CN114306587B

CN114306587B - 一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗

Info

Publication number: CN114306587B
Application number: CN202111578301.9A
Authority: CN
Inventors: 李庆岸; 陈佳丽; 王立刚; 杨莹莹; 杨健; 由迪
Original assignee: Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-12-29
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114306587A

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗。所述血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法包括操作步骤，S1：人二倍体细胞的复苏，培养扩增；在所述培养扩增中，采用细胞培养液及片转球培养技术进行培养扩增，所述细胞培养液中牛血清的体积百分浓度为0.5%‑2%。本申请中的制备方法更加经济、高效、安全，对疫苗的影响较小。利用本申请所述的制备方法制备获得乙型脑炎灭活疫苗，所述乙型脑炎灭活疫苗的效价在1.3以上。

Description

一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗。

背景技术

乙型脑炎是一种由中枢神经系统急性病毒感染导致的传染性疾病，主要是由三带喙库蚊叮咬进行传播。病毒通过蚊虫叮咬进入人体内，首先，病毒在人体的局部组织和淋巴结进行复制，然后扩散至其它部位，当机体免疫力低下或某些脑组织损伤时，病毒通过血-脑脊液的屏障，侵犯中枢神经系统而发生脑炎，简称乙脑。

在中国，乙型脑炎的流行具有明显的季节性特点，多发生于夏、秋季节，90％以上的病例发生于7、8、9三个月。该病多发于10岁以下儿童，且易产生严重后遗症，如：失语、瘫痪、精神异常、痴呆等。最近几十年中，乙型脑炎的暴发流行越来越向曾经是非流行的地区扩大，以高热和狂暴或沉郁等神经症状为特征；同时伴随很高的病死率和严重的持久性神经系统后遗症。因此，在亚洲很多国家和地区，乙脑成为严重的公共健康问题。目前，还没有有效地治疗乙型脑炎的药物，从环境方面控制传播的效果也不理想。因此，预防性接种疫苗是乙型脑炎的有效手段。

目前，世界上应用较多的乙脑疫苗主要有以下几种。第一，经小鼠脑组织感染乙脑病毒制备的纯化乙脑疫苗、原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗。灭活疫苗免疫原性弱，需要多次接种，并且无法保证不携带外源因子进入人体，是多见过敏反应的重要原因。减毒活疫苗虽然可以减少多次接种引发的过敏反应。但有报道称减毒疫苗中的病毒在有免疫功能障碍的动物体内可增殖，并引起死亡。因此，对于接种免疫功能障碍者来说，有可能造成安全性的问题。第二，以Vero细胞为培养基质生产的冻干乙脑纯化灭活疫苗；由于Vero细胞中残余DNA对接种者有潜在的致癌性风险。因此，在疫苗制备过程中必须严格控制残余含量。

在细胞培养过程中，牛血清具有重要作用。目前，牛血清的浓度为5％-10％，牛血清可以为细胞、病毒的增殖提供必要的蛋白、生长激素等物质。但是，动物源性的牛血清存在很明显的缺陷，即成分不确定、批间差异大、外源病毒污染等潜在风险。另外，在实际生产中，牛血清提取工艺复杂，成本高昂，给大规模生产带来困难，不利于商业化开发，且牛血清成分复杂，无法得到有效质控，常见细胞源疫苗中，牛血清残留对疫苗免疫效果巨有很大的影响。

目前，人们亟需找到一种合适的培养方式来扩增MRC-5细胞，能够节省大量的人力、物力、财力，能够大规模的进行乙型脑炎疫苗的生产，且保证乙型脑炎疫苗的安全性。

发明内容

为了使乙型脑炎灭活疫苗的生产过程更加经济、高效，且能保证疫苗安全性，本申请提供了一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗。

第一方面，本申请提供了一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，包括以下操作步骤，

S1：人二倍体细胞的复苏，培养扩增；

在所述培养扩增中，采用细胞培养液及片转球培养技术进行培养扩增，所述细胞培养液中所含牛血清的体积百分浓度为0.5％-2％。

在本申请中，以人二倍体细胞作为细胞基质进行培养，在培养扩增过程中，利用含有牛血清的细胞培养液对人二倍体细胞提供营养，所述细胞培养液中所含牛血清的体积百分浓度为0.5％-2％。在培养扩增过程中还应用了片转球培养技术，能够收获更多的人二倍体细胞。本申请通过采用低浓度牛血清与片转球培养技术相结合的方法制备乙型脑炎灭活疫苗，所述乙型脑炎灭活疫苗具有较高的效价，效价在1.3以上。

目前，在相关研究中，细胞培养液中所含牛血清的体积百分浓度为5％-10％。本申请与现有研究相比具有以下好处：第一，安全方面。在培养人二倍体细胞时，牛血清能够提供细胞增殖所必须的蛋白质与生长激素等。但是，牛血清中存在一定的外源性病毒污染的风险。本申请中牛血清的体积百分浓度为0.5％-2％，相较于现有研究中5％-10％浓度的牛血清具有低风险性，更加安全。第二，经济方面。在实际生产中，牛血清的提取工艺较为复杂，且成本较高，不利于大规模生产及商业化的开发。本申请中利用低浓度牛血清进行细胞培养，节约成本，更加经济。第三，对乙型脑炎灭活疫苗的影响。牛血清中成分较为复杂，无法得到有效的质控，牛血清的残留对疫苗免疫效果有很大的影响。本申请中采用低浓度牛血清进行人二倍体细胞培养，减少牛血清残留量，提高乙型脑炎疫苗的质量。

优选地，所述细胞培养液中所含牛血清的体积百分浓度为0.9％-1.2％。

牛血清能够为细胞的培养扩增提供营养，促进细胞的繁殖，培养获得更多的细胞。但是，随着牛血清含量的增加，牛血清的残留量也逐渐提高。因此，降低了乙型脑炎疫苗的效价。当牛血清的体积百分浓度为0.9％-1.2％时，乙型脑炎疫苗的效价较高。

在一个具体的实施方案中，所述牛血清的体积百分浓度为1％。采用上述技术方案培养扩增人二倍体细胞时，培养获得的人二倍体细胞较多，且乙型脑炎疫苗的效价最高，乙型脑炎疫苗的效价为2.016。

优选地，所述片转球培养技术是将人二倍体细胞依次在150cm²方瓶、一次性塑料转瓶、10L片状细胞培养袋和40L生物反应器中进行培养，所述40L生物反应器中采用的是Cytodex1型微载体或Cytodex3型微载体在本申请中，利用150cm²方瓶、一次性塑料转瓶、10L片状细胞培养袋以及40L生物反应器进行细胞培养扩增。(1)在150cm²方瓶中，按照1×10⁶个/cm²的密度将人二倍体细胞进行接种，再加入细胞培养液，细胞培养液中含有体积百分浓度为0.5％-2％的牛血清，在37℃下，培养长至致密单层后用胰酶消化，得到细胞悬液。(2)在一次性塑料转瓶中，将(1)制得的细胞悬液加到另外的细胞培养液中，按照面积比为1:4的接种比例进行接种，在37℃条件下培养3-4天后，利用胰酶进行消化，得到细胞悬液。(3)将(2)制得的细胞悬液转移到10L片状细胞培养袋中进行培养，培养5-7天后，经胰酶消化后，得到细胞悬液。(4)按照1.5-1.7×10⁶个/mL的上罐密度，将(3)制得的细胞悬液和溶胀灭菌后的微载体加入40L生物反应器中。在pH值为7.0-7.4，温度为37±0.5℃下，灌流培养5-7天。根据细胞生长情况，实时监控并调整40L生物反应器中各个指标。

在本申请中，10L片状细胞培养袋选自武汉赛科成科技有限公司，在40L生物反应器中的微载体可以选自Cytodex1型微载体和Cytodex3型微载体中的任意一种，扩大细胞的培养数量。

优选地，所述人二倍体细胞为MRC-5。

MRC-5细胞是WHO推荐可以用于人用疫苗生产的理想人二倍体细胞株。当生产疫苗的时，在传代过程中，MRC-5细胞保持二倍体核型，且残余成分不会对人体产生超敏反应和致瘤性。从质量控制和安全性的角度看，没有传代细胞和原代动物细胞的缺点，没有潜在的不安全隐患，具有较高的免疫原性和良好的耐受性，已广泛应用于疫苗的生产。

示例性地，所述人二倍体细胞还可以选自WI-38、KMB17、IMR-90和2BS中的任意一种。

在本申请中，一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，包括以下操作步骤，

S1：人二倍体细胞的复苏，培养扩增；

S2：乙型脑炎病毒感染人二倍体细胞；

S3：收获病毒液；

S4：澄清超滤；

S5：病毒液的灭活；

S6：纯化；

S7：稀释液制备；

S8：半成品制备；

S9：成品制备。

在操作步骤S2中，将乙型脑炎病毒接种在40L生物反应器中进行增殖培养。当40L生物反应器内二倍体细胞的密度达到2.0×10⁷个/mL以上时，将细胞培养液更换为病毒维持液；然后按照0.1-0.001MOI接种病毒，并吸附2-3小时后进行灌流。其中乙型脑炎病毒为京卫研3株、Nakayama株或SA14-14-2株，优选京卫研3株(简称P3株)。每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获10-15天，得到病毒收获液。所述病毒维持液指的是含0.2％人血白蛋白的L-15培养液。

优选地，所述澄清超滤步骤中，先利用0.65μm的滤膜澄清，再利用截留分子量为300KD滤膜对所述病毒收获液进行超滤浓缩20-30倍，得到浓缩液，所述浓缩液中蛋白质的含量为10-30mg/mL。

将病毒浓缩液进行灭活与纯化处理。在纯化步骤中，利用柱色谱的方法对灭活后病毒液进行纯化，得到乙型脑炎灭活疫苗原液。

优选地，所述稀释液制备步骤中，包括两种稀释液的制备。第一种稀释液为冻干稀释液，冻干稀释液是由3-5wt％麦芽糖与2wt％人血白蛋白溶解于PBS溶液中，再用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤制备得到。第二种稀释液为水针稀释液，水针稀释液是由2wt％人血白蛋白溶解于PBS溶液后，再用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤制备得到。

在本申请中，利用麦芽糖与人血白蛋白配制冻干稀释液。一方面，冻干稀释液与纯化后的乙型脑炎灭活疫苗原液混合制备成半成品。另一方面，冻干稀释液对乙型脑炎灭活疫苗原液中的抗原进行保护，在后续成品制备中，能够起到冻干赋形剂的作用。

优选地，所述半成品配制步骤中，利用乙型脑炎灭活疫苗原液与稀释液按1:3-1:6的体积比混合，所述乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质的含量为12-18μg/ml，抗原的含量不低于1:16。

将配制好的稀释液与乙型脑炎灭活疫苗原液按比例进行混合，制备获得灭活疫苗半成品。示例性地，所述乙型脑炎灭活疫苗原液与稀释液的体积比为1:3，1:4，1:5，1:6。乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质含量为12-18μg/ml，乙型脑炎灭活疫苗原液中抗原的含量不低于1:16。当抗原的含量低于1:16时，疫苗对人体不能起到有效地防护作用，浪费大量的财力与物力。

第二方面，本申请提供了一种乙型脑炎灭活疫苗。所述乙型脑炎灭活疫苗通过本申请所述的低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法制备而成。

优选地，所述乙型脑炎灭活疫苗为冻干型或水针型疫苗。

在本申请中，利用牛血清的体积百分浓度为0.5％-2％的细胞培养液并结合片转球的培养技术进行细胞的扩增培养，然后接种病毒，经过收获病毒液、澄清超滤、灭活、纯化等操作步骤后获得乙型脑炎灭活疫苗。本申请中的灭活疫苗分为冻干型和水针型疫苗。所述冻干型疫苗是将纯化后得到的乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液进行混合，制备得到乙型脑炎灭活疫苗半成品。将半成品乙型脑炎灭活疫苗经过冻干后，得到冻干型灭活疫苗。所述水针型灭活疫苗将纯化后得到的乙型脑炎灭活疫苗原液与水针稀释液进行混合后，制备得到水针型灭活疫苗。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用低血清浓度与片转球的培养技术相配合的培养方式进行人二倍体细胞的扩增培养，再经过接种P3株病毒、收获病毒液、澄清超滤、灭活、纯化等操作步骤后获得乙型脑炎灭活疫苗，所述乙型脑炎灭活疫苗的效价在1.3以上；

2、本申请中优选采用10L片状细胞培养袋、40L生物反应器，并且在40L生物反应器中使用Cytodex1型微载体或Cytodex3型微载体，能够增加人二倍体细胞的数量，得到细胞数在0.9×10⁷个/mL以上；

3、本申请的方法更加经济、高效、安全，对疫苗的影响较小。

附图说明

图1为实施例1在一次性塑料转瓶中第一天的细胞图片；其中左图为4×10倍下的照片，右图为10×10的照片；

图2为对比例1在一次性塑料转瓶中第一天的细胞图片；其中左图为4×10下的照片，右图为10×10的照片；

图3为实施例1在一次性塑料转瓶中第三天的细胞图片；其中左图为4×10下的照片，右图为10×10的照片；

图4为对比例1在一次性塑料转瓶中第三天的细胞图片；其中左图为4×10下的照片，右图为10×10的照片。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请中所用原料均可通过市售获得，具体来源参照表1。

表1原料来源

名称	来源
		Cytodex1型微载体	通用电气(GE)公司
Cytodex 3型微载体	通用电气(GE)公司
		10L片状细胞培养袋	武汉赛科成科技有限公司
40L生物反应器	Eppendorf
		牛血清	兰州荣晔生物科技有限公司
L-15培养液	Life Technologies Corporation(GIBCO)
		胰蛋白酶	Life Technologies Corporation(GIBCO)
β-丙内酯	SERVA Ferak Berlin
		人血白蛋白	华兰生物工程重庆有限公司

本申请中的原料除表1外，无特殊要求。

实施例

实施例1

S1：人二倍体细胞的复苏、培养扩增；

(1)将液氮保存的人二倍体细胞MRC-5迅速融化，按照1×10⁶个/cm²的密度将MRC-5细胞接种在150cm²方瓶中，加入100ml细胞培养液DAM-SR，DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为1％；在37±0.5℃条件下，培养长至致密单层后用胰酶消化，获得一次细胞悬液。(2)在一次性塑料转瓶中，按照面积比为1:4的接种比例加入一次细胞悬液，再加入另外的350mlDAM-SR。在37±0.5℃条件下培养3天后，利用胰酶进行消化，获得二次细胞悬液。(3)将二次细胞悬液转移到10L片状细胞培养袋中进行培养。在该细胞培养袋中培养5天后，经胰酶消化后，获得三次细胞悬液。(4)按照1.6×10⁶个/mL的上罐密度，将三次细胞悬液和Cytodex1型微载体加入40L生物反应器中，在40L生物反应器中Cytodex1型微载体约500g微载体；在pH值为7.2，温度为37±0.5℃下，灌流培养7天。根据细胞生长情况，实时监控并调整40L生物反应器的各个指标。

S2：乙型脑炎病毒感染人二倍体细胞；当40L生物反应器内的细胞密度达到2.0×10⁷个/mL以上时，将细胞培养液DAM-SR更换为病毒维持液；然后在40L生物反应器中接种P3病毒进行增殖培养，P3病毒为0.002MOI，并吸附3小时后进行灌流。其中病毒维持液为含0.2％人血白蛋白的L-15培养液。

S3：收获病毒液；在48h后更换病毒维持液，每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获10天，得到病毒收获液。

S4：澄清超滤；利用0.65μm滤膜对病毒收获液进行初步澄清，然后利用分子量为300KD滤膜超滤浓缩30倍，得到浓缩液。所述浓缩液中蛋白质的含量为15mg/mL。

S5：病毒液的灭活；向所述浓缩液中加入β-丙内酯，浓缩液与β-丙内酯的体积比为1:4000，置于4±0.5℃搅拌灭活24小时，然后于37±0.5℃水解2小时，得到病毒液，将所述病毒液置于6±0.5℃保存。

S6：纯化；将灭活后的病毒液利用柱色谱的方法进行纯化。

采用柱色谱的方法将灭活后的病毒液进行纯化，色谱介质为Sepharose 6FF，洗脱平衡液为0.01M的PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为7.6。上样量不超过柱体积的10％，收集纯化液的检测紫外波长为280nm，收集第一峰，收集纯化液的吸光值范围从50mAU开始收集，吸光值回到50mAU时结束收集。合并收集得到的纯化液，并在纯化液中加入终浓度为1％的人血白蛋白做稳定剂，得到乙型脑炎灭活疫苗原液。

S7：冻干稀释液制备；将麦芽糖(4g)和人血白蛋白(2g)溶解于PBS溶液后，再用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤。

S8：半成品制备；乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按1:5的体积比混合，得到乙型脑炎灭活疫苗的半成品，所述乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质的含量为15μg/ml，抗原的含量为1:16。

S9：成品制备；将半成品分装到西林瓶中后，用Christ冻干机按照传统方法冻干，得到冻干型乙型脑炎灭活疫苗。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于，实施例2中人二倍体细胞的复苏、培养扩增步骤中，细胞培养液DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为0.5％。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于，实施例2中人二倍体细胞的复苏、培养扩增步骤中，细胞培养液DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为0.9％。

实施例4

实施例4与实施例1的区别在于，实施例4中人二倍体细胞的复苏、培养扩增步骤中，细胞培养液DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为1.2％。

实施例5

实施例5与实施例1的区别在于，实施例5中人二倍体细胞的复苏、培养扩增步骤中，细胞培养液DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为2％。

实施例6

实施例6与实施例1的区别在于，实施例6中乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按1:6的体积比混合。

实施例7

实施例7与实施例1的区别在于，实施例7中乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按1:3的体积比混合。

实施例8

实施例8与实施例1的区别在于，实施例8中乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按1:2的体积比混合。

实施例9

实施例9与实施例1的区别在于，实施例9中乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质含量为18μg/ml，抗原含量为1:32。

实施例10

实施例10与实施例1的区别在于，实施例10中乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质的含量为10μg/ml，抗原的含量为1:16

对比例

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中人二倍体细胞的复苏、培养扩增步骤中，细胞培养液DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为10％。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2采用的是片转片的培养技术。片转片的培养技术与片转球的培养技术的区别在于，在片转片的培养技术中，40L生物反应器中加入的是艾本德片状微载体。

性能检测试验

一、疫苗效价的对比

将实施例1-10与对比例1-2制备的乙型脑炎灭活疫苗进行效价的检测。根据2020版药典进行效价的检测，具体检测结果如表2所示。

表2效价的检测结果

结合实施例1-10并结合表2可以看出，由实施例1-10制备的乙型脑炎灭活疫苗具有较高的效价，效价在1.3以上。尤其是实施例2中牛血清的体积百分浓度为1％时，效价为2.016。

结合实施例1-5和对比例1并结合表2可以看出，随着牛血清的体积百分浓度的提高，乙型脑炎灭活疫苗的效价先增高后下降。实施例1-5中乙型脑炎灭活疫苗的效价是对比例1的4.9倍以上。

结合实施例1、6、7和8并结合表2可以看出，利用乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按照相应的比例制备乙型脑炎灭活疫苗的半成品，随着冻干稀释液的逐渐增加，乙型脑炎灭活疫苗的效价先增高后下降。

二、细胞数量检测

1、在一次性塑料转瓶

根据表2的检测结果，在一次性塑料转瓶中对实施例1与对比例1进行细胞数量的观测。参照图1-4，其中图1为实施例1在一次性塑料转瓶中第一天的细胞数量图；图2为对比例1在一次性塑料转瓶中第一天的细胞数量图；图3为实施例1在一次性塑料转瓶中第三天的细胞数量图；图4为对比例1在一次性塑料转瓶中第三天的细胞数量图。

2、在150cm²方瓶中

在细胞培养过程中，检测实施例1、2、5和对比例1在150cm²方瓶中的细胞的数量，具体检测结果如表3所示。

表3具体检测结果(×10⁴个/cm²)

类别	D1	D2	D3	D4	D5
						实施例1	4.6	7.28	14.52	25	29.8
实施例2	3.2	5.96	13.38	21.2	22.6
						实施例5	4.6	8.14	13.38	18.92	25.08
对比例1	4.0	7.4	15.2	27.6	35.2

结合实施例1、2、5和对比例1并结合表3可以看出，随着培养时间的延长，MRC-5细胞的数量逐渐增加。在第五天时可以看出，随着DAM-SR中牛血清的体积百分浓度的增加，MRC-5细胞的数量随之逐渐增加。当DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为10％时，MRC-5细胞的数量最高。

3、培养扩增过程中细胞数检测

在150cm²中进行初步培养后，将MRC-5细胞在一次性塑料转瓶、10L片状细胞培养袋和40L生物反应器中培养扩增，检测一次性塑料转瓶、10L片状细胞培养袋和40L生物反应器中MRC-5细胞的数量，具体检测结果如表4所示。

表4培养扩增过程中细胞数检测(单位：个/mL)

结合实施例1、2、5和对比例1并结合表4可以看出，在一次性塑料转瓶中，随着DAM-SR中牛血清的体积百分浓度的增加，MRC-5细胞的数量随之逐渐增加。

结合实施例1、2、5和对比例1、2并结合表4可以看出，随着DAM-SR中牛血清的体积百分浓度的增加，MRC-5细胞的数量随之逐渐增加，当DAM-SR中牛血清的体积百分浓度为1％时，MRC-5细胞的数量达到最高。

结合实施例1和对比例2并结合表4可以看出，实施例1与对比例2中牛血清的体积百分浓度均为1％，实施例1采用的是片转球的培养技术，对比例2采用的片转片的培养技术。在40L生物反应器中可以看出，实施例1获得MRC-5细胞的数量高于对比例2。

参照图1-4并结合表4可以看出，实施例1和对比例1在一次性塑料转瓶中，随着时间的延长，MRC-5细胞的数量逐渐增多。在第三天时，对比例1中MRC-5细胞的数量高于实施例1。

三、病毒收获液的滴度检测

对实施例1、2、5和对比例1、2进行病毒收获滴度的测定。检测方法如下：取体重为7～9g的昆明小鼠或其他品系小鼠共25只，分为5组，每组5只；对实施例1、2、5和对比例1、2中的病毒收获液做10倍稀释，制得稀释病毒液，将稀释病毒液接种在小鼠的脑内，每只接种0.03mL，逐日观察，3天内死亡者不计(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20％)，观察14天。病毒滴度应不低于8.0lgLD₅₀/ml。具体检测结果如表5所示。

表5病毒收获液滴度的检测结果

结合实施例1、2、5和对比例1、2并结合表5可以看出，随着DAM-SR中牛血清的体积百分浓度的增加，病毒收获液的滴度逐渐升高，当牛血清的体积百分浓度达到1％时，病毒收获液滴度最高；当牛血清的体积百分浓度继续增加时，病毒收获液滴度逐渐下降。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤，

S1：人二倍体细胞的复苏，培养扩增；

在所述培养扩增中，采用细胞培养液及片转球培养技术进行培养扩增，所述细胞培养液中牛血清的体积百分浓度为0.9%-1.2%；所述片转球培养技术是将复苏的人二倍体细胞依次在150cm²方瓶、一次性塑料转瓶、10L片状细胞培养袋和40L生物反应器中进行培养，所述40L生物反应器中采用的是Cytodex1型微载体或Cytodex3型微载体；

S2：乙型脑炎病毒感染人二倍体细胞，将乙型脑炎病毒接种在40L生物反应器中进行增殖培养，当生物反应器内二倍体细胞的密度达到2.0×10⁷个/mL以上时，将细胞培养液更换为病毒维持液，然后按照0.1-0.001MOI接种病毒，并吸附2-3个小时后进行灌流，其中乙型脑炎病毒为京卫研3株，所述人二倍体细胞为MRC-5，所述病毒维持液是指含0.2%人血白蛋白的L-15培养液；

S3：收获病毒液，每批次的病毒培养液收获10-15天，得到病毒收获液；

S4：澄清超滤，先利用0.65µm的滤膜澄清，再利用截留分子量为300KD滤膜对所述病毒收获液进行超滤浓缩20-30倍，得到病毒浓缩液，所述浓缩液中蛋白质的含量为10-30mg/mL；

S5：病毒浓缩液的灭活；

S6：病毒浓缩液纯化；

S7：稀释液制备，包括冻干稀释液或水针稀释液，所述冻干稀释液是由3-5wt%麦芽糖与2wt%人血白蛋白溶解于PBS溶液中，再用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤制备得到；所述水针稀释液是由2wt%人血白蛋白溶解于PBS溶液后，再用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤制备得到；

S8：成品制备，将纯化后得到的乙型脑炎灭活疫苗原液与冻干稀释液按1:3-1:6的体积比混合，制备得到乙型脑炎灭活疫苗半成品，将半成品乙型脑炎灭活疫苗冻干后得到冻干型灭活疫苗；或将纯化后得到的乙型脑炎灭活疫苗原液与水针稀释液按1:3-1:6的体积比混合后，制备得到水针型灭活疫苗，所述乙型脑炎灭活疫苗原液中蛋白质的含量为12-18µg/ml，抗原的含量不低于1:16。

2.根据权利要求1所述的低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液中所含牛血清的体积百分浓度为1%。