CN111494615A - 用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，包括了以下主要步骤：细胞扩增；生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增；细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器；重组腺病毒感染和扩增；重组腺病毒培养液收获，滤清和浓缩；核酸酶处理；全自动离子交换柱层析分离纯化；产品配制，灌装和冻干。本发明的方法具有很好的放大性和经济性，并可以满足医药监控组织对GMP生产的各项技术要求，充分保证了产品的质量和生物活性。

Description

用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法
技术领域
本发明属于生物制药工艺领域，涉及用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，符合GMP的重组腺病毒载体基因疫苗产品大规模的生产方法。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)的突发给社会公共健康带来了巨大的危机，感染传染性非常强，给人类造成了巨大的社会健康和经济影响，受到人们的高度重视。目前还没有有效的治疗方法和预防疫苗。为了人民大众的健康，国家和社会的安全，急需开发可以预防新型冠状病毒感染的疫苗产品。
常用的病毒疫苗研发方法包括1)灭活病毒疫苗，2)减活病毒疫苗，3)亚单位疫苗，4)VLP(virus like particle)疫苗，5)RNA疫苗，和6)重组病毒载体疫苗。采用高科技重组病毒载体基因疫苗是疫苗研发的最新技术，疫苗安全有效，研发时间短。美国FDA在最近，2019年12月19日，批准上市的用于预防埃博拉(Ebola)病毒感染的疫苗产品(美国Merck公司，Ervebo)，就是一款重组病毒载体基因疫苗(rVSV-ZEBOV)产品。其中采用重组腺病毒载体的疫苗在治疗预防和新型冠状病毒类似的MERS冠状病毒感染已取得了良好的临床效果。为采用重组腺病毒载体研发新型冠状病毒疫苗提供了科学依据。
经过几十年的研究和发展，基于重组腺病毒载体的基因治疗产品领域已有了长足的发展。传统的实验室基因治疗产品的制备方法已不能满足基因治疗产品GMP大规模产业化的要求。凭借多年的研发经验和投入，中国深圳赛百诺基因技术公司开发了一套全新的GMP大规模生产重组腺病毒基因治疗产品的方法和过程，并实现了产品突破。成功实现了今又生重组腺病毒p53产品的产业化,已于2004获得政府医药监管机构的批准上市。在今又生重组腺病毒p53产品的生产方法和过程的基础上，中国深圳赛诺生基因技术公司开发了一套全新的重组腺病毒载体基因疫苗产品的生产方法和过程，用于GMP大规模生产疫苗产品，可以广泛用于预防新型冠状病毒的感染和传染。
发明内容
本发明的目的是开发一种全新的大规模生产的方法和过程，用于生产预防新型冠状病毒重组腺病毒载体基因疫苗产品。
本发明实现上述目的是通过如下的技术方案来实现的，即采用一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法来实现的，该方法包括如下步骤：
(1)细胞扩增
取1x107到1x108个无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞，融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度为3x104到1x105/毫升。在37℃,5％二氧化碳孵箱内培养。所述细胞培养用转瓶的摇转速度在50–150rpm；培养细胞密度到约2x106/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x105/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养；重复上述细胞扩增的操作，直到用于接种的细胞量达到2x109以上。
所述重组腺病毒的生产细胞是具有无血清悬浮培养特性的SBN-293SFS克隆细胞，该细胞的生产方法为：从美国的Invitrogen公司购买293F细胞(#11625-019)，用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养和扩增293F细胞，当取得了一定量的细胞后，将细胞冷冻，细胞冷冻液采用CD293+10％DMSO，细胞浓度1-5x107/毫升。用可编程细胞冷冻箱来冷冻细胞，然后存放在液氮罐的上汽层备用。为了保证细胞的纯度和稳定性，采用终点稀释方法对细胞进行克隆筛选，所得到的细胞克隆取名为SBN-293SFS细胞。
(2)生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增
将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养。培养液的pH和溶氧(DO)值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。其中，pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15％-75％之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间。摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。
当细胞在生物反应器内生长到浓度至2.0-3.0x106/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品。在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内，细胞被保留在反应器内。生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升；。
(3)细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器
继续在灌注生物反应器内培养细胞。当细胞浓度达到1.0x107/毫升时，将细胞从当前的生物反应器转送到十倍体积的用于重组腺病毒感染的下一个生物反应器。该生物反应器预先已加有了9倍的新鲜培养液，此处对细胞进行十倍新鲜培养液稀释的目的是为了保证细胞在下一步重组腺病毒的感染和扩增过程中的活性和提供充分的营养。稀释后细胞浓度约1.0x106/毫升，重组腺病毒感染的最佳细胞浓度。在转送到大体积的生物反应器后，首先让稀释后的细胞在生物反应器内隔夜培养，以保证细胞在重组腺病毒感染时处于最佳的活性状态。培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15％-75％之间。培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36–37℃之间。生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间，如果采用搅拌式生物反应器，则搅拌速度控制在50-100rpm之间。
(4)重组腺病毒感染和扩增
取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞；病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间。病毒感染后，细胞培养参数维持不变。病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液；培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内；从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液。可选的，在收获前向反应器内加入1％(终浓度)的Tween-20，搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。
(5)重组腺病毒载体培养液滤清和浓缩，首先将收获的重组腺病毒培养液用0.65m的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质；再将滤清的收集液用另外一个300KDMWCO的切向流超滤系统浓缩约10–50倍；对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转化到另外一个缓冲液内，渗滤系数在3-10之间；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-20psi之间。
为了提高核酸酶处理的效率，可以在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。本采用的核酸酶为BenzonaseTM，将BenzonaseTM加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子；剂量在10-20u/毫升之间；降解处理在37℃的水浴中进行1个小时。
(6)全自动离子交换柱层析分离纯化
在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化BenzonaseTM处理过的重组腺病毒收集液，纯化过程采用Unicorn软件控制的全自动的纯化系统；将阴离子交换树脂(eg.Sepharose Q XL或Source Q)装柱于BPG300的柱子内，装柱体积约6升；在使用柱子前，先对柱子进行HETP(Height Equivalent to Theoretical Plate)检测，以保障柱子的性能是合格的；在上柱前，首先用1.0N的NaOH溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的柱子进行消毒处理；处理后的柱子首先用A缓冲液(20mM Tris,pH8.0)平衡；柱子平衡后，开始将重组腺病毒收集液上柱；上柱后，用5-8倍柱体积的A缓冲液清洗柱子直到UV吸收值降到底线为止；紧接着用30倍柱体积的A缓冲液到B缓冲液(20mM Tris,pH8.0,2M NaCl)的线性NaCl梯度来洗脱吸附在柱子上的重组腺病毒；在洗脱过程中Unicorn软件通过对280nm的UV吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现；当280nm的UV吸收值升到0.1AU时纯化的重组腺病毒峰会自动的接收到一个消毒无菌的瓶子内；当280nm的UV吸收值降到0.2AU时，停止接收；之后，依次用碱液，缓冲液，和酸液，缓冲液洗涤柱子和纯化系统；最后将柱子和纯化系统存放于0.01N NaOH的存储液内。
(7)配制成重组腺病毒载体基因疫苗
首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统(eg.Millipore Pellicon系统)进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标(eg.1x1012vp/毫升)；然后用重组腺病毒产品的配液(eg.10mMTris-HCL+1mMMgCl2pH8.0,含有6％甘露醇,5％蔗糖和0.5％人血清白蛋白(HSA)进一步进行渗滤；渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间；用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液；对无菌散装药液取样，质检检测；无菌散装药液可以暂时存放在-80C的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒载体基因疫苗药品制剂的瓶装和冻干。
将要瓶装的一批或多批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后,用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加瓶塞,直接进行冻干，冻干后扎盖。对重组腺病毒载体基因疫苗药品制剂抽样进行质检检测。合格的产品保存在4℃温度下，由质保批准用于临床使用。
本发明的技术方案有益效果在于：该方法可以实现大规模工业化，安全和经济有效的GMP生产预防新型冠状病毒的重组腺病毒载体基因疫苗产品。
附图说明
图1为本发明的方法流程图；
图2为灌注浪式生物反应器的结构和工作原理图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步具体说明本发明的技术方案。
参照图1所示，本实施例是一种用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，采用无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：
1、细胞扩增
取1只无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞管，细胞量约1x107到1x108。细胞融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度约3x104到1x104/毫升。在37℃,5％二氧化碳孵箱内培养。转瓶的摇转速度在50–150rpm。培养细胞密度到约2x106/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x105/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养。重复细胞扩增的操作，直到有足够量的细胞用于接种生物反应器。
2、生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增
采用了简单，有效的灌注培养无血清悬浮细胞的浪式生物反应器(eg.WaveBioreactor,GE Healthcare,USA)来进行高密度大规模的细胞培养。图2显示了灌注浪式生物反应器的结构和工作原理。浪式生物反应器采用连续的平缓摇摆运动来达到细胞培养的混合和供氧，对细胞不会产生剪切损伤，十分适合细胞的无血清悬浮培养。在浪式生物反应器的细胞培养袋内安装一个过滤膜，就形成了一个可以用于灌注培养的浪式生物反应器。在细胞培养过程中，过滤膜悬浮在培养液的表面，并随着培养液的浪式运动，而来回的浮动，可以有效的防止过滤膜在培养液灌注时的堵塞。浪式生物反应器的细胞培养袋是无菌的，直接可以使用而不许要进一步的消毒处理。
将细胞培养袋安放在Wave-20浪式生物反应器的平台后，通过细胞培养袋上的接种乳胶管，首先加入9升的无血清培养液(eg,CD-293,Invitrogen)。将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养。细胞接种量约2x109。培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。pH控制在6.5-8.2之间。DO控制在15％-75％之间。培养液的温度有生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36-37C之间。摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。
当细胞在浪式生物反应器内生长到浓度至2-3x106/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品。在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内。细胞被保留在反应器内。生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升。继续培养细胞。当细胞浓度达到1x107/毫升时，将细胞从Wave-20生物反应器转送到大约十倍体积的用于重组腺病毒的感染的下一个生物反应器，比如Wave-200或其他的搅拌式一次性使用生物反应器(SUB)。
3、细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器
当细胞浓度在Wave-20浪式生物反应器内达到1x107/毫升时，将细胞从Wave-20生物反应器转送到预先已加有了90升新鲜培养液的下一个大体积的生物反应器中。这下一个大体积的生物反应器可以是Wave-200或其他的或其他的搅拌式一次性使用生物反应器(SUB)。
对细胞进行十倍新鲜培养液稀释的目的是为了保证细胞在下一步重组腺病毒的感染和扩增过程中的活性和提供充分的营养。稀释后细胞浓度约1x106/毫升，重组腺病毒感染的最佳细胞浓度。在转送到大体积的生物反应器后，首先让稀释后的细胞在生物反应器内隔夜培养，已保证细胞在重组腺病毒感染时处于最佳的活性状态。
培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。pH控制在6.5-8.2之间。DO控制在15％-75％之间。培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36-37C之间。Wave-200生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。如果采用搅拌式生物反应器，搅拌速度控制在50-100rpm之间。
4、重组腺病毒感染和扩增
取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞。病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间。病毒感染后，细胞培养参数维持不变。病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液。培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内。在收获前可以向反应器内加入1％(终浓度)的Tween-20，搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液，用于下一步的处理纯化。
5、重组腺病毒培养液滤清和浓缩
首先将收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质。再将滤清的收集液用另外一个300KD MWCO的切向流超滤系统浓缩约10–50倍。对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转化到另外一个缓冲液内(0.5M Tris+2mMMgCl2,pH 8.0)，以方便接下来的核酸酶处理和离子交换柱层析分离纯化。渗滤系数在3-10之间。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-20psi之间。为了提高核酸酶处理的效率，可以在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。
6、核酸酶处理
本过程采用了BenzonaseTM，一个广泛用于生物制品生产过程的广谱内核酸酶。将BenzonaseTM加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子。剂量在10-20U/毫升之间。降解处理在37C的水浴中进行1个小时。
7、全自动离子交换柱层析分离纯化
在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化BenzonaseTM处理过的重组腺病毒收集液。纯化过程采用Unicorn软件控制的全自动的纯化系统。将阴离子交换树脂(eg.Sepharose Q XL)装柱于BPG300的柱子内，装柱体积约6升。在使用柱子前，先对柱子进行HETP(Height Equivalent to Theoretical Plate)检测，以保障柱子的性能是合格的。在上柱前，首先用1.0N的NaOH溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的柱子进行消毒处理。处理后的柱子首先用A缓冲液(20mM Tris,pH8.0)平衡。柱子平衡后，开始将重组腺病毒收集液上柱。
上柱后，用5-8倍柱体积的A缓冲液清洗柱子直到UV吸收值降到底线为止。紧接着用30倍柱体积的A缓冲液到B缓冲液(20mM Tris,pH8.0,2M NaCl)的线性NaCl梯度来洗脱吸附在柱子上的重组腺病毒。在洗脱过程中Unicorn软件通过对280nm的UV吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现。当280nm的UV吸收值升到0.1AU时，纯化的重组腺病毒峰会自动的接受到一个消毒无菌的瓶子内。当280nm的UV吸收值降到0.2AU时，停止接受。之后，依次用碱液，缓冲液，和酸液，缓冲液洗涤柱子和纯化系统。最后将柱子和纯化系统存放于0.01N NaOH的存储液内。
8、产品配制，瓶装和冻干
首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统(eg.Millipore Pellicon系统)进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标(eg.1x1012vp/毫升)。然后用重组腺病毒产品的配液(eg.10mMTris-HCL+1mMMgCl2pH8.0,含有6％甘露醇,5％蔗糖和0.5％人血清白蛋白)进一步进行渗滤。渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液。对无菌散装药液取样，质检检测。无菌散装药液可以暂时存放在-80℃的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。
将一批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后,用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加用于冻干的瓶塞。将罐装好的瓶子在无菌的环境下装入冻干机内。采用以下程序控制冻干过程。
(1)设定冻干架温度在-45度，冻结瓶内产品，时间2小时。
(2)设定冻干架温度在-45度，启动真空泵，设定真空在400mT，时间5小时。
(3)设定冻干架温度在-35度，设定真空在200mT，时间13小时。
(4)设定冻干架温度在-22度，设定真空在100mT，时间15小时。
(5)设定冻干架温度在-10度，设定真空在100mT，时间5小时。
(6)设定冻干架温度在10度，设定真空在100mT，时间4小时。
(7)在真空下压塞，密封瓶内产品。
(8)结束冻干过程，取出冻干的产品，轧盖。
冻干结束后，对重组腺病毒载体基因疫苗制剂产品抽样进行质检检测。检测项目包括：观察瓶内有完整的冻干饼层，再用注射水重构冻干制剂产品，进行无菌，外观(淡白色液体，无肉眼可见异物)，内毒素＜10EU/支，采用培养法和荧光染色法检测支原体阴性，病毒浓度1X 1012vp/支,病毒纯度≥95％，病毒活性≥3.3X 1010IU/支，比活性≥3.3％，生物活性抗原蛋白表达量，复制活性病毒＜1RCA/3X 1010vp，残留细胞蛋白质≤100ng/支，残留牛血清蛋白≤50ng/支，残留细胞DNA≤10ng/支，残留BenzonaseTM≤1ng/支，无AAV污染，无异常毒性，无不溶性微粒，渗透压摩尔浓度等。合格的产品由质量管理部批准用于临床使用。

Claims (10)

1.一种用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，将无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞扩增，采用生物反应器无血清悬浮培养细胞，取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染和扩增生物反应器内的细胞，用全自动的柱层析分离纯化重组腺病毒载体，使用纯化后重组腺病毒载体配制成重组腺病毒载体基因疫苗。
2.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，细胞扩增的生产细胞是具有无血清悬浮培养特性的SBN-293SFS克隆细胞。
3.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，采用生物反应器灌注培养和再扩增无血清悬浮细胞液，当灌注培养细胞浓度达到1.0x107/毫升时，将细胞从灌注培养生物反应器用新鲜培养液稀释十倍体积，转送到下一个大体积的生物反应器用于重组腺病毒的感染和扩增。
4.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，感染和扩增后的重组腺病毒会释放到培养液内，从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液，在收获前向反应器内加入终浓度为1％的洗涤剂搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。
5.如权利要求4所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，洗涤剂是Tween-20非离子洗涤剂。
6.如权利要求4所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，收获后的重组腺病毒的培养液采用切向流微滤和切向流超滤系统过滤和浓缩重组腺病毒载体溶液。
7.如权利要求6所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，过滤和浓缩后采用核酸酶处理组腺病毒载体溶液来降解重组腺病毒载体溶液中的核酸杂质。
8.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，采用阴离子交换柱层析分离纯化重组腺病毒载体，阴离子交换柱中的阴离子交换树脂为Sepharose Q XL树脂或Source Q树脂。
9.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，将柱层析纯化后的重组腺病毒采用切向流超滤系统来浓缩和配制重组腺病毒载体基因疫苗。
10.如权利要求1所述的用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，对所生产的重组腺病毒载体基因疫苗进行质量检测，合格后可用于预防新型冠状病毒的感染和传染。
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