CN105296438A - 一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法 Download PDF

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李文娟
刘双军
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张伟红
赵红丽
刘梦妮
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Abstract

本发明公开了一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法，提供一种森林脑炎病毒SZV株，病毒滴度可以达到并稳定在8.5lgLD50/ml，同时证明该株病毒生物学活性稳定，抗原性广、免疫原性良好、无外源因子污染；作为毒种用于制备森林脑炎灭活疫苗。

Description

一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法
技术领域
本发明提供了一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法，涉及利用生物反应器、采用Vero细胞制备森林脑炎灭活疫苗的方法，特别是工业化制备的方法，属于生物制药领域。
背景技术
森林脑炎又称蜱传脑炎，是由森林脑炎病毒引起的，流行于北温带的，以蜱类为主要传染源，以侵犯中枢神经系统为主的自然疫源性疾病，病死率在20%～30%，是一种严重危害人民健康的病毒性传染病，我国政府将其列入法定的由生物因素引起的职业病之一；
用于预防森林脑炎的疫苗，先后经历了用鼠脑、鸡胚、鸡胚细胞、原代地鼠肾细胞等基质进行制备，目前，我国使用的是原代地鼠肾细胞制备的森林脑炎灭活疫苗，国外使用的是鸡胚细胞制备的森林脑炎灭活疫苗，重组基因工程疫苗、减毒活疫苗等正处于研究之中，但目前尚无重大突破；
我国目前使用的是原代地鼠肾细胞制备的森林脑炎灭活疫苗，对于降低森林脑炎的发病率确实起到了重要的作用，使森林脑炎的发病率得到了控制；但由于在疫苗生产中使用动物的原代细胞培养，在培养过程中缺点主要有：（1）、所使用动物的饲养、繁殖、无菌操作等的控制存在诸多不便，因而限制了生产规模；（2）、受制于动物的级别，细胞基质中携带外源因子的风险要高于传代细胞及二倍体细胞；（3）、原代细胞不能像二倍体细胞或是传代细胞那样经严格检验后再使用；（4）原代细胞批间差异的风险要高于传代细胞及二倍体细胞；（5）原代地鼠肾细胞不适合使用生物反应器进行大规模高密度培养，因此急需一种即对森林脑炎病毒敏感又可用于生物反应器培养的传代细胞基质来制备森林脑炎灭活疫苗。
发明内容
本发明于提供一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法，通过传代细胞系(Vero细胞)培养而制备的疫苗，包含灭活的森林脑炎病毒，并且Vero细胞DNA残留量小于100pg/剂，该疫苗具有功效，具有对可能与病毒接触的任何人进行免疫注射的安全性；
本发明所述的一种森林脑炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为：CGMCCNo.10960，保藏日期为2015年7月17日；命名为：森林脑炎病毒。
本发明所述森林脑炎病毒SZV株制备森林脑炎灭活疫苗生产方法，包括以下步骤：
1）、细胞培养
Vero细胞使用含有新生牛血清的动物细胞培养液进行培养，生长液的pH值为6.8～7.6，培养温度为36～38℃，在细胞培养瓶进行培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×105～1.0×106；
所使用的动物细胞培养基，含有4～10%的新生牛血清的MEM或是199溶液，培养液的pH值为6.8～7.6，培养温度为36～38℃；
2）、病毒接种
当Vero细胞在生物反应器中的片状载体上长成致密单层后，接种森林脑炎病毒SZV株，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；病毒感染后选择pH值为7.6～8.6的含有0.1%～2%新生牛血清的MEM或是199溶液进行维持，培养温度为32～34℃；
3）、病毒收获
病毒在Vero细胞中增殖，病毒液细胞感染SZV株病毒并培养2～6天后，即可开始进行流加收获，流加速度5～20L/24小时，可以连续收获10～30天，流加液为pH值7.0～7.8含有0.1%～2%新生牛血清的MEM或是199溶液，培养温度为32～34℃；
4）、澄清处理
病毒收获液经过滤的方法进行澄清处理，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化；澄清工艺是选择0.45～1.0μm滤柱进行；
5）、超滤浓缩
经澄清处理后的病毒收获液可以选择100～500KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20～60倍；
6）、病毒灭活
浓缩后的病毒液选择β-丙内酯进行灭活；
7）、柱层析纯化及除菌
灭活后的浓缩病毒收获液通过凝胶过滤排阻层析，凝胶过滤的洗脱线性速度为20～40cm/小时，操作温度控制在4～25℃；
病毒浓缩液经柱层析纯化后立即进行除菌，采用0.22μm的除菌滤膜或滤柱进行，除菌后即为原液；
8）、疫苗配制
将原液按照抗原含量为1:8～1:64进行稀释后用佐剂配制成药物的形式。
本发明涉及的Vero细胞是森林脑炎病毒的敏感细胞之一，适合于森林脑炎灭活疫苗的生产，特别是选择森林脑炎病毒森“张”株的Vero细胞适应株（以下称SZV株）森林脑炎病毒SZV株经过全面检定，
本发明的积极效果在于：提供一种森林脑炎病毒SZV株，病毒滴度可以达到并稳定在8.5lgLD50/ml，同时证明该株病毒生物学活性稳定，抗原性广、免疫原性良好、无外源因子污染；作为毒种用于制备森林脑炎灭活疫苗。本发明培养条件易标准化；基于建立的细胞库进行生产，使生产的一致性和连续性好;营养要求不是很高，可用标准培养基，培养起来比二倍体细胞、原代细胞更加容易；可用于微载体生物反应器进行大规模生产。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.4终浓度为0.1%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例1中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×104/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养48小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例1中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经24小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20倍。
浓缩后的病毒液选择1/2000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为24小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.1%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.3mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
实施例2：
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.8终浓度为0.3%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例1中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×105/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养96小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例1中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经60小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择40倍。
浓缩后的病毒液选择1/4000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为48小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.1%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.5mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
实施例3：
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为8.2终浓度为0.5%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例1中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×106/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养144小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例1中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经24～96小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经1.0μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择300KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择60倍。
浓缩后的病毒液选择1/4000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为72小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.2%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.2%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.37mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
实施例4：
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.4终浓度为0.1%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例3中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×104/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养48小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例3中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经24小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20倍。
浓缩后的病毒液选择1/2000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为24小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.1%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.3mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
实施例5：
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.8终浓度为0.3%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例3中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×105/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养96小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例3中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经60小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择40倍。
浓缩后的病毒液选择1/4000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为48小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.1%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.5mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
实施例6：
取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为8.2终浓度为0.5%的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，按照生长液实施案例3中的配方配制细胞生长液并分散细胞，在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×106/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养144小时后，可长成致密单层细胞。
弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle,s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；按照维持液实施案例3中的配方配制维持液，培养温度为32～34℃，经24～96小时培养后开始进行流加收获。
病毒收获液经1.0μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。
病毒收获液经澄清处理后，可以选择300KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择60倍。
浓缩后的病毒液选择1/4000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为72小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。
浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose4FF介质，用pH7.4～7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪（A=280nm）检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.2%的人血白蛋白为稳定剂。
根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，本发明中使用的是pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入终浓度为0.2%的人血白蛋白作为稳定剂、加入终浓度为0.37mg/ml的氢氧化铝作为佐剂，分装后即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌检查、效价测定、热稳定性检查、氢氧化铝含量检查、异常毒性检查、pH值测定、装量检查、鉴别试验等。
本发明制备的森林脑炎灭活疫苗（Vero细胞），适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。

Claims (2)

1.一种森林脑炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为：CGMCC10960，保藏日期为2015年7月17日；命名为：森林脑炎病毒SZV株。
2.采用权利要求1所述森林脑炎病毒SZV株制备森林脑炎灭活疫苗生产方法，主要步骤如下：
1）、细胞培养
Vero细胞使用含有新生牛血清的动物细胞培养液进行培养，生长液的pH值为6.8～7.6，培养温度为36～38℃，在细胞培养瓶进行培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×105～1.0×106；
所使用的动物细胞培养基，含有4～10%的新生牛血清的MEM或是199溶液，培养液的pH值为6.8～7.6，培养温度为36～38℃；
2）、病毒接种
当Vero细胞在生物反应器中的片状载体上长成致密单层后，接种森林脑炎病毒SZV株，病毒感染复数可以选择为0.001～1.0之间，优选为0.001～0.5；病毒感染后选择pH值为7.6～8.6的含有0.1%～2%新生牛血清的MEM或是199溶液进行维持，培养温度为32～34℃；
3）、病毒收获
病毒在Vero细胞中增殖，病毒液细胞感染森林脑炎病毒SZV株病毒并培养2～6天后，即可开始进行流加收获，流加速度5～20L/24小时，可以连续收获10～30天，流加液为pH值7.0～7.8含有0.1%～2%新生牛血清的MEM或是199溶液，培养温度为32～34℃；
4）、澄清处理
病毒收获液经过滤的方法进行澄清处理，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化；澄清工艺是选择0.45～1.0μm滤柱进行；
5）、超滤浓缩
经澄清处理后的病毒收获液可以选择100～500KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20～60倍；
6）、病毒灭活
浓缩后的病毒液选择β-丙内酯进行灭活；
7）、柱层析纯化及除菌
灭活后的浓缩病毒收获液通过凝胶过滤排阻层析，凝胶过滤的洗脱线性速度为20～40cm/小时，操作温度控制在4～25℃；
病毒浓缩液经柱层析纯化后立即进行除菌，采用0.22μm的除菌滤膜或滤柱进行，除菌后即为原液；
8）、疫苗配制
将原液按照抗原含量为1:8～1:64进行稀释后用佐剂配制成药物的形式。
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