CN110346582A - 一种凝血复合质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种凝血复合质控品的制备方法，包括以下步骤；吸附：向动物血浆中加入吸附剂，得到第一混合血浆；吸附完成后，对所述第一混合血浆进行分离，得到第一血浆和吸附有凝血因子的第一吸附剂，使所述第一血浆的ATPP值和PT值均大于100s；解吸附：将所述第一吸附剂与所述动物血浆混合，得到第二混合血浆；解吸附完成后，对所述第二混合血浆进行分离，得到第三血浆和第二吸附剂，使所述第三血浆的ATPP和PT值均在正常人凝血指标内；冷冻干燥：将所述第三血浆与基础液混合，冷冻干燥，得到第二质控品。该方法通过吸附剂吸附与解吸附的方式调整动物血浆中凝血因子的浓度，进而得到ATPP和PT值均在正常人凝血指标内的、稳定性良好的凝血复合质控品。

Description

一种凝血复合质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床凝血检验项目质量控制技术领域，特别涉及一种凝血复合质控品及其制备方法。

背景技术

血液凝固是一系列凝血因子酶反应过程，凝血因子按照一定顺序激活，最终使血浆中的可溶性纤维蛋白原转化为不可溶的交联纤维蛋白，简称凝血。通常根据凝血酶原激活物的形成始动途径与因子的不同，可将凝血过程分为内源性凝血和外源性凝血两条途径。凝血检测主要包括止血和血栓检测，据《中国心血管病报告2015》可知，我国目前心脑血管疾病患病人数约2.9亿，居各种死因的首位。而血栓形成是导致心脑及外周血管事件的最后关键环节，是致死或致残的直接原因，可以说没有血栓就没有心血管疾病。血栓栓塞性疾病几乎涵盖所有的临床科室。

临床上目前对凝血的常规检验主要有活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)等。而其中APTT和PT通常用于评估内源性和外源性凝血因子的缺陷，并作为术前止血功能的检查，在凝血检验中尤为重要。

基于凝血检测在临床上的重要性，使用稳定可靠的凝血质控品对凝血检测系统进行室内质量控制，确保检测结果的可靠性非常重要。目前，市面上的凝血质控品主要来源于人体血浆，生物风险比较大，且通常采用冷沉淀方法去除凝血因子，将去除凝血因子后的血浆与正常血浆混合从而得到凝血因子浓度不同的血浆。但是，此方法存在不能使APTT/PT凝固时间缩短的局限性，加上人体凝血因子相对不稳定，此方法对采血后的样本处理、保存及后续处理过程要求非常严格，很难满足大量生产的要求。

因此，如何提供一种动物血浆凝血复合质控品，以替代人血浆的使用，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种凝血复合质控品及其制备方法，该方法通过吸附剂吸附与解吸附的方式调整动物血浆中凝血因子的浓度，进而得到凝固时间不同的、稳定性良好的凝血复合质控品。

本发明所述的一种凝血复合质控品的制备方法，包括以下步骤：吸附：向动物血浆中加入吸附剂，得到第一混合血浆；吸附完成后，对所述第一混合血浆进行分离，得到第一血浆和吸附有凝血因子的第一吸附剂，使所述第一血浆的ATPP值和PT值均大于100s；解吸附：将所述第一吸附剂与所述动物血浆混合，得到第二混合血浆；解吸附完成后，对所述第二混合血浆进行分离，得到第三血浆和第二吸附剂，使所述第三血浆的ATPP和PT值均在正常人凝血指标内；冷冻干燥：将所述第三血浆与基础液混合，冷冻干燥，得到第二质控品。

优选的，还包括将所述第一血浆与所述动物血浆混合，得到第二血浆的过程；然后，将所述第二血浆与基础液混合，冷冻干燥，得到第一质控品。

通过将所述第一血浆与所述动物血浆混合，可以在回收利用反应副产物的同时，得到ATPP和PT值在病理水平范围内的病理水平质控品。

优选的，所述吸附条件为，将所述第一混合血浆在2-8℃下震荡 20-60min。

实际的吸附时间及温度应依据待调节的动物血浆的APTT和PT值进行确定。通过在吸附过程中对第一混合血浆的APTT和PT值进行实时监控，可以使分离得到的第一血浆的APTT和PT值均达到目标值。

优选的，所述解吸附条件为，将所述第二混合血浆在25-37℃下震荡 5-10min。其中，优选在37℃条件下震荡5min。

操作过程中，可以通过提高温度或延长时间来增加第一吸附剂的解吸附量，通过在解吸附过程中对第二混合血浆的APTT和PT值进行实时监控，可以使分离得到的第三血浆的APTT和PT值达到目标值。

优选的，所述第一血浆与动物血浆的混合比例为1:1-1:10。由于不同的混合比例得到的第二血浆的APTT和PT值不同，所以实际操作过程中，混合比例会根据临床使用需求进行调整。

同理，由于不同动物血浆的APTT和PT值不同，所以在制备正常水平质控血浆(第三血浆)时，第一吸附剂的加入量应依据待调节的动物血浆的APTT 和PT值进行调整。

优选的，所述解吸附过程中，第一吸附剂的浓度为0.5-10g/L，优选1.0-5.0g /L。

优选的，所述动物血浆为牛血浆、猪血浆、兔血浆、马血浆、羊血浆、狗血浆中的一种或两种以上的混合物。

优选的，本发明中动物血浆的制备方法为，用静脉穿刺法或动脉穿刺法采集动物血液，按血液与抗凝剂体积比为9:1的比例加入0.09mmol/L的柠檬酸钠抗凝剂，混匀后离心10-15min，相对离心力为2000-3000g，取上层血浆。

本发明选用动物血浆，尤其是非灵长类动物血浆制备复合质控品。与人来源血浆相比，动物血浆的凝血因子更加稳定，可消除感染AIDS或肝炎病毒的风险。研究表明，不同的动物血浆具有不同浓度水平的凝血因子，其APTT、 PT也具有不同的凝固时间。与人来源血浆的APTT和PT时间相比，兔血浆的PT值缩短；猪血浆的APTT值缩短，但PT值不缩短；牛血浆的PT和ATPP 值均延长；马血浆的ATPP值延长，但PT值不缩短。为了制备出ATPP值和 PT值同时满足靶值要求的凝血复合质控品，往往需要对动物血浆中的ATPP 值和PT值进行相应的调整。虽然目前有相关专利报道了通过将不同的动物血浆按照一定的比例混合，可以制备出ATPP值和PT值同时满足使用需求的凝血复合质控品。但是，通过实验发现，虽然在某些情况下可以通过简单混合得到单项值满足需求的质控品，然而，通过这种方式难以获得APTT和PT值同时满足要求的复合质控品。

为了解决这个问题，本发明采用吸附剂吸附与解吸附的方法调整动物血浆中凝血因子的浓度，从而得到APTT和PT值均在正常人凝血指标内的、稳定性良好的凝血复合质控品。

首先，本发明将吸附剂与动物血浆混合，得到第一混合血浆，待吸附过程完成后，对第一混合血浆进行分离，得到第一血浆和吸附有凝血因子的第一吸附剂，通过调整吸附剂的含量及吸附时间来控制第一混合血浆中的APTT 和PT值，进而控制第一血浆中的APTT和PT值，使第一血浆的APTT和PT 值均大于100s。上述步骤完成后，本发明将第一吸附剂与动物血浆混合，得到第二混合血浆，使第一吸附剂在动物血浆中发生解吸附后，再对第二混合血浆进行分离，得到第二吸附剂和凝血因子含量相对较多的的第三血浆。通过调整第一吸附剂的含量及解吸附时间可以控制第二混合血浆中的APTT和 PT值，进而控制第三血浆的APTT和PT值，使第三血浆的APTT和PT值均在正常人凝血指标内。最后，将第三血浆与基础液按一定比例混合后冷冻干燥，即可得到APTT和PT值均在正常人凝血指标内的、稳定性良好的凝血复合质控品。

本文所述的正常人凝血指标为APTT值在22.7s-31.8s之间，PT值在 10.0-14.0s之间。

需要说明的是，为了保证凝血检测的准确度，往往需要确保质控品中的纤维蛋白原浓度在正常的区间范围内，过低的纤维蛋白原浓度可能由于反应信号过低导致凝血仪检测出现较大偏差。因此，在选用血浆时应该保证纤维蛋白原浓度在正常范围内(2.0-4.0g/L)，否则需添加部分纤维蛋白原。

优选的，所述吸附剂为琼脂糖凝胶、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅胶中的一种或几种。

优选的，所述吸附剂的浓度为0.5-10g/L。

优选的，所述吸附剂的浓度为1.0-5.0g/L。

优选的，所述基础液包括糖类、抑肽酶、防腐剂中的一种或几种，以及缓冲液。

基础液中各添加物的选择依据如下：

糖类主要是作为保护剂及冻干时的赋形剂；抑肽酶主要是用于抑制某些凝血因子的激活，从而提升质控品的稳定性；缓冲剂主要是为了维持体系的酸碱度，保持凝血因子活性；防腐剂主要用于抑菌，提高质控品的稳定性。

优选的，所述糖类为蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖单糖、多糖中的一种或几种。

优选的，所述缓冲液为三羟基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(Pipes)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(Hepes)、3-(N-吗啉) 丙磺酸缓冲液(Mops)中的任一种。

优选的，所述糖类的浓度为10-40g/L。

优选的，所述抑肽酶的浓度为5-500u/mL。

优选的，所述缓冲液的浓度为10-50mmol/L。

优选的，所述缓冲液的pH值为7.0-8.0。

优选的，所述糖类的浓度为1.0-5.0g/L。

优选的，所述抑肽酶的浓度为10-100u/mL。

优选的，所述缓冲液的浓度为15-30mmol/L。

优选的，所述缓冲液的pH值为7.4。

优选的，所述防腐剂为叠氮化钠。

优选的，所述第二血浆与所述基础液的混合比例为5:1-20:1，和/或，所述第三血浆与所述基础液的混合比例为5:1-20:1。

除此之外，本发明还提供一种凝血复合质控品，该质控品由上述任意一种制备方法制备。

与现有技术相比，本发明具有下列优势：

根据本发明提供的方法可以制备出同时满足APTT、PT靶值需求的质控血浆，进而监测APTT、PT项目；由于本发明采用的主要原料为动物血浆，来源充足，易于获取，尤其是非灵长类动物，与人来源血浆相比，凝血因子更加稳定，可消除感染AIDS或肝炎病毒的风险，所以比市售的人源凝血质控品生物风险更小。特别是相较于通过冷沉淀法去除凝血因子进而调整血浆凝固时间的方法而言，本发明还能够缩短APTT和PT的凝固时间，使得APTT 和PT的凝固时间满足实际使用需求。除此之外，本发明还具有操作简便，原料成本低的优势，能够满足大批量生产的要求。同时，由于本发明提供的凝血复合质控品冻干后复溶稳定性好，所以能够代替进口产品用于凝血项目检测的质量控制，适用于在临床上的推广和应用。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合具体实施例对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1

实施例1提供的一种凝血复合质控品，依据以下制备方法制备：

步骤1，基础液的配制：按Hepes20mmol/L，甘露醇25g/L，抑肽酶 10u/mL，以及叠氮化钠0.5g/L配制基础液。

步骤2，准确量取100mL柠檬酸钠抗凝的新鲜牛血浆，加入10mL琼脂糖凝胶(含量为10％)，置于4℃下震荡30min，保持4℃条件下以5000rpm 离心10min，取上层血浆(第一血浆)。

步骤3，将第一血浆与新鲜牛血浆按体积比1:1混合均匀(得到第二血浆)，取第二血浆90mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得病理水平APTT/PT质控(第一质控品)，4℃保存。

步骤4，向离心后的琼脂糖凝胶中加入100mL新鲜牛血浆(得到第二混合血浆)，37℃下震荡5min，保持在室温条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(第三血浆)。

步骤5，取步骤4中的第三血浆90mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得正常水平APTT/PT质控(第二质控品)，4℃保存。

制备完成后，利用sysmex CS-1600全自动凝血分析仪及配套siemens APTT/PT检测试剂测试上述两水平APTT/PT质控，结果如表1所示：

表1.APTT/PT质控血浆值

由上述实验数据可知，依据本方法能够制备出APTT和PT值在正常范围内的正常水平质控血浆，以及APTT和PT值属于病理值范围的病理水平质控血浆。

除此之外，为了检测本实施例制备的凝血复合质控品的稳定性。本实施例还将第一质控品和第二质控品放置在37℃条件下保存，每隔一天取样一次，利用sysmex CS-1600全自动凝血分析仪及配套siemens APTT/PT检测试剂对取得的样品进行测试。检测结果见表2：

表2.APTT/PT质控品稳定性结果

从表2数据可知，实施例1制备的第一质控品和第二质控品在37℃条件下放置15天后测试值仍未发生明显变化，稳定性良好，能够满足检测需求。

实施例2

步骤1，按Hepes20mmol/L，甘露醇25g/L，抑肽酶10u/mL，以及叠氮化钠0.5g/L配制基础液。

步骤2，准确量取100mL柠檬酸钠抗凝的新鲜兔血浆，加入10mL琼脂糖凝胶(含量为10％)，置于4℃下震荡30min，保持4℃条件下以5000rpm 离心10min，取上层血浆(第一血浆)。

步骤3，将第一血浆与新鲜兔血浆按体积比2:5混合均匀(得到第二血浆)，取第二血浆60mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得病理水平APTT/PT质控(第一质控品)，4℃保存。

步骤4，向离心后的琼脂糖凝胶中加入100mL新鲜兔血浆(得到第二混合血浆)，37℃下震荡5min，保持在室温条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(第三血浆)。

步骤5，取步骤4中的第三血浆60mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得正常水平APTT/PT质控(第二质控品)，4℃保存。

制备完成后，利用sysmex CS-1600全自动凝血分析仪及配套siemens APTT/PT检测试剂测试上述两水平APTT/PT质控，结果如表3所示：

表3.APTT/PT质控血浆值

由表3实验数据可知，依据本方法能够制备出APTT和PT值在正常范围内的正常水平质控血浆，以及APTT和PT值属于病理值范围的病理水平质控血浆。

实施例3

步骤1，按Hepes20mmol/L，甘露醇25g/L，抑肽酶10u/mL，以及叠氮化钠0.5g/L配制基础液。

步骤2，准确量取100mL柠檬酸钠抗凝的新鲜牛血浆，加入1.0g碱性氧化铝，置于4℃下震荡30min，保持4℃条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(第一血浆)。

步骤3，将第一血浆与新鲜牛血浆按体积比1:2混合均匀(得到第二血浆)，取第二血浆120mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得病理水平APTT/PT质控(第一质控品)，4℃保存。

步骤4，向离心后的碱性氧化铝中加入100mL新鲜牛血浆(得到第二混合血浆)，37℃下震荡5min，保持在室温条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(第三血浆)。

步骤5，取步骤4中的第三血浆120mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得正常水平APTT/PT质控(第二质控品)，4℃保存。

制备完成后，利用sysmex CS-1600全自动凝血分析仪及配套siemens APTT/PT检测试剂测试上述两水平APTT/PT质控，结果如表4所示：

表4.APTT/PT质控血浆值

由表4实验数据可知，依据本方法能够制备出APTT和PT值在正常范围内的正常水平质控血浆，以及APTT和PT值属于病理值范围的病理水平质控血浆。

实施例4

步骤1，按Hepes20mmol/L，甘露醇25g/L，抑肽酶10u/mL，以及叠氮化钠0.5g/L配制基础液。

步骤2，准确量取100mL柠檬酸钠抗凝的新鲜牛血浆5份，分别加入 0.5g、1.0、2.0g、4.0g、5.0g碱性氧化铝，置于4℃震荡30min，保持4℃条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(5种第一血浆)。

步骤3，将上述5种第一血浆与新鲜牛血浆按体积比1:2混合均匀，取混合后的血浆90mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得病理水平 APTT/PT质控(5种第一质控品)，4℃保存。

步骤4，向离心后的5份碱性氧化铝中分别加入100mL新鲜牛血浆，37℃下震荡5min，保持在室温条件下以5000rpm离心10min，取上层血浆(5种第三血浆)。

步骤5，分别取步骤4中制备的5份第三血浆90mL，加入10mL基础液，混合均匀后冷冻干燥，即得正常水平APTT/PT质控(5种第二质控品)，4℃保存。

用sysmex CS-1600全自动凝血分析仪及配套siemens APTT/PT检测试剂测试上述五个配方两水平APTT/PT质控，考察碱性氧化铝浓度对质控品凝固时间的影响，结果如表5所示：

表5.不同碱性氧化铝浓度下APTT/PT质控品测试值

从表5数据可知，当碱性氧化铝加入量过低时，吸附不够完全，导致第一质控品测试值偏低，而第二质控品由于碱性氧化铝吸附达到饱和，解析出的凝血因子量有限，导致测试值稍微偏高。而当碱性氧化铝少量过量时，凝血因子也会吸附过度，导致第一质控品测试值过高，第二质控品则由于解析的凝血因子非常多，导致测试值偏低。而当碱性氧化铝大量过量时，第二质控品在解析时反而可能出现吸附现象，导致测试值延长。因此需要严格控制碱性氧化铝或其它吸附剂的用量。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；

吸附：向动物血浆中加入吸附剂，得到第一混合血浆；吸附完成后，对所述第一混合血浆进行分离，得到第一血浆和吸附有凝血因子的第一吸附剂，使所述第一血浆的ATPP值和PT值均大于100s；

解吸附：将所述第一吸附剂与所述动物血浆混合，得到第二混合血浆；解吸附完成后，对所述第二混合血浆进行分离，得到第三血浆和第二吸附剂，使所述第三血浆的ATPP和PT值均在正常人凝血指标内；

冷冻干燥：将所述第三血浆与基础液混合，冷冻干燥，得到第二质控品。

2.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，还包括将所述第一血浆与所述动物血浆混合，得到第二血浆的过程；

然后，将所述第二血浆与基础液混合，冷冻干燥，得到第一质控品。

3.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述吸附条件为，将所述第一混合血浆在2-8℃下震荡20-60min。

4.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述解吸附条件为，将所述第二混合血浆在25-37℃下震荡5-10min。

5.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述动物血浆为牛血浆、猪血浆、兔血浆、马血浆、羊血浆、狗血浆中的一种或两种以上的混合物。

6.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述吸附剂为琼脂糖凝胶、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅胶中的一种或几种，和/或，所述吸附剂的浓度为0.5-10g/L。

7.根据权利要求1所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述基础液包括糖类、抑肽酶、防腐剂中的一种或几种，以及缓冲液。

8.根据权利要求7所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述糖类为蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖单糖、多糖中的一种或几种，和/或，所述缓冲液为三羟基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(Pipes)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(Hepes)、3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液(Mops)中的任一种。

9.根据权利要求7所述的凝血复合质控品的制备方法，其特征在于，所述糖类的浓度为10-40g/L，和/或，所述抑肽酶的浓度为5-500u/mL，和/或，所述缓冲液的浓度为10-50mmol/L，和/或，所述缓冲液的pH值为7.0-8.0。

10.一种凝血复合质控品，其特征在于，根据权利要求1至9任一项所述的凝血复合质控品的制备方法制备。