CN113325185A - 多水平质控品及其制备方法和在血栓弹力图检测上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及凝血检验项目质量控制技术领域，具体涉及多水平质控品及其制备方法和在血栓弹力图检测上的应用。本发明提供的血栓弹力图质控品水平1(正常值)、水平2(高凝)、水平3(低凝)，涵盖临床正常凝血、高凝、低凝、小Angle等多种状态，模拟临床实际检测环境，与血栓弹力图仪、配套试剂和氯化钙溶液联合使用，能对血栓弹力图检测系统进行质量控制或检测系统评估。本方案的血栓弹力图质控品可以应用于设备和配套试剂组成的血栓弹力图检测系统的质控实践操作中，保证临床样本检测结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及凝血检验项目质量控制技术领域，具体涉及多水平质控品及其制备方法和在血栓弹力图检测上的应用。
背景技术
血栓弹力图是由血栓弹性描记仪描记的凝血动态过程曲线，是一种能动态分析凝血形成和纤维蛋白溶解全过程的曲线图。血栓弹力图于1948年由Hartert发明，20世纪80年代中后期开始应用于临床，现已成为围手术期监测凝血功能的重要指标，并已广泛应用于肝移植、心脏外科、肾移植、创伤外科等诸多领域，指导围手术期的血液输注、溶栓及抗凝治疗等。血栓弹力图能提供16项以上定量参数。其中R值为检测开始到振幅达2mm所用的时间，提示凝血因子活性，R值延长表示低凝，R值缩短表示高凝；K值为振幅2mm至20mm所用的时间；Angle(α)值为图像开口处至最大曲线弧度作切线与水平线的夹角；MA值为最大振幅，对应血块最大强度。K值与Angle值密切相关，都是反映血凝块聚合的速率，当凝血处于重度低凝状态时，血块幅度达不到20mm，此时K值无法确定，因此，Angle值比K值更有价值。
血栓弹力图仪及配套试剂的检测结果会直接影响临床诊疗的判断。质控品在相关检测中发挥了重要作用，是临床样本检测结果的质量保证。目前，国内外用于血栓弹力图检测系统的质控品包括美国Haemonetics公司TEG 5000双水平质控品，能与血栓弹力图仪、氯化钙溶液联合使用。但该检测系统为仅仅为“仪器+质控品”的模式，因未考虑配套试剂因素，仅用于血栓弹力图仪的质量控制。在临床实际检测环境中，通常要使用到检测试剂(例如，血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))，检测试剂(即血栓弹力图仪的配套试剂)的加入，使得影响检测准确程度的因素变得复杂，仅仅使用现有的质控品对血栓弹力图仪进行质量控制，是远远不够的。但是，现有技术中，尚无稳定的可适应于临床实际检测环境(包括血栓弹力图仪、配套试剂和氯化钙溶液形成的血栓弹力图检测系统)的质控品可使用，这就极大地影响到了血栓弹力图仪检测的准确程度。
发明内容
本发明意在提供多水平质控品，以解决现有技术中尚无能够适应临床实际检测环境的血栓弹力图仪质控品的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
多水平质控品，包括血栓弹力图质控品水平1；所述血栓弹力图质控品水平1由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液和血浆基质液配制MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A；然后加入冻干保护剂、终浓度为1.0～2.0ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B1。
本方案的原理及优点是：本方案的质控品可以实现对包括血栓弹力图仪、配套试剂和氯化钙溶液形成的血栓弹力图检测系统的质量控制。现有技术中的质控品，只能针对于包括血栓弹力图仪和氯化钙溶液形成的血栓弹力图检测系统进行质量控制。质控品通常是使用在实际样品检测之前，以确定检测系统的稳定性，从而保证实际样品检测结果的准确性。现有技术的质控品只能对血栓弹力图仪本身进行质控。但是，现有的质控品没有考虑配套试剂因素，不能对含有血栓弹力图仪和配套试剂的血栓弹力图检测系统(临床实际检测环境)进行质量控制，所以，现有的质控品并不能有效地进行相关检测的质量控制。发明人尝试使用现有的质控品对包括血栓弹力图仪、配套试剂和氯化钙溶液形成的血栓弹力图检测系统进行质量控制，但是获得的检测结果的R值过小，过小的R值无法反应临床可能出现的低凝状态或正常状态。发明人经多方尝试，发现额外加入抗凝剂可以有效地克服R值过小的问题，且样品稳定。在本方案中，MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B1可作为血栓弹力图质控品水平1使用，血栓弹力图质控品水平1可模拟正常凝血状态，并对含有血栓弹力图仪和配套试剂的血栓弹力图检测系统进行质控。
进一步，多水平质控品，还包括血栓弹力图质控品水平2；所述血栓弹力图质控品水平2由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液和血浆基质液配制MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A；然后加入冻干保护剂、终浓度为0.1～0.8ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B2。在本方案中，MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B2可作为血栓弹力图质控品水平2使用，血栓弹力图质控品水平2可模拟高凝状态，并对含有血栓弹力图仪和配套试剂的血栓弹力图检测系统进行质控。
进一步，多水平质控品，还包括血栓弹力图质控品水平3；所述血栓弹力图质控品水平3由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液、血浆基质液和羟乙基淀粉生理盐水溶液配制MA值在30.0～65.0mm范围内的溶液A’；然后加入冻干保护剂、终浓度为0.1～0.8ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B’。
采用上述技术方案，制备获得的血栓弹力图质控品水平3可以模拟低凝和小angle值(血凝块聚合速率较小)的样品情况，可实现血栓弹力图检测系统针对于低凝样品的检测效力的质控。现有技术的质控品只有两种水平，只能模拟高凝和正常凝血水平的样品，而尚未出现模拟低凝状态的样品的质控品。这是因为，制备小Angle值的质控品难度较大，Angle值的大小受质控品基质、抗凝剂比例等多种因素影响，单纯调整纤维蛋白原基质液、血浆基质液、保护剂、抗凝剂等的比例，无法调至需要的小Angle值。发明人通过大量尝试，意外发现使用了羟乙基淀粉130/0.4溶液代替部分血浆基质液，克服了现有技术的质控品angle值较大且难以调小的技术问题，成功制备反应实际样品的低凝、小Angle(血凝块聚合速率较小)的状态的质控品(详见对比例1和实施例3中的实验数据)。
进一步，所述抗凝剂为依诺肝素钠。
采用上述技术方案，经过发明人的大量实验筛选，发现依诺肝素钠相对其他类型的抗凝剂具有更好的提升质控品质量的作用。抗凝剂的加入虽然能够克服R值过短的问题，但是，不同抗凝剂的使用给整个检测系统带来的随机误差是不一样，通常来说质控品追求的是更小的系统误差，以保证其质控效力。实验证明，使用依诺肝素钠，相对于使用肝素钠、肝素锂和柠檬酸钠等抗凝剂，可以有效降低检测结果的CV值(不精密度)，提升质控品的质量(详见对比例2中的实验数据)。
进一步，所述冻干保护剂包括蛋白质保护剂、pH缓冲剂和防腐剂。
采用上述技术方案，蛋白质保护剂起到保护质控品中的蛋白质物质的作用；pH缓冲剂可为质控品中的各种生物分子提供稳定的pH环境以及维持一定的盐离子浓度，维持质控品中的生物分子活性状态；防腐剂的使用可以防止质控品腐败，延长质控品的保质期。
进一步，所述蛋白质保护剂包括牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、甘露醇和乳糖中的至少一种；所述pH缓冲剂为Hepes缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂和磷酸盐缓冲剂中的一种；所述防腐剂为Proclin 300、叠氮化钠和苯甲酸钠中的一种。上述蛋白质保护剂、pH缓冲剂和防腐剂为现有技术中常规的试剂，性质稳定且成本适中。
进一步，所述纤维蛋白原基质液和所述血浆基质液由如下方法制备：在新鲜猪血中加入柠檬酸钠，获得抗凝猪血；待抗凝猪血静置分层，取分层的抗凝猪血的上层液体，离心后取上层清液，加入叠氮化钠后获得的猪血浆；4500rpm离心处理所述猪血浆15min，分别收集位于上层的血浆基质液和位于下层的纤维蛋白原基质液。
采用上述技术方案，可以从猪血中分离得到纤维蛋白原基质液和血浆基质液，上述操作过程简单且易于工业化，并且本方案以猪血为主要原料，来源充足，成本较低。
进一步，将纤维蛋白原基质液和血浆基质液混合，并将MA值调整至60.0～80.0mm；然后加入冻干保护剂和抗凝剂，并将MA值调整至50.0～70.0mm；再经过冻干处理，获得血栓弹力图质控品水平1或者血栓弹力图质控品水平2。
采用上述技术方案，在血栓弹力图质控品水平1和血栓弹力图质控品水平2加入抗凝剂，可以克服质控品R值过小的技术问题。与现有技术不同，为了反应实际使用环境，本方案的质控品用于设备、配套试剂和氯化钙溶液组成的血栓弹力图检测系统的质控。但是由于配套试剂的使用，是的检测结果中的R值过小，过小的R值会导致检测误差的增大，并且不能对。发明人经多方尝试，发现额外加入抗凝剂可以有效地克服R值过小的问题，且样品稳定。
制备的血栓弹力图质控品水平1和血栓弹力图质控品水平2分别反映了实际样品的正常凝血和高凝两种状态。可实现血栓弹力图检测系统针对于正常凝血样品的检测效力的质控，以及实现血栓弹力图检测系统针对于高凝样品的检测效力的质控。
进一步，将纤维蛋白原基质液、血浆基质液和羟乙基淀粉生理盐水溶液混合，并将MA值调整至30.0～65.0mm；然后加入冻干保护剂和抗凝剂，并将MA值调整至20.0～55.0mm；再经过冻干处理，获得血栓弹力图质控品水平3。
采用上述技术方案，使用了羟乙基淀粉130/0.4溶液代替部分血浆基质液，克服了现有技术的质控品angle值较大且难以调小的技术问题。发明人分析制备小Angle值的质控品难度较大，主要原因是Angle值的大小受质控品基质、抗凝剂比例等多种因素影响，单纯调整纤维蛋白原基质液、血浆基质液、保护剂、抗凝剂等的比例，无法调至需要的小Angle值。发明人为克服上述问题进行了大量尝试，意外发现，使用羟乙基淀粉130/0.4溶液代替血浆基质液可以克服现有技术中的问题，成功制备反应实际样品的低凝、小Angle(血凝块聚合速率较小)的状态的质控品(详见对比例1和实施例3中的实验数据)。
制备的血栓弹力图质控品水平3反映了实际样品的低凝、小Angle值(血凝块聚合速率较小)的状态，可实现血栓弹力图检测系统针对于低凝样品的检测效力的质控。
进一步，多水平质控品作为血栓弹力图检测系统的质控品的应用。
在对样品进行血栓弹力图检测时，需要使用到检测设备(血栓弹力图仪)、配套的试剂和氯化钙溶液。针对设备、配套试剂和氯化钙溶液组成的血栓弹力图检测系统，需要定期进行质控，以确保检测结果的准确性。本方案的多水平质控品涵盖临床正常凝血、高凝、低凝、小Angle等多种状态，模拟临床实际检测环境，与血栓弹力图仪、配套试剂、氯化钙溶液联合使用，能对血栓弹力图检测系统进行质量控制或检测系统评估，保证临床样本检测结果的可靠性。
综上所述，本方案的有益效果在于：
目前，国内外用于血栓弹力图检测系统的质控品，包括美国Haemonetics公司TEG5000双水平质控品，能与血栓弹力图仪、氯化钙溶液联合使用。但该检测系统为“仪器+质控品”，因未考虑配套试剂因素，仅用于血栓弹力图仪的质量控制；Angle值较大，不能反映血凝块聚合速率较小的情况；一般只提供两水平质控品，无法满足对正常凝血、高凝、低凝、血凝块聚合速率较小等多种状态下的质量控制或检测系统评估。
本方案克服和现有技术的缺陷，提供了一种能模拟临床实际检测环境(试剂+仪器+质控品)、涵盖临床正常凝血、高凝、低凝、小Angle值的多水平质控品。用户可方便对血栓弹力图检测系统进行的质量控制或检测系统评估，保证临床样本检测结果的可靠性。本发明以猪血为主要原料，来源充足，成本较低；本发明制备工艺简单、产品稳定、易于工业化生产；制备的三水平质控品，能模拟临床实际检测环境(试剂+仪器+质控品)，涵盖临床正常凝血、高凝、低凝、血凝块聚合速率较小等多种状态下，用户可方便对血栓弹力图检测系统进行的质量控制或检测系统评估，保证临床样本检测结果的可靠性。
附图说明
图1为本发明实施例1的表1结果1的检测图谱。
图2为本发明实施例1的表4结果1的检测图谱。
图3为本发明实施例1的表5结果1的检测图谱。
图4为本发明实施例1的表8结果1的检测图谱。
图5为本发明实施例1的表9结果1的检测图谱。
图6为本发明实施例1的表12结果1的检测图谱。
图7为本发明对比例1的不使用羟乙基淀粉溶液的检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
本方案实施例和对比例中，涉及到的主要检测仪器、配套试剂、原料信息如下：
DRNX-Ⅲ型血栓弹力图仪：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；DRNX-Ⅳ型血栓弹力图仪：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；DRNX-Ⅴ型血栓弹力图仪：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；TEG5000血栓弹力图仪：美国Haemonetics公司；血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；氯化钙溶液：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；抗凝猪血：重庆沙格生态农业开发有限公司；蔗糖：国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸：国药集团化学试剂有限公司；氯化钠：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸钠二水物：国药集团化学试剂有限公司；Proclin 300：Sigma；叠氮化钠：Sigma；1M Hepes：北京索莱宝科技有限公司；依诺肝素钠：大连美仑生物技术有限公司；羟乙基淀粉130/0.4(13万道尔顿，40％羟乙基化)：上海吉至生化科技有限公司；纤维蛋白原基质液：重庆鼎润医疗器械有限责任公司；血浆基质液：重庆鼎润医疗器械有限责任公司。
实施例1：血栓弹力图质控品水平1(正常值质控品)
1.血浆基质液与纤维蛋白原基质液的制备
(1)抗凝猪血的采集：在生猪屠宰时，按新鲜猪全血与3.8％柠檬酸钠抗凝剂的体积比为9：1混合，采集抗凝猪血。
(2)猪血浆的制备：收集的抗凝猪血，室温放置3～6小时，静置分层。吸取上层液体，放入管式离心机离心，设置离心参数：转速4500rpm，时间15min，温度4℃。离心后小心吸出上层清液，加入终浓度为0.02％的叠氮化钠防腐剂，得猪血浆，-20～-30℃冷冻保存(有效期3年)。下层主要为红细胞，按医疗垃圾废物处理。
(3)血浆基质液与纤维蛋白原基质液的制备：将已冻成坚硬冰块状的猪血浆，置于2～8℃环境，缓慢解冻，至尚存少许碎冰块。猪血浆放入管式离心机离心，设置离心参数：转速4500rpm，时间15min，温度4℃。离心后，小心吸出血浆基质液，-20～-30℃冷冻保存(有效期3年)；收集下层即为纤维蛋白原基质液，-20～-30℃冷冻保存(有效期3年)。
2.制备血栓弹力图质控品水平1(正常值质控品)
(1)取出已冷冻的纤维蛋白原基质液，置于37±2℃水浴锅中快速解冻。取解冻后的100.0mL纤维蛋白原基质液加入1000mL烧杯中，再加入900mL血浆基质液，得溶液A。在本步骤中，纤维蛋白原基质液和血浆基质液的比例可控制在5～15：82～94，这样在后续调整过程中，可以更为容易的将MA值调整到60.0～80.0mm范围内。
(2)取溶液A，用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)等)检测，要求MA值在60.0～80.0mm范围内；当MA值＜60.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞80.0mm时，加入适量血浆基质液。调整结束后，取1000ml的MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A。
(3)在1000ml的MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A中加入10mL 1M Hepes溶液(pH缓冲剂)、10mL 1M蔗糖溶液(蛋白质保护剂)、10mL 1M甘氨酸溶液(蛋白质保护剂)、0.1mL Proclin300(防腐剂)、0.15mL 1％依诺肝素钠溶液(抗凝剂，即1.5ppm)，得溶液B1。
在本方案中，pH缓冲剂可选用Hepes、Tris-HCl和磷酸盐缓冲剂中的一种，pH缓冲剂的pH值为7.0～7.5，浓度为1M；pH缓冲剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的0.5～1.5％。蛋白质保护剂可选牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、甘露醇、乳糖中的至少一种，浓度为1M；蛋白质保护剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的1～3％。防腐剂可选择Proclin 300、叠氮化钠和苯甲酸钠中的一种，防腐剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的0.01％。抗凝剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的1.0～2.0ppm。采用上述用量条件均可制备符合本方案要求的质控品。其中，冻干保护剂包括蛋白质保护剂、pH缓冲剂和防腐剂，冻干保护剂的用量为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的1.51-4.51％。
(4)取溶液B1，用血栓弹力图仪及配套试剂检测，要求MA值在50.0～70.0mm范围内；当MA值＜50.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞70.0mm时，加入适量血浆基质液。调整结束后获得，MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B1。
(5)MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B1经冻干40小时，得血栓弹力图质控品水平1冻干品，在2～8℃密闭保存，有效期12月。
3.血栓弹力图质控品水平1的性能检测(变异系数)
外观：产品为类白色或淡黄色固体，复溶后为无色或淡黄色液体。
均匀性：用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测结果见表1，在表1中“结果1”的检测图谱见图1(批号20190901)。由检测结果可知，血栓弹力图质控品水平1的R值、K值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均较小，符合要求(要求R值、K值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均应≤15％)，说明使用血栓弹力图质控品水平1作为质控品，比较稳定。
表1：血栓弹力图质控品水平1的性能检测结果
| 检测参数 | R值(min) | K值(min) | Angle值(deg) | MA值(mm) |
| 结果1 | 5.4 | 0.8 | 80.9 | 57.9 |
| 结果2 | 5.4 | 0.8 | 80.4 | 60.0 |
| 结果3 | 5.9 | 0.8 | 80.7 | 60.3 |
| 结果4 | 5.8 | 0.8 | 81.1 | 60.3 |
| 结果5 | 6.8 | 0.9 | 77.8 | 56.7 |
| 结果6 | 6.6 | 0.8 | 79.0 | 57.6 |
| 结果7 | 5.8 | 0.8 | 79.7 | 59.8 |
| 结果8 | 5.8 | 0.8 | 80.0 | 60.0 |
| 结果9 | 6.2 | 0.8 | 80.1 | 57.7 |
| 结果10 | 5.9 | 0.8 | 80.8 | 58.9 |
| 结果11 | 6.4 | 0.8 | 79.2 | 57.3 |
| 结果12 | 5.8 | 0.8 | 79.8 | 57.0 |
| 结果13 | 5.8 | 0.8 | 79.7 | 58.7 |
| 结果14 | 5.8 | 0.8 | 80.4 | 60.6 |
| 结果15 | 5.8 | 0.8 | 79.0 | 58.1 |
| 结果16 | 5.8 | 0.8 | 80.7 | 61.2 |
| 结果17 | 6.1 | 0.8 | 79.7 | 59.2 |
| 结果18 | 6.1 | 0.8 | 79.1 | 56.4 |
| 结果19 | 5.8 | 0.8 | 80.1 | 57.5 |
| 结果20 | 5.8 | 0.8 | 79.6 | 57.7 |
| CV | 6.1％ | 2.9％ | 1.1％ | 2.5％ |
4.血栓弹力图质控品水平1不同适用机型检测结果的相对偏差
分别随机抽取10支同一批质控品，用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))。分别计算相应机型测定值的均值
检测结果如表2所示(要求以TEG-5000型测定值的均值
为基准，其他机型测定值的均值
相对偏差应≤15.0％)。说明本方案的血栓弹力图质控品水平1通用于相应的适应机型。
表2：血栓弹力图质控品水平1不同适用机型检测结果的相对偏差
5.血栓弹力图质控品水平1赋值范围
产品用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))检测。计算所有机型测定值的均值
并按以下公式计算所有机型测定值的标准差(SD)，将
作为所有机型赋值范围的上限，将
作为所有机型赋值范围的下限，其检测结果如表3。临床使用者将质控品的检测结果与该批赋值范围进行比较，即可判断仪器和配套试剂是否处于正常状态。
表3：血栓弹力图质控品水平1赋值范围
| 性能参数 | R(min) | K(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
| 赋值范围 | 4.5-6.9 | 0.7-0.9 | 67.1-90.7 | 50.8-68.8 |
6.血栓弹力图质控品水平1稳定性检测
产品在2～8℃密闭保存12月后，用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测，结果均在产品赋值范围内，数据如表4。“结果1”的检测图谱见图2(批号20190901)。检测结果显示本方案获得的血栓弹力图质控品水平1性质稳定性，在保存12个月之后，仍然具有检测效力。
表4：血栓弹力图质控品水平1稳定性检测结果
实施例2：血栓弹力图质控品水平2(高凝质控品)
1.制备血栓弹力图质控品水平2
(1)取出已冷冻的纤维蛋白原基质液，置于37±2℃水浴锅中快速解冻。取解冻后的100.0mL纤维蛋白原基质液加入1000mL烧杯中，再加入900mL血浆基质液，得溶液A。在本步骤中，纤维蛋白原基质液和血浆基质液的比例可控制在5～15：82～94，这样在后续调整过程中，可以更为容易的将MA值调整到60.0～80.0mm范围内。
(2)取溶液A，用血栓弹力图仪(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000等)及配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)等)检测，要求MA值在60.0～80.0mm范围内；当MA值＜60.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞80.0mm时，加入适量血浆基质液。调整结束后，取1000ml的MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A。
(3)在1000ml的MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A中加入10mL 1M Hepes溶液、10mL 1M蔗糖溶液、10mL 1M甘氨酸溶液、0.1mL Proclin300、0.05mL 1％依诺肝素钠溶液(抗凝剂，即0.5ppm)，得溶液B2。
在本方案中，pH缓冲剂可选用Hepes、Tris-HCl和磷酸盐缓冲剂中的一种，pH缓冲剂的pH值为7.0～7.5，浓度为1M；pH缓冲剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的0.5～1.5％。蛋白质保护剂可选牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、甘露醇、乳糖中的至少一种，浓度为1M；蛋白质保护剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的1～3％。防腐剂可选择Proclin 300、叠氮化钠和苯甲酸钠中的一种，防腐剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的0.01％。抗凝剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A的0.1～0.8ppm。采用上述用量条件均可制备符合本方案要求的质控品。
(4)取溶液B2，用血栓弹力图仪及配套试剂检测，要求MA值在50.0～70.0mm范围内；当MA值＜50.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞70.0mm时，加入适量血浆基质液。调整结束后获得，MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B2。
(5)MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B2经冻干40小时，得血栓弹力图质控品水平2冻干品，在2～8℃密闭保存，有效期12月。
2.血栓弹力图质控品水平2的性能检测(变异系数)
外观：产品为类白色或淡黄色固体，复溶后为无色或淡黄色液体。
均匀性：用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测结果见表5，在表5中“结果1”的检测图谱见图3(批号20190901)。由检测结果可知，血栓弹力图质控品水平2的R值、K值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均较小，符合要求(要求R值、K值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均应≤15％)，说明使用血栓弹力图质控品水平2作为质控品，比较稳定。
表5：血栓弹力图质控品水平2的性能检测结果
3.血栓弹力图质控品水平2不同适用机型检测结果的相对偏差
分别随机抽取10支同一批质控品，用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))。分别计算相应机型测定值的均值
检测结果如表6所示(要求以TEG-5000型测定值的均值
为基准，其他机型测定值的均值
相对偏差应≤15.0％)。说明本方案的血栓弹力图质控品水平2通用于相应的适应机型。
表6：血栓弹力图质控品水平2不同适用机型检测结果的相对偏差
4.血栓弹力图质控品水平2赋值范围
产品用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))检测。计算所有机型测定值的均值
并按以下公式计算所有机型测定值的标准差(SD)，将
作为所有机型赋值范围的上限，将
作为所有机型赋值范围的下限，其检测结果如表7所示。临床使用者将质控品的检测结果与该批赋值范围进行比较，即可判断仪器和配套试剂是否处于正常状态。
表7：血栓弹力图质控品水平2赋值范围
| 性能参数 | R(min) | K(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
| 赋值范围 | 2.5-4.6 | 0.7-0.9 | 70.9-95.9 | 55.7-75.3 |
5.血栓弹力图质控品水平2稳定性检测
产品在2～8℃密闭保存12月后，用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测，结果均在产品赋值范围内，数据如表8所示。“结果1”的检测图谱见图4(批号20190901)。检测结果显示本方案获得的血栓弹力图质控品水平2性质稳定性，在保存12个月之后，仍然具有检测效力。
表8：血栓弹力图质控品水平2稳定性检测结果
实施例3：血栓弹力图质控品水平3(低凝质控品)
1.制备血栓弹力图质控品水平3
(1)取出已冷冻的纤维蛋白原基质液，置于37±2℃水浴锅中快速解冻。取解冻后的70.0mL纤维蛋白原基质液加入1000mL烧杯中，再加入200mL血浆基质液和730mL 6％羟乙基淀粉130/0.4生理盐水溶液(6％羟乙基淀粉生理盐水溶液，即人工血浆)，得溶液A’。在本操作步骤中，纤维蛋白原基质液、血浆基质液和6％羟乙基淀粉130/0.4生理盐水溶液的体积比控制在2～10：18～22：67～74均可以制备获得符合要求的质控品。
(2)取溶液A’，用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)等)检测，要求MA值在30.0～65.0mm范围内；当MA值＜30.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞65.0mm时，加入适量血浆基质液。调整结束后，取1000ml的MA值在30.0～65.0mm范围内的溶液A’。
(3)在1000ml的MA值在30.0～65.0mm范围内的溶液A’中加入10mL 1M Hepes溶液、10mL 1M蔗糖溶液、10mL 1M甘氨酸溶液、0.1mL Proclin300、0.05mL 1％依诺肝素钠溶液(抗凝剂，即0.5ppm)，得溶液B’。
在本方案中，pH缓冲剂可选用Hepes、Tris-HCl和磷酸盐缓冲剂中的一种，pH缓冲剂的pH值为7.0～7.5，浓度为1M；pH缓冲剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在30.0～65.0mm范围内的溶液A’的0.5～1.5％。蛋白质保护剂可选牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、甘露醇、乳糖中的至少一种，浓度为1M；蛋白质保护剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A’的1～3％。防腐剂可选择Proclin 300、叠氮化钠和苯甲酸钠中的一种，防腐剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A’的0.01％。抗凝剂的使用量(以体积百分数表示)为MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A’的0.1～0.8ppm。采用上述用量条件均可制备符合本方案要求的质控品。
(4)取溶液B’，用血栓弹力图仪及配套试剂检测，要求MA值在20.0～55.0mm范围内；当MA值＜20.0mm时，加入适量纤维蛋白原基质液；当MA值＞55.0mm时，加入适量血浆基质液。。调整结束后，取1000ml的MA值在20.0～55.0mm范围内的溶液B’。
(5)MA值在20.0～55.0mm范围内的溶液B’经冻干40小时，得血栓弹力图质控品水平3冻干品，在2～8℃密闭保存，有效期12月。
2.血栓弹力图质控品水平3的性能检测(变异系数)
外观：产品为类白色或淡黄色固体，复溶后为无色或淡黄色液体。
均匀性：用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测结果见表9，在表9中“结果1”的检测图谱见图5(批号20190901)。由检测结果可知，血栓弹力图质控品水平3的R值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均较小，符合要求(要求R值、Angle值、MA值的变异系数(CV)均应≤15％)，说明使用血栓弹力图质控品水平3作为质控品，比较稳定。注：K值与Angle值密切相关,都是反映血凝块聚合的速率。当凝血处于重度低凝状态时，血块幅度达不到20mm，此时K值无法确定。
表9：血栓弹力图质控品水平3的性能检测结果
| 检测参数 | R值(min) | K值(min) | Angle值(deg) | MA值(mm) |
| 结果1 | 4.3 | - | 50.1 | 18.3 |
| 结果2 | 4.2 | - | 53.4 | 19.4 |
| 结果3 | 4.3 | - | 51.5 | 17.9 |
| 结果4 | 4.4 | - | 47.4 | 22.6 |
| 结果5 | 4.1 | - | 55.9 | 21.8 |
| 结果6 | 4.2 | - | 54.4 | 18.7 |
| 结果7 | 4.3 | - | 52.6 | 21.8 |
| 结果8 | 4.4 | - | 46.9 | 17.8 |
| 结果9 | 4.4 | - | 47.2 | 17.4 |
| 结果10 | 4.3 | - | 53.6 | 20.8 |
| 结果11 | 4.2 | - | 55.3 | 19.3 |
| 结果12 | 4.1 | - | 57.5 | 20.5 |
| CV | 2.7％ | - | 6.9％ | 9.6％ |
3.血栓弹力图质控品水平3不同适用机型检测结果的相对偏差
分别随机抽取10支同一批质控品，用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))。分别计算相应机型测定值的均值
检测结果如表10所示(要求以TEG-5000型测定值的均值
为基准，其他机型测定值的均值
相对偏差应≤15.0％)。说明本方案的血栓弹力图质控品水平3通用于相应的适应机型。
表10：血栓弹力图质控品水平3不同适用机型检测结果的相对偏差
4.血栓弹力图质控品水平3赋值范围
产品用不同适用机型(DRNX-Ⅲ型、DRNX-Ⅳ型、DRNX-Ⅴ型、TEG 5000)与配套试剂(血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法))检测。计算所有机型测定值的均值
并按以下公式计算所有机型测定值的标准差(SD)，将
作为所有机型赋值范围的上限，将
作为所有机型赋值范围的下限，其检测结果如表11所示。临床使用者将质控品的检测结果与该批赋值范围进行比较，即可判断仪器和配套试剂是否处于正常状态。
表11：血栓弹力图质控品水平3赋值范围
| 性能参数 | R(min) | K(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
| 赋值范围 | 3.7-4.8 | - | 45.6-59.5 | 16.7-23.5 |
5.血栓弹力图质控品水平3稳定性检测
产品在2～8℃密闭保存12月后，用血栓弹力图仪(如DRNX-Ⅲ型)及血栓弹力图试验(活化凝血)试剂(凝固法)检测，结果均在产品赋值范围内，数据如表12所示。“结果1”的检测图谱见图6(批号20190901)。检测结果显示本方案获得的血栓弹力图质控品水平2性质稳定性，在保存12个月之后，仍然具有检测效力。
表12：血栓弹力图质控品水平3稳定性检测结果
| 检测参数 | R值(min) | K值(min) | Angle值(deg) | MA值(mm) |
| 结果1 | 4.5 | - | 51.5 | 18.9 |
| 结果2 | 4.4 | - | 49.0 | 18.2 |
| 结果3 | 4.4 | - | 50.6 | 19.0 |
| 结果4 | 4.3 | - | 47.3 | 18.1 |
| 结果5 | 4.3 | - | 49.5 | 18.1 |
| 结果6 | 4.1 | - | 55.7 | 22.0 |
| 结果7 | 4.4 | - | 50.1 | 17.1 |
| 结果8 | 4.2 | - | 50.2 | 18.2 |
| 结果9 | 4.6 | - | 50.9 | 19.2 |
| 结果10 | 4.2 | - | 56.9 | 22.6 |
| 结果11 | 4.5 | - | 48.1 | 17.6 |
| 结果12 | 4.2 | - | 55.6 | 22.2 |
| 赋值范围 | 3.7-4.8 | - | 45.6-59.5 | 16.7-23.5 |
对比例1：
本对比例基本同实施例3，不同点在于，本对比例不使用羟乙基淀粉130/0.4溶液，具体区别点在于：取出已冷冻的纤维蛋白原基质液，置于37±2℃水浴锅中快速解冻。取解冻后的70.0mL纤维蛋白原基质液加入1000mL烧杯中，再加入930mL血浆基质液，得溶液A。
其余步骤与实施例3相同，经检测(参见图7)，本对比例制得的质控品的Angle值为82.9°，远大于实施例1所制备的质控品的Angle值(参见图5和图6)。目前，国内外用于血栓弹力图检测系统的质控品，包括美国Haemonetics公司TEG 5000双水平质控品的Angle值较大，不能反映血凝块聚合速率较小的情况。制备小Angle值的难度较大，主要原因是Angle值的大小受质控品基质、抗凝剂比例等多种因素影响，单纯调整纤维蛋白原基质液、血浆基质液、保护剂、抗凝剂等的比例，无法调至需要的小Angle值。发明人经过多方尝试，意外发现，使用羟乙基淀粉130/0.4溶液代替部分血浆基质液，可以解决长期以来无法解决的技术问题。加入适量的人造代血浆(6％羟乙基淀粉生理盐水溶液)和适量的抗凝物质，二者的协同作用能调整到需要的小Angle值，且稳定较好的血栓弹力图质控品水平3，具体参见实施例3的实验结果。
对比例2：
本对比例研究了不同抗凝物质对于质控品的制备的效果。在使用质控品对“试剂+仪器”的临床实际检测环境进行检测的时候，由于试剂的使用，使得R值偏小，发明人通过大量研究发现，加入一定量的抗凝剂，可以调整R值至需要的范围，特别是在制备较大R值的质控品的时候。但是，不同的抗凝剂的使用对质控品的稳定性有一定影响。现以制备血栓弹力图质控品水平1的情况为例进行说明，按照实施例1的制备方法获得血栓弹力图质控品水平1，并在制备的过程中使用不同的抗凝剂(肝素钠、肝素锂、柠檬酸钠、依诺肝素钠)，对获得的质控品进行血栓弹力图仪检测，实验结果参见表13。实验结果显示，加入肝素钠、肝素锂和柠檬酸钠等抗凝物质时，产品的稳定性较差，其检测结果的CV值(不精密度)较大；而加入适量的依诺肝素钠，能调整到需要的R值，且稳定较好，其检测结果的CV值(不精密度)较小。
表13：使用不同抗凝剂的样品CV值检测结果
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.多水平质控品，其特征在于：包括血栓弹力图质控品水平1；所述血栓弹力图质控品水平1由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液和血浆基质液配制MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A；然后加入冻干保护剂、终浓度为1.0～2.0ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B1。
2.根据权利要求1所述的多水平质控品，其特征在于：还包括血栓弹力图质控品水平2；所述血栓弹力图质控品水平2由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液和血浆基质液配制MA值在60.0～80.0mm范围内的溶液A；然后加入冻干保护剂、终浓度为0.1～0.8ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B2。
3.根据权利要求2所述的多水平质控品，其特征在于：还包括血栓弹力图质控品水平3；所述血栓弹力图质控品水平3由如下方法制备：使用纤维蛋白原基质液、血浆基质液和羟乙基淀粉生理盐水溶液配制MA值在30.0～65.0mm范围内的溶液A’；然后加入冻干保护剂、终浓度为0.1～0.8ppm的抗凝剂；再配制MA值在50.0～70.0mm范围内的溶液B’。
4.根据权利要求3所述的多水平质控品，其特征在于：所述抗凝剂为依诺肝素钠。
5.根据权利要求4所述的多水平质控品，其特征在于：所述冻干保护剂包括蛋白质保护剂、pH缓冲剂和防腐剂。
6.根据权利要求5所述的多水平质控品，其特征在于：所述蛋白质保护剂包括牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、甘露醇和乳糖中的至少一种；所述pH缓冲剂为Hepes缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂和磷酸盐缓冲剂中的一种；所述防腐剂为Proclin 300、叠氮化钠和苯甲酸钠中的一种。
7.根据权利要求6所述的多水平质控品，其特征在于：所述纤维蛋白原基质液和所述血浆基质液由如下方法制备：在新鲜猪血中加入柠檬酸钠，获得抗凝猪血；待抗凝猪血静置分层，取分层的抗凝猪血的上层液体，离心后取上层清液，加入叠氮化钠后获得的猪血浆；4500rpm离心处理所述猪血浆15min，分别收集位于上层的血浆基质液和位于下层的纤维蛋白原基质液。
8.根据权利要求7所述的多水平质控品的制备方法，其特征在于：将纤维蛋白原基质液和血浆基质液混合，并将MA值调整至60.0～80.0mm；然后加入冻干保护剂和抗凝剂，并将MA值调整至50.0～70.0mm；再经过冻干处理，获得血栓弹力图质控品水平1或者血栓弹力图质控品水平2。
9.根据权利要求8所述的多水平质控品的制备方法，其特征在于：将纤维蛋白原基质液、血浆基质液和羟乙基淀粉生理盐水溶液混合，并将MA值调整至30.0～65.0mm；然后加入冻干保护剂和抗凝剂，并将MA值调整至20.0～55.0mm；再经过冻干处理，获得血栓弹力图质控品水平3。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的多水平质控品作为血栓弹力图检测系统的质控品的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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