CN109593747B - 一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法，步骤为：（1）血浆吸附，使用已平衡的凝胶搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆；（2）凝胶洗涤，洗涤凝胶，去除非人凝血酶原复合物中蛋白成分；（3）凝胶洗脱，收集洗脱液，将步骤（2）洗涤结束的凝胶使用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；（4）洗脱液的超滤；（5）中间产品的保存，将浓缩液在中间产品非冻结状态下进行密封、保存；（6）检测。在本发明条件下保存人凝血酶原复合物中间产品，使中间产品能较好的保持活性；有利于生产过程的控制，降低制品在固液不同状态转换下不稳定和污染的风险；不需冻存和复融过程，有利于提高生产效率。

Description

一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法
技术领域
本发明属于生物制药血液制品生产领域，具体涉及人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法。
背景技术
人凝血因子Ⅸ（Factor IX，FIX）是一种由肝脏合成的维生素K依赖性血浆蛋白，分子量约57KD，血浆含量1～7mg/L，是内源性凝血途径中的重要因子。FIX与其他维生素K依赖的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ理化性质相似，与以上三种因子共同组成人凝血酶原复合物（Prothrombin Complex Concetrate，PCC）。
目前，PCC的主要生产工艺为两步凝胶吸附：以去除冷沉淀的血浆或Cohn组分Ⅲ为原料，经DEAE Sephadex A-50吸附后，收集洗脱液；再次经使用DEAE Sephadex A-50或其他凝胶，例如，DEAE Sephrose Fast Flow等，吸附，收集洗脱液，并经病毒灭活、冷冻干燥等步骤处理，获得最终产品。PCC的生产工艺较复杂，生产周期相对较长，经常会在第一次凝胶吸附后将中间产品进行冷冻保存，进行下一步操作时再将冻存的制品进行复融。但是由于凝血因子极易被激活、不稳定的特性，中间产品组分冻存后再次复融会引起凝血因子活性丧失，同时保存期间存在中间品微生物污染的风险，也给操作带来不便。
发明内容
本发明提供了一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法，目的是解决以人凝血因子Ⅸ（FIX）为主要成分的血液制品中间产品的制备及保存的问题，能使上述中间产品在液态状态下保持FIX活性的稳定。
本发明的技术方案为，将以FIX为主要成分的中间产品的缓冲液调整至氯化钠浓度≥0.3mol/L，在保存容器内密封，液态保存，温度范围可以根据氯化钠浓度的不同进行调整，以不冻结为准。
一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法，具体步骤为：
（1）血浆吸附
使用已平衡的DEAE Sephadex A-50（二乙基氨基乙基-葡聚糖 A-50）凝胶搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆；
（2）凝胶洗涤
使用洗涤液洗涤上一步收集的凝胶，去除非人凝血酶原复合物（PCC）蛋白成分，洗涤液排空，不收集；
（3）凝胶洗脱，收集洗脱液
将步骤（2）洗涤结束的凝胶使用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液于已清洁的超滤罐中；
（4）洗脱液的超滤
将步骤（3）获得的洗脱液浓缩至适合保存的体积，获得浓缩液；当中间产品的缓冲液中氯化钠浓度≥0.3mol/L时，不超滤。
（5）中间产品的保存
将浓缩液在中间产品非冻结状态下进行密封、保存；
（6）检测：FIX活性检测，根据《中国药典》2015年版三部人凝血因子Ⅸ效价测定法检测Ⅸ活性。
进一步的，所述步骤（1）中，平衡DEAE Sephadex A-50凝胶的平衡液中氯化钠的浓度为0.06-0.20mol/L，枸橼酸钠的浓度为0.01-0.03mol/L；搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆时搅拌速度为10-50r/min，优选为15-30r/min；吸附条件为：pH 7.2±0.3，时间30-60min，优选的pH为7.2±0.1；凝胶与血浆比例为每1kg血浆使用1-1.8g凝胶（干胶），优选的，凝胶用量为每1kg血浆使用1-1.5g凝胶（干胶）。
所述步骤（2）中，洗涤液中氯化钠浓度为0.15-0.25mol/L，枸橼酸钠浓度为0.01-0.02mol/L，优选0.16-0.18mol/L；洗涤次数为1-3次，优选为2次。
所述步骤（3）中，洗脱液中氯化钠的浓度≥0.5mol/L，枸橼酸钠的浓度为0.02-0.03mol/L；洗脱次数为2-4次，优选为3次。
所述步骤（4）中：超滤使用的缓冲液中，氯化钠浓度≥0.05mol/L，优选氯化钠的浓度≥0.3mol/L；超滤过程温度≤25℃，优选为2-15℃。
步骤（5）中：保存的温度为0-15℃；浓缩液中氯化钠的浓度≥0.3mol/L，保存时所用容器为不锈钢容器或塑料容器内；保存时采用带温控的设备，或可以控温的房间、冰箱。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
在本发明所述条件下保存人凝血酶原复合物中间产品，使中间产品处于液体状态下，能较好的保持其活性；有利于生产过程的控制，降低中间产品在固液不同状态转换下不稳定和污染的风险；操作便利，无需复杂设备，不需冻存和复融过程，有利于提高生产效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实例1：一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法
1. 试验方法：
1)人去冷沉淀血浆的制备，将-20℃以下冻存的血浆约1000kg，用75%乙醇消毒后破袋，投浆融化温度≤4.0℃，融化后血浆离心去除冷沉淀，离心温度≤4.0℃。
2)凝胶处理：将1.3kgDEAE Sephadex A-50凝胶干粉使用缓冲液（0.075mol/L氯化钠溶液）溶胀，溶胀后使用平衡液（0.08mol/L 氯化钠，0.015mol/L枸橼酸钠，pH7.2±0.1）平衡4次，溶液用量约40kg。
3)血浆吸附：将步骤1）中的离心去除冷沉淀后的血浆转移至已平衡的凝胶中进行吸附，吸附温度≤8℃，搅拌转速25rpm，吸附时间45min，吸附结束，将吸附后的血浆转移至下一工序，凝胶保留在不锈钢罐内。
4)洗涤，使用洗涤液（0.18mol/L 氯化钠，0.015mol/L枸橼酸钠pH7.2±0.1）约40kg进行洗涤，洗涤时搅拌转速为15rpm，搅拌10min，共洗涤2次，洗涤后溶液排放。
5)洗脱：使用洗脱液（1mol/L 氯化钠，0.025mol/L枸橼酸钠pH7.2±0.1）约40kg进行洗脱，洗脱时搅拌转速为15rpm，搅拌10min，共洗脱3次，洗脱后溶液收集混匀后分配至两个不锈钢超滤罐中。
6)超滤：将两个超滤罐内的洗脱液进行超滤，超滤用膜包均为10KD，10㎡，并加入透析液（氯化钠浓度分别为1.5mol/L和0.08mol/L）进行溶液置换，在超滤过程中控制温度≤8℃，对超滤结束后的样品（样品所含氯化钠浓度约为1.5mol/L和0.08mol/L）进行取样，每个浓度分别取样约10ml，各两管，分别存放于2-8℃冰箱和-30℃冰箱中。
2.检测：FIX活性检测，将第6）步中样品保存24小时后，根据《中国药典》2015年版三部人凝血因子Ⅸ效价测定法检测Ⅸ活性，结果为氯化钠浓度为1.5mol/L时，2-8℃样品活性为35IU/ml，-30℃样品活性为36IU/ml，氯化钠浓度为0.08mol/L时，2-8℃样品活性为25IU/ml，-30℃样品活性为34IU/ml，结果表明，氯化钠浓度为1.5mol/L时，2-8℃保存的样品活性与-30℃样品基本一致，而氯化钠浓度为0.08mol/L时，样品FIX活性损失约26%。
实例2：一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法
1.试验方法：
1)人去冷沉淀血浆的制备，将-20℃以下冻存的血浆约1000kg，用75%乙醇消毒后破袋，投浆融化温度≤4.0℃，融化后血浆离心去除冷沉淀，离心温度≤4.0℃。
2)凝胶处理：将1.4kgDEAE Sephadex A-50凝胶干粉使用缓冲液（0.075mol/L氯化钠溶液）溶胀，溶胀后使用平衡液（0.08mol/L 氯化钠，0.015mol/L枸橼酸钠，pH7.0±0.1）平衡4次，溶液用量约40kg。
3)血浆吸附：将步骤1）中的离心去除冷沉淀后的血浆转移至已平衡的凝胶中进行吸附，吸附温度≤8℃，搅拌转速15rpm，吸附时间45min，吸附结束，将吸附后的血浆转移至下一工序，凝胶保留在不锈钢罐内。
4)洗涤，使用洗涤液（0.18mol/L 氯化钠，0.015mol/L枸橼酸钠pH7.0±0.1）约40kg进行洗涤，洗涤时搅拌转速为15rpm，搅拌10min，共洗涤两次，洗涤后溶液排放。
5)洗脱：使用洗脱液（1mol/L 氯化钠，0.025mol/L枸橼酸钠pH7.0±0.1）约40kg进行洗脱，洗脱时搅拌转速为15rpm，搅拌10min，共洗脱三次，洗脱后溶液混匀后分配收集至两个不锈钢超滤罐中。
6)超滤：将两个超滤罐内的洗脱液进行超滤，超滤用膜包为10KD，10㎡，并加入透析液（氯化钠浓度分别为0.6mol/L和0.08mol/L）进行溶液置换，在超滤过程中控制温度10~15℃。对超滤结束后的样品（样品所含氯化钠浓度约为0.6mol/L和0.08mol/L）进行取样，每个浓度分别取样约10ml，各两管，分别存放于10~15℃环境和-30℃冰箱中。
2. 检测：FIX活性检测，将第6）步中样品保存24小时后，根据《中国药典》2015年版三部人凝血因子Ⅸ效价测定法检测Ⅸ活性，结果为氯化钠浓度为0.6mol/L时，10-15℃样品活性为36IU/ml，-30℃样品活性为37IU/ml，氯化钠浓度为0.08mol/L时，10-15℃样品活性为28IU/ml，-30℃样品活性为35IU/ml，结果表明，氯化钠浓度为0.6mol/L时，10-15℃保存的样品活性与-30℃样品基本一致，而氯化钠浓度为0.08mol/L时，10-15℃保存样品Ⅸ活性损失约20%。

Claims (16)

1.一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）血浆吸附
使用已平衡的DEAE Sephadex A-50凝胶搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆；
（2）凝胶洗涤
使用洗涤液洗涤上一步收集的凝胶，去除非人凝血酶原复合物（PCC）蛋白成分，洗涤液排空，不收集；
（3）凝胶洗脱，收集洗脱液
将步骤（2）洗涤结束的凝胶使用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液于已清洁的超滤罐中；
（4）洗脱液的超滤
将步骤（3）获得的洗脱液浓缩，获得浓缩液；当中间产品的缓冲液中氯化钠浓度≥0.3mol/L时，不超滤；
（5）中间产品的保存
将浓缩液在中间产品非冻结状态下进行密封、保存；
（6）检测：FIX活性检测，根据《中国药典》2015年版三部人凝血因子Ⅸ效价测定法检测Ⅸ活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，平衡DEAE Sephadex A-50凝胶的平衡液中氯化钠的浓度为0.06-0.20mol/L，枸橼酸钠的浓度为0.01-0.03mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆时搅拌速度为10-50r/min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，搅拌吸附已去除冷沉淀的血浆时搅拌速度为15-30r/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，吸附条件为：pH 7.2±0.3，时间30-60min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，pH为7.2±0.1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，凝胶与血浆比例为每1kg血浆使用1-1.8g凝胶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，凝胶用量为每1kg血浆使用1-1.5g凝胶。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，洗涤液中氯化钠浓度为0.15-0.25mol/L，枸橼酸钠浓度为0.01-0.02mol/L；洗涤次数为1-3次。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，洗涤液中氯化钠浓度为0.16-0.18mol/L。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，洗涤次数为2次。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，洗脱液中氯化钠的浓度≥0.5mol/L，枸橼酸钠的浓度为0.02-0.03mol/L；洗脱次数为2-4次。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，洗脱次数为3次。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中：超滤使用的缓冲液中氯化钠的浓度≥0.3mol/L；超滤过程温度≤25℃。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中：超滤过程温度为2-15℃。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中：保存的温度为0-15℃。
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