测试9次，测试结果见表5和表6：
(1)质控品L1测试
表5实施例1-3、对比例1-2制备质控品L1的四项参数基础值
由表5得出，实施例1-3制备的质控品L1与对比例1-2制备的质控品L1相比，其批间差CV值最小，均值±2倍标注差的范围最窄，更适于作为标准品。
(2)质控品L2测试
表6实施例1-3、对比例1-2制备质控品L2的四项参数基础值
由表6得出，实施例1-3制备的质控品L2与对比例1-2制备的质控品L1相比，其批间差CV值最小，均值±2倍标注差的范围最窄，更适于作为标准品。
五、血栓弹力图
采用实施例1备的质控品L1和L2进行稳定性、重复性检测，与血清基质液的复合图谱为图1，由复合图谱得知，血清基质液、质控品L1、质控品L2区分度良好，而且稳定性、重复性高，具备校准品的功能。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种血栓弹力图仪质控品，其特征在于，包括质控品L1和质控品L2；
所述质控品L1包括以下体积比的原料：
血清基质液400～580，纤维蛋白原基质液120～300，组织因子1～2，凝血激活剂6～10；
所述质控品L2包括以下体积比的原料：
血清基质液620～680，纤维蛋白原基质液20～80，组织因子1～2，凝血激活剂6～10；
所述质控品L1和质控品L2中还包括抗凝剂；
其中，所述血清基质液为血清和塑形剂的混合液，所述纤维蛋白原基质液为纤维蛋白原和血小板的混合液；所述质控品L1中，血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数为3.8‰；所述质控品L2中血小板浓度为(97～156)×109个/L，抗凝剂质量分数为3.8‰。
2.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述塑形剂为甘露醇和牛血清蛋白，或者，甘氨酸和蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述的质控品，其特征在于，所述抗凝剂为枸橼酸钠；所述凝血激活剂为浓度为1mg/mL高岭土水溶液。
4.根据权利要求1-3任一所述的质控品，其特征在于，所述纤维蛋白原基质液还含有缓冲液，所述缓冲液pH值为7.2～7.6，所述缓冲液含NaCl质量分数为0.9％。
5.一种如权利要求1-4任一所述的质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集新鲜猪全血，先分离得到血浆，然后再除去所述血浆中的一部分血小板，得到贫血小板血浆；
(2)将步骤(1)所述贫血小板血浆冷冻、解冻，分离得到血清和纤维蛋白原基质液；
(3)向步骤(2)所述血清中加入塑形剂，得到血清基质液；
(4)向步骤(3)所述血清基质液中加入所需的所述纤维蛋白原基质液、组织因子、凝血激活剂，得到相应的质控品溶液。
6.根据权利要求5所述的质控品的制备方法，其特征在于，制备得到的所述质控品L1的R值为0～3min、K值为0～3min、Angle值为77～89deg、MA值为44～63mm；
所述质控品L2的R值为0～3min、K值为0～4min、Angle值为68～85deg、MA值为24～43mm。
7.根据权利要求5或6所述的质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述贫血小板血浆的制备方法为：将所述血浆在3500～3700r/m条件下离心6～8分钟以除去部分血小板，得到所述贫血小板血浆。
8.根据权利要求5-7任一所述质控品的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述纤维蛋白原基质液的制备方法为：将所述贫血小板血浆置于6～8℃环境下解冻18～22h，然后在0～4℃环境下、3800～4000r/m离心4～6min，得到血清和含血小板的纤维蛋白原基质液。
9.根据权利要求5-8任一所述的质控品的制备方法，其特征在于，还包括，在步骤(2)所述纤维蛋白原基质液中还加入缓冲液形成纤维蛋白原饱和溶液的步骤。
10.一种如权利要求1-4任一所述的质控品在检测血栓弹力图仪中的应用。
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