CN108048433A - 一种人凝血酶原复合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血酶原复合物的制备方法，本发明制备的人凝血酶原复合物，通过对吸附平衡液，后续的洗涤液和洗脱液，冻干工艺进行改进研究，得到较佳的生产工艺，在该条件下，PCC制品所含的4种凝血因子活性比例较好，且各个成分的收率均较高，Ⅸ比活高达3.13IU/mg，比活均高于药典标准，有效的降低了致栓性几率，减少了凝血因子的活化。

Description

一种人凝血酶原复合物的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血酶原复合物的制备方法。
背景技术
人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrates，PCC)是一种含有凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ四种维生素K依赖性凝血因子，能够促进血液凝固的血浆蛋白制剂。在临床上，PCC主要用于治疗乙型血友病和肝脏疾病以及维生素K缺乏引起的凝血因子含量低下引起的出血症状。另外，在治疗因长期输注FVIII的甲型血友病患者产生FVIII抑制剂而引起出血的症状也得到了肯定。在国外，PCC还被广泛用于治疗因过量服用由维生素K拮抗剂作为抗凝药物引起的出血症状。近年来，随着临床医生的认同，PCC的需求量逐年加大。
自PCC制品问世以来，有不少关于输注PCC后导致血栓形成并发症的报道，通常会引起心肌梗塞、弥漫性血管内凝血、动脉栓塞和深部血管凝血。PCC引起血栓的主要原因是生产过程中活化的凝血因子和其中所含的促凝活性的磷脂等杂质所致。因此，在PCC生产过程中，减少凝血因子的活化和提高PCC制品纯度是减少输注PCC后引起血栓的关键因素。
中国专利CN201410340403.0，使用预先经EDTA溶液和枸橼酸钠溶液清洗过的纤维素深层滤板过滤；深层过滤后的血浆在固定床上样时经过0.2μm的滤芯膜在线过滤；装填有阴离子交换凝胶CaptoDEAE的固定床层析柱使用缓冲液A平衡2-5个柱体积，血浆上样流速为60～120cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX计算，PCC的收率可以达到75％～90％，比活性可以达到5.5IU/mg以上。
中国专利CN201610429456.9，公开了用于提取人凝血酶原复合物的平衡液以及提取人凝血酶原复合物的方法，利用本发明的平衡液能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是凝血因子Ⅶ(FⅦ)的收率较高。
CN200710114703.7，对离子强度、稳定剂进行调整，最终得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。
CN201710118663.7，发明公开了一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法，采用DEAEA-50凝胶从血浆中直接吸附出人凝血酶原复合物，将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗涤和洗脱，洗脱液经S/D灭活，固定床层析柱二次层析纯化，使得生产过程中的凝胶损耗可降低20％以上，但其得到的凝血因子比活性较低，产品质量欠佳。
以上对于人凝血酶原复合物得制备均从单一方面进行改进，并没有对整个生产过程进行优化，且得到的人凝血酶原复合物只是单一提高了人凝血酶原复合物某一个因子的收率和比活，没有均衡的提高四个因子的收率和比活，然而人凝血酶原复合物(prothrombin complex concetrate，PCC)是从健康人混合血浆中分离制备，生产原料血浆稀少，因此需要对其生产的各个步骤进行改进，希望得到一种高效安全得制备方法。
发明内容
本发明为了解决以上技术问题，提供了一种人凝血酶原复合物的制备方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下制备步骤：
1)离心：以新鲜冷冻人血为原料，经融浆、混浆、离心，去除血浆中的冷沉淀，离心后血浆上清液澄清过滤时采用装配了0.45um滤芯的PALL滤器过滤，得血浆上清液；
2)吸附：调节血浆上清液pH，加入DEAE Sephadex A-50凝胶，1.0-3.0℃，搅拌吸附30-50min后过滤；
3)洗涤、洗脱：DEAE Sephadex A-50凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，50-60cm/h，冲洗5-6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为30-40cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
4)超滤：将步骤3)中的洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于14ms/cm时停止透析，用注射用水调整蛋白浓度7.5％±1％(g/L)，得灭活液；
5)病毒S/D灭活：在灭活液中添加蔗糖+甘氨酸混合溶液使蛋白最终浓度分别为1.5％；加入S/D灭活剂，使其最终浓度分别为吐温81±0.3％、磷酸三丁酯为0.3±0.1％，匀速搅拌，搅拌速度为10％-25％。在24℃±0.5℃下恒温6小时，降温，注射用水5倍稀释，得稀释液；
6)二次吸附：调节稀释液pH为7.10±0.10(25±0.5℃)，加入已处理好的CaptoDEAE凝胶，温度为3.0-6.0℃，搅拌吸附30-40min后过滤；
7)二次洗涤洗脱：Capto DEAE凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，50-60cm/h，冲洗5-6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为30-40cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
8)超滤，透析：将步骤7)中洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于9-11ms/cm时停止透析，浓缩至蛋白浓度2.0％-4.0％(g/L)，甘氨酸浓度4.5-5.5％；
9)配制：每1IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量应不高于0.3IU；
10)分装，冻干：原液经除菌过滤分装，半加塞入冻干机前箱，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥、压塞出柜轧盖
11)病毒干热灭活：将压塞轧盖后的产品在100℃±0.5℃下恒温30分钟，降温、真空检测后即得人凝血酶原复合物半成品。
进一步，所述的调节血浆上清液pH，按照0.18-0.22U/ml添加肝素钠，用0.8-1.2mol/L HCl调pH至7.15±0.05，其中的pH是在25±0.5℃下测量。
进一步，步骤2)所述的吸附，在室温条件下，新胶用温度为15-20℃的0.85％NaCl溶液浸泡24小时以上，溶胀，用0-4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；用40L0.5mol/L NaOH溶液搅拌5min后浸泡2小时以上，浸泡结束后，再用0-4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；添加pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液1-2L，搅拌5min后浸泡30-40min，再用0～4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量，用平衡液平衡凝胶6次，每次平衡液用量为胶体积的1.5-2倍量，平衡过程用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L NaOH溶液调整，并取样检测细菌内毒素，最终吸附体系的柠檬酸钠为0.024mol/L、氯化钠0.06mol/L、pH为6.8，DEAE SephadexA-50凝胶的浓度为1.5-1.7g/L。
进一步，所述的吸附，DEAE Sephadex A-50凝胶的加入量与血浆上清液等体积。
进一步，所述的洗涤液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.04mol/L、pH为6.9。
进一步，所述的洗脱液，其中柠檬酸钠为0.037mol/L、氯化钠1.8mol/L、pH为6.9。
进一步，所述的冻干，在-40～-45℃冷冻3.1-3.3h，-13～-18℃冷冻2.4-2.8h，抽真空，真空度为10-20Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
进一步，所述的升温干燥，温度上升速度为5-10℃/h，上升1h，升温速度为10-15℃/h，上升1h，升温速度为20-25℃/h，上升1h，温度稳定在30-35℃，保持3-4h既得。
进一步，所述的透析液，其中柠檬酸钠为0.012-0.016mol/L、氯化钠0.1-0.2mol/L、pH为6.8-7.1，甘氨酸为18-23g/L。
有益效果，本发明与现有技术相比，具有以下突出的特点：
1)本发明将吸附后的A-50凝胶装于层析柱中，采用在线清洗洗脱，减少了开放式操作污染，且制备的产品纯度较高，比活较好。
2)采用Capto DEAE凝胶与DEAE-Sephadex A-50凝胶结合进行纯化人凝血酶原复合物，通过工艺筛选得到可以适用于两种凝胶的平衡液、洗涤液和洗脱液，同时对冻干工艺进行改进研究，得到较佳的生产工艺，在该条件下，PCC制品所含的4种凝血因子活性比例较接近于1:1:1:1，且各个成分的收率均较高，Ⅸ比活高达3.13IU/mg，比活均高于药典标准，因为四种因子含量的不的平衡4种凝血因子增加了致栓性几率，本发明的生产方法有效的降低了致栓性几率，减少了凝血因子的活化。
3)进一步对抗凝蛋白C进行测量，发现蛋白C的含量相对较高，为50.23％，有效的抑制了凝血因子的活化。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下制备步骤：
1)离心：以新鲜冷冻人血为原料，经融浆、混浆、离心，去除血浆中的冷沉淀，离心后血浆上清液澄清过滤时采用装配了0.45um滤芯的PALL滤器过滤，得血浆上清液；
2)吸附：调节血浆上清液pH，加入DEAE Sephadex A-50凝胶，1.0℃，搅拌吸附30min后过滤；
3)洗涤、洗脱：DEAE Sephadex A-50凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，50cm/h，冲洗5个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为30cm/hn，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
4)超滤：将步骤3)中的洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于14ms/cm时停止透析，用注射用水调整蛋白浓度7.5％(g/L)，得灭活液；
5)病毒S/D灭活：在灭活液中添加蔗糖+甘氨酸混合溶液使蛋白最终浓度分别为1.5％；加入S/D灭活剂，使其最终浓度分别为吐温81％、磷酸三丁酯为0.3％，匀速搅拌，搅拌速度为10％％，在24℃℃下恒温6小时，降温，注射用水5倍稀释，得稀释液；
6)二次吸附：调节稀释液pH为7.10(25℃)，加入已处理好的Capto DEAE凝胶，温度为3.0℃，搅拌吸附30min后过滤；
7)二次洗涤洗脱：Capto DEAE凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，50cm/h，冲洗5个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为30cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
8)超滤，透析：将步骤7)中洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于9-11ms/cm时停止透析，浓缩至蛋白浓度2.0％(g/L)，甘氨酸浓度4.5％；
9)配制：每1IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量应不高于0.3IU；
10)分装，冻干：原液经除菌过滤分装，半加塞入冻干机前箱，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥、压塞出柜轧盖
11)病毒干热灭活：将压塞轧盖后的产品在100℃下恒温30分钟，降温、真空检测后即得人凝血酶原复合物半成品。
所述的调节血浆上清液pH，按照0.18U/ml添加肝素钠，用0.8mol/L HCl调pH至7.15，其中的pH是在25℃下测量。
步骤2)所述的吸附，在室温条件下，新胶用温度为15℃的0.85％NaCl溶液浸泡24小时以上，溶胀，用0℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；用40L 0.5mol/L NaOH溶液搅拌5min后浸泡2小时以上，浸泡结束后，再用0-4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；添加pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液1L，搅拌5min后浸泡30min，再用0℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量，用平衡液平衡凝胶6次，每次平衡液用量为胶体积的1.5倍量，平衡过程用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L NaOH溶液调整，并取样检测细菌内毒素，最终吸附体系的柠檬酸钠为0.024mol/L、氯化钠0.06mol/L、pH为6.8，DEAE Sephadex A-50凝胶的浓度为1.5g/L。
所述的吸附，DEAE Sephadex A-50凝胶的加入量与血浆上清液等体积。
所述的洗涤液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.04mol/L、pH为6.9。
所述的洗脱液，其中柠檬酸钠为0.037mol/L、氯化钠1.8mol/L、pH为6.9。
所述的冻干，在-40℃冷冻3.1h，-13℃冷冻2.4h，抽真空，真空度为10Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
所述的升温干燥，温度上升速度为5℃/h，上升1h，升温速度为10℃/h，上升1h，升温速度为20℃/h，上升1h，温度稳定在30℃，保持3h既得。
所述的透析液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.1mol/L、pH为6.8，甘氨酸为18g/L。
实施例2-7进行吸附的条件如表1所示。
表1实施例2-8吸附条件
实施例2-8其它制备步骤与实施例1相同。
实施例9-15洗涤条件如表2所示。
表2实施例9-15洗涤条件
柠檬酸钠为mol/L 氯化钠mol/L pH
实施例9 0.012 0.04 6.6
实施例10 0.012 0.04 7.2
实施例11 0.012 0.02 6.9
实施例12 0.012 0.06 6.9
实施例13 0.005 0.04 6.9
实施例14 0.02 0.04 6.9
实施例15 0.025 0.1 7.0
实施例9-15其它制备步骤与实施例1相同。
实施例16-22洗脱条件如表3所示。
表3实施例16-22洗脱条件
实施例16-22其它制备步骤与实施例1相同。
实施例23
实施例23在冻干步骤，所述的冻干，在-40℃冷冻3.1h，抽真空，真空度为10Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
所述的升温干燥，温度上升速度为10℃/h，温度稳定在30℃，保持3h既得。
实施例24
一种人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下制备步骤：
1)离心：以新鲜冷冻人血为原料，经融浆、混浆、离心，去除血浆中的冷沉淀，离心后血浆上清液澄清过滤时采用装配了0.45um滤芯的PALL滤器过滤，得血浆上清液；
2)吸附：调节血浆上清液pH，加入DEAE Sephadex A-50凝胶，1.0-3.0℃，搅拌吸附30-50min后过滤；
3)洗涤、洗脱：DEAE Sephadex A-50凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，55cm/h，冲洗5.6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为34cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
4)超滤：将步骤3)中的洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于14ms/cm时停止透析，用注射用水调整蛋白浓度7.4％(g/L)，得灭活液；
5)病毒S/D灭活：在灭活液中添加蔗糖+甘氨酸混合溶液使蛋白最终浓度分别为1.5％；加入S/D灭活剂，使其最终浓度分别为吐温80.73％、磷酸三丁酯为0.2％，匀速搅拌，搅拌速度为20％。在23.5℃下恒温6小时，降温，注射用水5倍稀释，得稀释液；
6)二次吸附：调节稀释液pH为7.09(25℃)，加入已处理好的Capto DEAE凝胶，温度为4.0℃，搅拌吸附35min后过滤；
7)二次洗涤洗脱：Capto DEAE凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，55cm/h，冲洗5.6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为35cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
8)超滤，透析：将步骤7)中洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于9-11ms/cm时停止透析，浓缩至蛋白浓度3.0％(g/L)，甘氨酸浓度5.0％；
9)配制：每1IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量应不高于0.3IU；
10)分装，冻干：原液经除菌过滤分装，半加塞入冻干机前箱，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥、压塞出柜轧盖
11)病毒干热灭活：将压塞轧盖后的产品在99.5℃下恒温30分钟，降温、真空检测后即得人凝血酶原复合物半成品。
所述的调节血浆上清液pH，按照0.20U/ml添加肝素钠，用0.8-1.2mol/L HCl调pH至7.10，其中的pH是在24.5℃下测量。
步骤2)所述的吸附，在室温条件下，新胶用温度为17℃的0.85％NaCl溶液浸泡24小时以上，溶胀，用3℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；用40L 0.5mol/L NaOH溶液搅拌5min后浸泡2小时以上，浸泡结束后，再用3℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；添加pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液1.2L，搅拌5min后浸泡35min，再用34℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量，用平衡液平衡凝胶6次，每次平衡液用量为胶体积的1.7倍量，平衡过程用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L NaOH溶液调整，并取样检测细菌内毒素，最终吸附体系的柠檬酸钠为0.024mol/L、氯化钠0.06mol/L、pH为6.8，DEAE Sephadex A-50凝胶的浓度为1.6g/L。
所述的吸附，DEAE Sephadex A-50凝胶的加入量与血浆上清液等体积。
所述的洗涤液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.04mol/L、pH为6.9。
所述的洗脱液，其中柠檬酸钠为0.037mol/L、氯化钠1.8mol/L、pH为6.9。
所述的冻干，在-43℃冷冻3.2h，-16℃冷冻2.6h，抽真空，真空度为15Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
所述的升温干燥，温度上升速度为6℃/h，上升1h，升温速度为12℃/h，上升1h，升温速度为23℃/h，上升1h，温度稳定在33℃，保持3.4h既得。
所述的透析液，其中柠檬酸钠为0.014mol/L、氯化钠0.14mol/L、pH为6.9，甘氨酸为20g/L。
实施例25
一种人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下制备步骤：
1)离心：以新鲜冷冻人血为原料，经融浆、混浆、离心，去除血浆中的冷沉淀，离心后血浆上清液澄清过滤时采用装配了0.45um滤芯的PALL滤器过滤，得血浆上清液；
2)吸附：调节血浆上清液pH，加入DEAE Sephadex A-50凝胶，3.0℃，搅拌吸附50min后过滤；
3)洗涤、洗脱：DEAE Sephadex A-50凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，60cm/h，冲洗6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为40cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
4)超滤：将步骤3)中的洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于14ms/cm时停止透析，用注射用水调整蛋白浓度7.6％(g/L)，得灭活液；
5)病毒S/D灭活：在灭活液中添加蔗糖+甘氨酸混合溶液使蛋白最终浓度分别为1.5％；加入S/D灭活剂，使其最终浓度分别为吐温81.3％、磷酸三丁酯为0.4％，匀速搅拌，搅拌速度为25％。在24.5℃下恒温6小时，降温，注射用水5倍稀释，得稀释液；
6)二次吸附：调节稀释液pH为7.11，加入已处理好的Capto DEAE凝胶，温度为6.0℃，搅拌吸附40min后过滤；
7)二次洗涤洗脱：Capto DEAE凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，60cm/h，冲洗6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为40cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
8)超滤，透析：将步骤7)中洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于9-11ms/cm时停止透析，浓缩至蛋白浓度4.0％(g/L)，甘氨酸浓度5.5％；
9)配制：每1IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量应不高于0.3IU；
10)分装，冻干：原液经除菌过滤分装，半加塞入冻干机前箱，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥、压塞出柜轧盖
11)病毒干热灭活：将压塞轧盖后的产品在100℃下恒温30分钟，降温、真空检测后即得人凝血酶原复合物半成品。
所述的调节血浆上清液pH，按照0.22U/ml添加肝素钠，用1.2mol/L HCl调pH至7.20，其中的pH是在25.5℃下测量。
步骤2)所述的吸附，在室温条件下，新胶用温度为20℃的0.85％NaCl溶液浸泡24小时以上，溶胀，用4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；用40L 0.5mol/L NaOH溶液搅拌5min后浸泡2小时以上，浸泡结束后，再用4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量；添加pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液2L，搅拌5min后浸泡40min，再用4℃的注射用水冲洗凝胶6次，每次注射用水用量为胶体积的约1倍量，用平衡液平衡凝胶6次，每次平衡液用量为胶体积的2倍量，平衡过程用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L NaOH溶液调整，并取样检测细菌内毒素，最终吸附体系的柠檬酸钠为0.024mol/L、氯化钠0.06mol/L、pH为6.8，DEAE Sephadex A-50凝胶的浓度为1.7g/L。
所述的吸附，DEAE Sephadex A-50凝胶的加入量与血浆上清液等体积。
所述的洗涤液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.04mol/L、pH为6.9。
所述的洗脱液，其中柠檬酸钠为0.037mol/L、氯化钠1.8mol/L、pH为6.9。
所述的冻干，在-45℃冷冻3.3h，-18℃冷冻2.8h，抽真空，真空度为20Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
所述的升温干燥，温度上升速度为10℃/h，上升1h，升温速度为15℃/h，上升1h，升温速度为25℃/h，上升1h，温度稳定在35℃，保持4h既得。
所述的透析液，其中柠檬酸钠为0.016mol/L、氯化钠0.2mol/L、pH为7.1，甘氨酸为23g/L。
实施例26
实施例6与实施例1的却别在于，二次吸附时采用，DEAE Sephadex A-50凝胶，其它制备步骤均相同。
实验例
1、吸附条件影响检测
按照实施例1-8的方法进行试验，编号1-8，同时按照申请号CN201410340403.0《一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法》作为对照组，参考文献报道的方法(周敏,曾仁勇,刘园园,等.新型凝胶纯化凝血酶原复合物的工艺探讨[J].中国生化药物杂志,2016,36(11):192-196.)进行测定4中成分的收率，每个实验组重复3次，求平均值，结果如表4所示。
表4不同吸附条件下4中凝血因子收率(％)
Ⅱ Ⅶ Ⅸ Ⅹ 蛋白C
实施例1 86.85 78.24 85.48 87.27 50.23
实施例2 70.76 60.70 75.36 80.78 48.76
实施例3 69.35 65.25 59.78 75.71 45.51
实施例4 63.81 58.23 68.29 80.60 38.19
实施例5 70.24 60.18 70.10 76.87 42.32
实施例6 60.25 50.65 65.15 75.26 40.68
实施例7 54.78 64.28 58.27 70.78 39.20
实施例8 75.63 67.19 60.76 65.27 45.37
对照组 83.70 76.72 86.56 76.39 44.51
实施例24 85.12 78.20 83.76 85.23 51.05
实施例25 86.14 78.30 84.23 85.18 50.53
实施例26 76.85 70.26 78.73 75.26 48.63
表5不同凝血因子比活(IU/mg)
2、洗涤条件对凝血酶原复合物影响
表6不同洗涤条件下4中凝血因子收率(％)
表7不同洗涤凝血因子比活(IU/mg)
Ⅱ Ⅶ Ⅸ Ⅹ 蛋白C
实施例1 3.56 0.84 3.13 3.16 0.84
实施例9 3.07 0.65 2.76 3.00 0.57
实施例10 3.00 0.60 2.64 2.69 0.60
实施例11 2.35 0.61 2.75 2.52 0.52
实施例12 2.53 0.54 2.42 2.40 0.54
实施例13 2.51 0.57 2.36 2.37 0.63
实施例14 2.47 0.58 2.04 2.33 0.61
实施例15 2.59 0.50 2.10 2.25 0.57
对照组 0.85 0.60 5.15 1.67 0.76
3、洗脱条件对凝血酶原复合物的影响
表8不同洗脱条件下4中凝血因子收率(％)
表9不同洗脱条件下凝血因子比活(IU/mg)
Ⅱ Ⅶ Ⅸ Ⅹ 蛋白C
实施例1 3.56 0.84 3.13 3.16 0.84
实施例16 3.17 0.55 2.56 3.08 0.67
实施例17 3.10 0.70 2.34 2.59 0.60
实施例18 2.75 0.68 2.85 2.43 0.62
实施例19 3.13 0.64 2.62 2.31 0.64
实施例20 2.40 0.62 2.56 2.24 0.71
实施例21 2.27 0.56 2.34 2.40 0.60
实施例22 3.19 0.57 2.40 2.21 0.63
对照组 0.85 0.60 5.15 1.67 0.76
4、冻干工艺测试
对实施例1和实施例23的产品进行测评，结果如表10所示。
外观 复溶是间 可见异物 水分％
实施例1 成型较好 9分10秒 符合要求 0.6
实施例23 略有萎缩 13分05秒 符合要求 0.9
通过以上分析，本发明制备的人凝血酶原复合物，具有以下区别于现有技术的优点：
1)本发明将吸附后的A-50凝胶装于层析柱中，采用在线清洗洗脱，减少了开放式操作污染，且制备的产品纯度较高，比活较好。
2)采用Capto DEAE凝胶与DEAE-Sephadex A-50凝胶结合进行纯化人凝血酶原复合物，通过工艺筛选得到可以适用于两种凝胶的洗涤液和洗脱液，同时对冻干工艺进行改进研究，得到较佳的生产工艺(既实施例1、实施例24、实施例25)，在该条件下，PCC制品所含的4种凝血因子活性比例较接近于1:1:1:1，且各个成分的收率均较高，Ⅸ比活高达3.13IU/mg，比活均高于药典标准，因为四种因子含量的不的平衡4种凝血因子增加了致栓性几率，本发明的生产方法有效的降低了致栓性几率，减少了凝血因子的活化。
3)进一步对抗凝蛋白C进行测量，发现蛋白C的含量相对较高，为50.23％，有效的抑制了凝血因子的活化。

Claims (9)

1.一种人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
1)离心：以新鲜冷冻人血为原料，经融浆、混浆、离心，去除血浆中的冷沉淀，得血浆上清液；
2)吸附：调节血浆上清液pH，加入DEAE Sephadex A-50凝胶，温为1.0-3.0℃，搅拌吸附30-50min，过滤；
3)洗涤、洗脱：DEAE Sephadex A-50凝胶装于层析柱内，用洗涤液在线洗涤杂蛋白，50-60cm/h，冲洗5-6个柱体积，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子及少量蛋白，洗脱速度为30-40cm/h，在线检测器检测值低于500Au时停止洗脱，收集洗脱液；
4)超滤：将步骤3)中的洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于14ms/cm时停止透析，用透析液调整蛋白浓度7.5％±1％得灭活液；
5)病毒S/D灭活：在灭活液中添加入蔗糖+甘氨酸混合溶液使其最终浓度分别为1.5％；加入S/D灭活剂，使其最终浓度分别为吐温81±0.3％、磷酸三丁酯为0.3±0.1％，匀速搅拌，搅拌速度为10％-25％；在24℃±0.5℃下恒温6小时，降温，注射用水5倍稀释，得稀释液；
6)二次吸附：调节稀释液pH为7.10±0.10，加入已处理好的Capto DEAE凝胶，温度控制在3.0-6.0℃，搅拌吸附30-40min后过滤；
7)二次洗涤洗脱：用洗涤液洗涤掉杂蛋白并废弃，用洗脱液洗脱凝胶中吸附Ⅱ Ⅶ ⅨⅩ因子及少量蛋白，收集洗脱液；
8)超滤，透析：将步骤7)中洗脱液进行超滤并透析，至电导率低于9-11ms/cm时停止透析，浓缩至蛋白浓度2.0％-4.0％，甘氨酸浓度4.5-5.5％；
9)配制：每1IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量应不高于0.3IU；
10)分装，冻干：原液经除菌过滤分装，半加塞入冻干机前箱，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥、压塞出柜轧盖；
11)病毒干热灭活：将压塞轧盖后的产品在100℃±0.5℃下恒温30分钟，降温、真空检测后即得人凝血酶原复合物半成品。
2.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的调节血浆上清液pH，按照0.18-0.22U/ml添加肝素钠，用0.8-1.2mol/L HCl调pH至7.15±0.05，其中的pH是在25±0.5℃下测量。
3.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的吸附，将DEAE Sephadex A-50凝胶于吸附体系中，最终吸附体系的柠檬酸钠为0.024mol/L、氯化钠0.06mol/L、pH为6.8，中DEAE Sephadex A-50凝胶的浓度为1.5-1.7g/L。
4.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的吸附，DEAESephadex A-50凝胶的加入量与血浆上清液等体积。
5.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的洗涤液，其中柠檬酸钠为0.012mol/L、氯化钠0.04mol/L、pH为6.9。
6.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的洗脱液，其中柠檬酸钠为0.037mol/L、氯化钠1.8mol/L、pH为6.9。
7.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的冻干，在-40～-45℃冷冻3.1-3.3h，-13～-18℃冷冻2.4-2.8h，抽真空，真空度为10-20Pa，加热，0℃升华，升温干燥。
8.如权利要求7所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于，所述的升温干燥，温度上升速度为5-10℃/h，上升1h，升温速度为10-15℃/h，上升1h，升温速度为20-25℃/h，上升1h，温度稳定在30-35℃，保持3-4h既得。
9.如权利要求1所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于所述的透析液，其中柠檬酸钠为0.012-0.016mol/L、氯化钠0.1-0.2mol/L、pH为6.8-7.1，甘氨酸为18-23g/L。
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