CN102911910A - 人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株新的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，CCTCCC201055，该细胞株对手足口病主要流行病毒株---柯萨奇病毒A组16型COX.A16和肠道病毒71型EV71二株病毒敏感，且病毒产量高。本发明还提供了制备二价手足口病毒灭活疫苗的方法，以及人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备手足口病毒灭活疫苗中的应用。用本发明提供人胚肺二倍体成纤维细胞株生产的二价灭活疫苗可有效预防手足口病。

Description

人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法

发明所属领域：

本发明属于细胞和病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及人胚肺二倍体成纤维细胞株，细胞株在制备二价手足口病毒灭活疫苗中的应用，以及用该细胞生产手足口病毒二价灭活疫苗的方法。

背景技术：

病毒性疫苗可有效预防病毒引起的人类各种传染性疾病。如：狂犬、流脑、乙肝、麻风腮、脊髓灰质炎、手足口等流行性传染病。病毒性疫苗生产的细胞基质主要为人胚肺二倍体细胞（以下简称“二倍体细胞”）、传代细胞和原代细胞三种。而细胞株作为培养基质，其质量的优劣，直接影响疫苗的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。人们在实践中迫切盼望能寻找到一种经过标化的安全的细胞基质来生产病毒性疫苗，人胚肺二倍体成纤维细胞株具有这种潜能。

人二倍体细胞是指分离正常人体组织细胞后，在体外培养的细胞。细胞株来源于正常人胚胎或者其他组织的细胞群体，其染色体数目与原供体细胞染色体数目相同，无异种移植致癌性，无外源因子污染，在正常情况下具有有限生命期，故属有限生命细胞株。如果组织材料取材于人胚肺，这种细胞通常叫人胚肺二倍体成纤维细胞株或人胚肺成纤维细胞株。

有代表性的人胚肺二倍体成纤维细胞株包括国外的MRC-5细胞株（ATCCCCL171），WI-38细胞株（ATCC CCL75），HEL299细胞株（ATCC CCL137），LBHEL（KCTC0127BP），IMR-90以及国内KMB-17，2BS等。这些细胞株的信息如下：

1）WI-38细胞株：由美国Wistar研究所建立的人二倍体细胞株。WI-38是1962年从Swedish医院人工流产的一个3月龄女性胎儿（家庭无肿瘤史）的肺组织建立的。1：2分种共传代48次(Hayflick.L.1965.EXP.Cell Res，37：614)。WI-38在世界各国广泛使用，已在许多国家应用于病毒性疫苗生产。WI-38是国际上第一个经过标化的安全的二倍体细胞株。

2）MRC-5细胞株：由英国国家医学研究院的Jacobs等于1966年从一个27岁精神异常，而其家庭遗传史正常的孕妇，人工流产14周胎儿的肺组织建立的细胞株，总寿命共48次群体分裂。MRC-5经反复检定证明其生物学性状达到了制备病毒性疫苗细胞株的国际标准（J.P.Jacobs etal,Nature1970(227):168-170）。

3）LBHEL（KCTC0127BP）细胞株：由韩国株式会社LG化学的金政民等从一个20周龄的雌性胚胎的肺组织建立的细胞株，其生长速度比MRC-5快2倍，相同单位表面积上的细胞产量比MRC-5多1.7倍，对水痘带状疱疹减毒易感性是MRC-5细胞的10倍（中国专利97190080.9），但水痘带状疱疹病毒在该细胞上扩增时，细胞病变快，病毒滴度低。且仅见该细胞对麻疹病毒，风疹病毒，甲型肝炎病毒及水痘带状疱疹病毒具有易感性。

4）KMB-17细胞株：由昆明医学生物研究所郭仁等建立，1974年建立了KMB-17人二倍体细胞株。细胞来源于一位20岁健康孕妇第二胎，4月龄的女性胎儿，表型正常。从冻存后细胞的生物学结果看，细胞分裂、传代寿命、染色体分析都未发现明显改变。KMB-17至少对100多种病毒敏感。已成功用于甲肝灭活疫苗的生产(郭仁等，中国医学科学院学报，1981，Vol3,226-229.)。

5）2BS细胞株：该细胞株由北京生物制品研究所建株，来源于3月龄女性胎儿，为第一胎，双亲无肿瘤史和慢性疾病，家族无先天疾病和遗传性缺陷。细胞培养性状，稳定性，活力都表现良好。该株细胞应用于小儿麻痹、乙脑、麻疹、痘苗、腮腺炎等疫苗的研究。已用于甲肝灭活疫苗的生产。(药品与生物制品（内部资料）1977，2(6):335-342)

手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）是一种常见及轻微、但传染度颇高的传染病，可由多种的肠道病毒引致，常见于夏天及初秋时分。此病多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中肠道病毒71型EV71和柯萨奇病毒(CoxAsckie virus)COX.A16是主要流行毒株，交替或共同出现引起HFMD感染，爆发大规模流行。

手足口病毒属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。肠道病毒无脂质胞膜，故乙醇对其无作用，在pH3~9的条件下稳定，不耐强碱，在4℃可存活一年以上，-20℃及外部环境下可长期存活，不耐高温，温度大于56℃失去活性，各种氧化剂、甲醛能使其灭活。

1958年首次分离出柯萨奇病毒，1959年提出以手足口病命名，1969年美国加利福尼亚首次分离出EV71，1972年被确认，此后两种病毒交替或共同出现引起HFMD感染。20世纪70年代HFMD主要爆发在美国，保加利亚、匈牙利、日本等，80年代HFMD相继爆发在东南亚及澳大利亚、加拿大等。90年代后期HFMD的发病转至亚太地区，新加坡、台湾、日本、马来西亚、中国相继爆发。1981年我国首次报道HFMD之后，HFMD病例报告不断，在经过低水平散发及局部爆发之后，从2008年起全国各省份HFMD发病呈上升趋势。2008年5月累计发病超过17万人，同月卫生部将HFMD列为丙类法定上报传染病。

2011年我国HFMD发病人数达162万，其中死亡人数509例，相比2010年发病率降低9.15%，死亡率降低43.95%。但2011年HFMD的报告发病病例数及发病引起的死亡数在我国丙类传染病中均居首位。HFMD已成为我国重要的公共卫生问题。

中国专利CN101780278A公开了以Vero细胞为细胞基质培养EV71及COX.A16病毒制备双价手足口病灭活疫苗的方法。中国专利CN101897963A公开了以Vero细胞或人二倍体细胞（MRC-5、WI-38）为细胞培养基质，培养人肠道病毒71型并制备手足口病病毒疫苗。

从已有技术来看，无论是国外建立的细胞株MRC-5，WI-38，还是国内建立的细胞株2BS、KMB-17，在病毒疫苗中已使用多年，安全性不容置疑。但缺点是产量低，细胞代数高，限制了病毒的产量提高和进一步使用。

同样地，目前使用的猴肾Vero细胞也是代数高，限制了病毒的生产，更重要的是，猴肾Vero残余异源蛋白对人体有潜在危害，不利于病毒疫苗产品的应用。在手足口病毒病毒完成扩增后，病毒的纯化，猴肾Vero残余异源蛋白去除，环节多，工艺繁杂，不利病毒疫苗产品的质量控制及成本控制。

发明内容：

本发明的一个目的是提供一种可作为生产用细胞基质对手足口病毒敏感的人胚肺二倍体成纤维细胞株，该细胞对手足口病主要流行株---病毒柯萨奇病毒A组16型COX.A16和肠道病毒71型EV71二株病毒都敏感，且病毒产量高，二价疫苗生产成本低。

本发明的另一个目的是提供一种制备二价手足口病毒灭活疫苗的方法。

本发明的第三个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备手足口病毒灭活疫苗中的应用。

本发明公开了一个新的人胚肺二倍体成纤维细胞株，该细胞株为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。

Walvax-2细胞株对手足口病的二株主要病毒源--柯萨奇病毒A组16型COX.A16和肠道病毒71型EV71病毒都敏感，且病毒产量高。将二株病毒分别接种Walvax-2细胞株，在35～37℃常规培养下，就能生产大量的病毒疫苗原液；病毒原液通过灭活，浓缩，去杂质，再二株病毒按比例混合，并加入佐剂，就形成二价手足口病毒灭活疫苗。

本发明还公开了使用新的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2制备手足口病毒灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC C201055的人胚肺二倍体成

纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种手足口病毒EV71和手足口病毒COX.A16至Walvax-2细胞，

并分别培养EV71和CA16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变时分别收获细胞病毒液；

D.用甲醛分别灭活病毒；

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX.A16灭活浓缩病毒液按1:0.5~1:1.5比例混合，并加氢氧化铝佐剂，分装，成为二价手足口病病毒灭活疫苗。

在本发明细胞培养过程中，细胞培养基利用含体积百分比为2％～10％新生牛血清的MEM营养液，培养Walvax-2细胞形成单层。细胞培养接种时以1:2～1:4的分种率接种细胞，细胞生长至对数生长期，覆盖85~95%培养容器的表面。

在本发明病毒扩增过程中，加入到Walvax-2细胞中的手足口病毒EV71和/或手足口病毒COX.A16感染复数为0.001～0.1MOI，无论是手足口病毒EV71还是手足口病毒COX.A16病毒都是分别感染Walvax-2细胞并分别在各自培养容器中完成扩增过程；病毒的维持液为无血清的MEM营养液，加量与培养细胞时使用完全培养基量相同。

在本发明中，被病毒感染的二倍体细胞置细胞培养箱在35-37℃，5%CO₂下培养，当细胞出现典型病变达到75%~95%时，分别收获细胞病毒液。

在本发明中对收获的细胞病毒液分别进行灭活，本发明采用甲醛灭活方式，甲醛加量是1:2000~1:6000，在40℃灭活72小时～120小时。灭活后的病毒在4℃条件下离心，8000～10000rpm，5~10min收集上清液；采用超滤膜超滤浓缩病毒液10倍，补加缓冲液超滤浓缩，重复2~5次；最后一次浓缩至原体积的1/50，收集浓缩液，并清洗滤膜，在Sepharose-4FF凝胶过滤柱进一步去除杂质。

在本发明中公开的手足口病毒疫苗是二价疫苗；将提纯后的手足口病毒EV71和COX.A16病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，每毫升疫苗加氢氧化铝佐剂1.0~1.2mg，最终形成每毫升疫苗含纯化的灭活EV71病毒5~80μg/ml，含纯化的灭活COX.A16病毒5~80μg/ml的二价手足口病毒灭活疫苗。

在本发明扩大化的细胞培养系统中采用10层细胞工厂，以1:2的分种率，将Walvax-2细胞接入10层细胞工厂中，加入含5%NBS的MEM营养液2L，培养至对数生长期且细胞覆盖85-95%的培养容器表面时，PBS清洗细胞面，更换无血清MEM培养基，采用直接接种法，以0.001~0.1感染剂量（MOI）分别接种手足口病毒EV71和/或手足口病毒COX.A16感染培养的Walvax-2细胞，并分别培养受病毒感染的Walvax-2细胞；当Walvax-2细胞出现的典型细胞病变达75-95%时，分别收集细胞病毒液；分别用甲醛灭活病毒、冷冻高速离心除去细胞碎片，并纯化病毒；将EV71和COX.A16病毒按1:0.5～1:1.5混和混合，每毫升加氢氧化铝佐剂1.2mg，每毫升疫苗含纯化的灭活EV71或COX.A16病毒5~80μg/ml；分装，无菌密封成二价手足口病毒灭活疫苗。

在本发明中，以MOI为0.001~0.1的感染剂量将手足口病毒EV71单独的接种到Walvax-2细胞基质，维持液为不含血清的MEM，在35~37℃常规培养下，培养3天。当Walvax-2细胞出现的典型细胞病变达75-95%时，分别收集细胞病毒液，此时EV71病毒滴度可达8.75~10.75lgCCID₅₀/ml。

在本发明中，以MOI为0.001~0.1的感染剂量将手足口病毒COX.A16单独的接种到Walvax-2细胞基质，维持液为不含血清的MEM，在35~37℃常规培养下，培养4天。当Walvax-2细胞出现的典型细胞病变达75~95%时，分别收集细胞病毒液，此时COX.A16病毒滴度可达8.25-10.5lgCCID₅₀/ml之间。

病毒分别经甲醛灭活后，在低温条件下高速离心，10000rpm，去除细胞碎片。超滤浓缩后，以凝胶过滤的方法进行病毒液的纯化。

测定纯化后的病毒原液中的抗原含量，调整抗原浓度，以合适的配比关系将EV71和COX.A16混合，最终形成每毫升疫苗含纯化的灭活EV71病毒5~80μg/ml，含纯化的灭活COX.A16病毒5~80μg/ml的二价手足口病毒灭活疫苗，加入铝佐剂制备成疫苗，每毫升疫苗加佐剂1.2mg。每只分装1毫升，无菌密封成二价手足口病毒灭活疫苗。

在本发明公开的优化使用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2制备手足口病毒病毒灭活疫苗的方法中，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC C201055的人胚肺二倍体成

纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种感染复数为0.01MOI手足口病毒EV71和手足口病毒COX.A16至Walvax-2细胞，并分别培养EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变达75～95%时分别收获细胞病毒液；

D.用1:4000甲醛在40℃，96小时分别灭活病毒；

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX.A16灭活浓缩病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，每毫升二价灭活疫苗加氢氧化铝佐剂1.2mg，成为二价手足口病病毒灭活疫苗。

本发明还公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株可在制备二价手足口病毒病毒灭活疫苗中应用。

在本发明中采用的病毒毒种中，二株手足口病病毒----肠道病毒71型EV71和柯萨奇病毒(CoxAsckie virus)COX.A16和参比细胞系MRC-5，WI-38均为普通微生物样品，其中手足口病毒EV71（CCTCC GDV117）和手足口病毒COX.A16（CCTCC GDV119）登载于中国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取；MRC-5（ATCC CCL171），WI-38（ATCCCCL75）登载于美国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。安全性评价中使用的对比细胞HeLa，MDCK细胞，Vero也是普通细胞，HeLa（ATCC CCL-2），MDCK（CCL-34），VERO（ATCCCCL-81）登载于美国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。

本发明公开的人胚肺二倍体成纤维细胞株与现有细胞相比，有下列优点：

1）采用Walvax-2细胞培养手足口病毒EV71或COX.A16制备疫苗，避免了非人源培养基质带来外源蛋白残留的影响，减少了去除原液中残余DNA及蛋白的纯化步骤，更降低纯化过程中的生产成本。

2）人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2对手足口病毒的二种主要病原体敏感，且产量高。其中，手足口病毒EV71在Walvax-2细胞上扩增的滴度分别比在MRC-5细胞，WI-38细胞上高6和6.25；手足口病毒COX.A16在Walvax-2细胞上扩增的滴度分别比在MRC-5细胞，WI-38细胞上高7和7.25；

3）人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2对手足口病毒的二种主要病原体病变速率提前，生产时间缩短。以病变50%为判断标准，其中，EV71在Walvax-2细胞病变速度分别比在MRC-5及WI-38细胞上提前4天和5天；COX.A16在Walvax-2细胞病变速率比在MRC-5细胞，WI-38细胞上提前5天或5天以上。

4）Walvax-2细胞株生长速度优于现有的MRC-5株及WI-38株，在生产过程中可减少培养时间，节省细胞培养时的成本支出。

本发明公开的生产手足口病毒灭活疫苗方法与现有技术相比，有下列优点：

1）采用细胞培养的方法，培养EV71和COX.A16病毒，两种病毒毒株均可在Walvax-2细胞上良好生长，并高效稳定的增殖，动物试验证明该方法制备成的疫苗具有良好的免疫原性，二种病毒在同一种细胞上扩增，有效的降低了培养过程中的外源因子污染和缩主细胞残留蛋白，保证了该疫苗的安全性。

2）采用无血清MEM营养液作为维持液，培养EV71和COX.A16病毒，避免了血清带入外源因子的影响，进一步保证了疫苗的安全性，并有效提高病毒滴度。

3）采用10层的细胞工厂，培养EV71和COX.A16病毒，增加了同一批号病毒液的收获量，与转瓶或方瓶的培养方式相比，产品的一致性提高。

4）二价手足口病毒联合疫苗，可预防由EV71或COX.A16分别引起的手足口疾病，保证了该疫苗对不同病原体的保护性。

附图说明

图1是Walvax-2细胞株形态图。

图2是Walvax-2细胞株三级种子库细胞的生长曲线图。

图3是Walvax-2细胞株染色体核型分析图

A表示第48代Walvax-2细胞染色体G显带

B表示第48代Walvax-2细胞染色体排列

图4是Walvax-2细胞株不同代次的生长情况图

图5是Walvax-2细胞20代在添加2%、5%、8%及10%不同血清含量的MEM培液中的生长情况图

图6是Walvax-2细胞株与MRC-5，WI-38细胞的生长曲线对比图。

图7是在5%和10%NBS浓度下的MEM培养基中培养Walvax-2细胞株与MRC-5，WI-38细胞后的细胞数量比较图。

图8是Walvax-2细胞株中手足口病毒EV71及CA16的滴度随MOI的变化图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1试剂和培养基的配制

1.1细胞基础培养液：1000ml含下列液体

1.2细胞完全培养液（也叫含10%血清的培养基）：1000ml含下列液体

各种血清含量的细胞培养液牛血清的体积和MEM体积变化，其它保持不变，如含5%NBS的培养基，1000ml含下列液体

1.3细胞冻存液：1000ml含下列液体

1.4细胞/病毒维持液：1000ml含下列液体

MEM                        970ml

7.5%NaHCO₃                 20ml

3%L-谷氨酰胺               10ml

1.5 0.01M PBS溶液：1000ml含下列液体

实施例2Walvax-2细胞株的制备

2.1实验材料的获得：在获得国家卫生管理部门和伦理委员会的批准后，对捐赠孕妇的夫妇年龄、职业及健康状况，胎儿父母系三代进行调查，选择无肿瘤疾病历史，无先天性异常和遗传缺陷家族史的胎儿。征得胎儿父母及其亲属同意后，签订《捐赠者同意书》。

2.2初代培养：胚胎水囊引产后及时送往实验室，无菌条件下取出肺组织，撕去肺组织表面的膜，剪切成1～2mm³的组织块，PBS清洗3～4次；将组织块移入三角瓶；加胰蛋白酶消化30min，加血清中和，1000rpm离心5min弃胰蛋白酶，用细胞完全培养基悬浮细胞，于37℃，5%CO2条件下培养。培养基成分：MEM+10%胎牛血清，继续培养5天。

2.3传代培养：弃除培养瓶内的培养液，PBS洗细胞面，用胰蛋白酶消化后加入完全培养液终止消化；以1:2或1：4的分种比例进行传代；待细胞长成致密单层后继续传代，直至生命线。

2.4细胞冻存：细胞生命线传代过程中，在第6代，第8代，第10代，第14代，第20代分别大量冻存细胞做种子细胞库或工作细胞库。其中第6代为原始细胞细胞库，第14代为主细胞库，第20代为工作细胞库.冻存细胞后进行复苏，检测其活性继续传代至生命线，传代58次。

2.5细胞传代消化：细胞培养3-4天后，PBS洗细胞面后胰蛋白酶消化5-10min，去胰蛋白酶，加入20～30ml培养液终止消化；分瓶继续在37℃，5%CO₂条件下培养。

2.6细胞特性研究：传代过程中，对细胞生物学特性进行研究。本发明从所建系且符合国家药典要求的细胞中筛选到一株人胚肺二倍体成纤维细胞株，命名为Walvax-2，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。Walvax-2细胞株对手足口病的二株主要病毒源--柯萨奇病毒A组16型COX.A16和肠道病毒71型EV71病毒都敏感，且病毒产量高。将二株病毒分别接种Walvax-2细胞株，在35-37℃常规培养下，就能生产大量的病毒疫苗原液；病毒原液通过灭活，浓缩，去杂质，再二株病毒按比例混合，并加入佐剂，就形成二价手足口病毒灭活疫苗。

实施例3：二价手足口病毒灭活疫苗的制备

3.1细胞培养瓶小样制备二价手足口病毒灭活疫苗：

A）复苏工作库Walvax-2细胞于1个T75细胞培养瓶，加入含有10%牛血清的细胞完全培养液，pH在6.8～7.4间，置37℃密闭培养。待细胞长成单层后，用PBS洗涤，胰酶消化，弃胰酶，加入上述营养液，以1:2分种率，每3天传代1次，获得4个T225瓶细胞至对数生长期。

B）去旧的培养液，加PBS洗细胞，按0.01MOI分别加入EV71或COX.A16病毒感染液，静止吸附1小时，加病毒维持液150ml覆盖细胞表面，分别培养受病毒感染细胞3～5天。

C）至Walvax-2细胞病变率在75-95%时收获。

D）加入1:4000的甲醛灭活，40℃灭活96小时。

E）分别收集灭活病毒液，4℃离心，10000rpm，5min,收集上清液，采用超滤膜超滤浓缩病毒液10倍，补加缓冲液超滤浓缩，重复3次。最后一次浓缩至原体积的1/50，收集浓缩液，并清洗滤膜。Sepharose-4FF凝胶过滤柱（GE XK26/100）纯化，上样量为10ml，流速为3ml/min。纯化后的样品通过47型MILLIPORE滤器，Pall的0.2um滤膜进行过滤除菌，收获过滤后溶液。

F）将过滤后获得的EV71及COX.A16病毒原液以1:1.25的配比方式进行混合，每毫升疫苗加氢氧化铝佐剂1.2mg，制成半成品，分装成1ml/支，即为二价手足口病毒灭活疫苗。

3.2 10层细胞工厂大量制备二价手足口病毒灭活疫苗

A.自液氮容器内取出Walvax-2细胞冻存管，于37℃水浴中复苏，加入含有10%NBS的细胞完全培养液，pH在6.8～7.4间，置37℃培养。待细胞长成单层后，用PBS洗涤，胰酶消化，弃胰酶，加入含有5%NBS的细胞完全培养液，以1:2分种率，每4天传代1次，直至获得批量生产需要的足够细胞。将上述细胞转入由corning/nunc公司生产的10层细胞工厂中培养，加入含5%NBS的细胞完全培养液2L/10层细胞工厂，培养至细胞覆盖容器表面，PBS清洗细胞表面，更换维持液，维持液中不含NBS，pH在7.0～7.6。

B.按0.01MOI分别加入EV71和COX.A16病毒，并分别静止吸附培养3～5天

C.至Walvax-2细胞病变率在75%以上时收获病毒。

D.加入1:6000的甲醛灭活，40℃灭活120小时。灭活病毒在4℃条件下离心，10000rpm，10min,收集上清液。

E.采用超滤膜超滤浓缩病毒液10倍，补加缓冲液超滤浓缩，重复5次。最后一次浓缩至原体积的1/50，收集浓缩液，并清洗滤膜。Sepharose-4FF凝胶过滤柱（GE XK50/100）纯化。纯化后采用0.2μm滤膜过滤除菌，收集过滤后溶液。

F.将过滤后获得的EV71及COX.A16病毒原液以1:1.25之间的配比方式进行混合，每毫升疫苗加氢氧化铝佐剂1.2mg。制成半成品，分装成1ml/支，即为二价手足口病毒灭活疫苗。

实施例4：Walvax-2细胞株的生物学特性

4.1细胞形态

复苏第20代Walvax-2细胞，37℃密闭培养，传代至40代，薄单层时于倒置显微镜下拍摄。结果见图1。Walvax-2细胞株40代时细胞形态饱满，长梭状，符合人胚肺二倍体细胞形态，漩涡状贴壁生长，细胞增殖旺盛。

4.2细胞生长曲线

分别从原始种子、主种子和工作种子三级细胞库复苏Walvax-2细胞株，细胞活率都在95%以上，进行生命线传代，每次传代对细胞进行计数，结果见图2。Walvax-2细胞株三级种子库间细胞生长活率无明显差异。说明细胞生物学特性稳定。

4.3细胞染色体核型分析

复苏Walvax-2细胞株三级种子库，传代过程中，每隔10代对细胞进行染色体分析，各代次待检细胞在油镜（1000×）下观察1000个中期细胞，详细记录所观察染色体数目和结构形态，其中工作种子库传至48代染色体检查结果见表1，第48代细胞染色体G显带见图3A，染色体排列见图3B。本发明的Walvax-2细胞株染色体检测中二倍体占细胞总数的86%以上，说明所建人胚肺成纤维细胞株符合二倍体细胞标准，细胞遗传性状稳定。如图3所示，48代Walvax-2细胞株染色体组型结果为46／XX,即符合正常人体细胞染色体组型，未见异常。检测结果均符合《中华人民共和国药典三部》2010年版要求。

表1细胞染色体检查结果

4.4无菌及支原体检查

复苏Walvax-2细胞株三级种子库，传代过程中，每隔10代对细胞进行无菌及支原体检查。检查方法按《中华人民共和国药典三部》2010年版规定的检查项目进行。

4.4.1无菌检查：Walvax-2细胞样品分别接种硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、选择性培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基，6种不同营养成分的培养基，同时设定阴性对照与阳性对照，分别在有氧和厌氧条件，25℃和37℃培养温度下培养检测，实验结果均为阴性，表示无微生物污染。

4.4.2支原体检查：Walvax-2细胞传代过程中每10代进行支原体检查，采用培养法和DNA荧光染色技术检查，同时设定阴性对照与阳性对照。培养法结果显示培养基均澄清，无支原体生长；DNA荧光染色技术检查Walvax-2细胞，发现整个视野内可见的细胞表面均为光滑样，细胞核呈圆状或椭圆状，细胞核中的DNA发出蓝色荧光，且细胞周围无荧光着色颗粒。证明本细胞没有支原体污染。两项结果均为阴性。

4.5内、外源因子检测

复苏Walvax-2细胞株三级种子库，传代过程中，每隔10代对细胞进行外源因子检查，检查方法按《中华人民共和国药典三部》2010年版规定的检查项目进行。采用细胞形态观察及血吸附试验，不同细胞传代培养法检测病毒因子，接种动物和鸡胚法检测病毒因子，逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测，特殊外源病毒因子检测5种方法。

4.5.1细胞形态观察：对Walvax-2进行传代，共传出10瓶T25细胞，同时设待检Walvax-2细胞接种手足口病毒EV71为阳性对照。于37℃条件下密闭培养，细胞长成单层后更换维持液，每5天更换1次细胞维持液，持续培养14天，Walvax-2待检细胞各代次均保持正常形态，未观察到脱落、病变等异常情况。

4.5.2血吸附试验：取4.5.1中培养到期细胞4瓶，同时设MDCK细胞接种流感病毒为阳性对照，加入豚鼠红细胞和鸡红细胞混合液，置2～8℃作用30min，然后置20～25℃作用30min，显微镜下观察，红细胞悬浮于成纤维细胞上方，未出现凝集现象，Walvax-2细胞各代次检测结果均为阴性。

4.5.3不同细胞传代培养法检测病毒因子：待检活细胞以10⁶/ml分别接种单层的Vero细胞、MRC-5细胞及与待检细胞不同代次的Walvax-2细胞，每种细胞接种2个T75瓶，每瓶接种15ml，接种量约占维持液的1/3，培养7天后盲传1代，按上述4.5.1及4.5.2中方法观察细胞形态及进行血吸附试验，结果细胞形态正常，血吸附试验结果为阴性。

4.5.4接种动物和鸡胚法检测病毒因子：Walvax-2待检各代次细胞按《中华人民共和国药典三部》2010年版要求接种乳鼠、成鼠、5日龄鸡胚、10日龄鸡胚、豚鼠及家兔。并分别饲养5天、21天及42天后观察，各代次细胞接种动物均未发生死亡，5日龄鸡胚存活，10日龄鸡胚其血凝试验为阴性，判定本发明的Walvax-2各代次细胞检测结果均合格。

4.5.5逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测：待检细胞采用PERT法、感染性试验及透射电镜检查3种方法检测，同时以MRC-5为阴性对照。经检查，Walvax-2各代次细胞的逆转录酶活性及感染性试验检测结果均为阴性，电镜下观察均未发现类似病毒颗粒。

4.5.6特殊外源病毒因子检测：采用ELISA方法进行，按乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒、人丙肝抗原酶联免疫法分析试剂盒、人EB病毒早期抗原酶联免疫分析试剂盒、人巨细胞病毒抗原酶联免疫分析试剂盒、HIV抗原抗体诊断试剂盒的使用说明，将Walvax-2各代次的待检细胞上清液加入试剂盒，加终止液后，用波长450nm的酶标仪读数，结果显示本发明的Walvax-2各代次细胞检测均为阴性。

4.6致肿瘤性

复苏Walvax-2细胞株三级种子库，传代过程中，每隔10代对细胞进行致肿瘤性检查。待检细胞用胰酶消化后，用无血清培养基制备成浓度为5×10⁷/ml细胞待检悬液。裸鼠皮下接种0.2ml/只。阳性对照Hela细胞皮下接种0.2ml，细胞浓度为10⁶/0.2ml，阴性对照MRC-5皮下接种0.2ml，细胞浓度为10⁷/0.2ml。饲养并观察，阴性对照未发生异常，阳性对照出现肿瘤结节，本发明的Walvax-2细胞株接种裸鼠后，21天内均未发现结瘤，半数处死解剖后未发现异常，另半数观察84天，未发现结瘤，处死解剖后未发现异常。21天和84天取小鼠的接种部位、淋巴结、心、脾肺及脑做病理切片检查，异型增生细胞。说明本发明的Walvax-2细胞株无潜在的致瘤性。

4.7同功酶检测

复苏Walvax-2细胞20代，细胞传代至48代进行同功酶检测，方法依据INNOVATIVE CHEMISTRY公司的The Authentikit^TM System的方法对细胞株的乳酸脱氢酶（LD）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）两种酶进行检测，检测结果见表2。

如表2所示，本发明的Walvax-2细胞株的同功酶图谱均与ATCC保藏的人二倍体细胞株（MRC-5）及人宫颈癌细胞系（HeLa）完全相同，而与小鼠成纤维细胞系（L929）的同功酶图谱有显著差别。因此，Walvax-2细胞株与MRC-5及HeLa细胞系同种，属于人源细胞株，且无交叉污染。

表2Walvax-2细胞株同功酶分析结果

注：表格中“－”表示同功酶图谱与对照细胞有较大差别；

“＋”表示两种细胞同功酶图谱相同。

4.8Walvax-2对手足口病病毒的敏感性

复苏Walvax-2细胞20代，37℃密闭培养至薄单层，以1:2的分种率进行传代，至细胞26代，12个T25培养瓶,分别接种手足口EV71及COX.A16病毒，每个病毒接种4个T25瓶细胞，4个T25瓶细胞为阴性对照，接毒后细胞于35℃继续培养，同时在MRC-5细胞上每个病毒以相同的MOI接种4个T25瓶细胞作对比试验,结果见表3。

如表3所示，本发明的Walvax-2细胞对手足口EV71及COX.A16病毒有良好的敏感性，2种病毒在该细胞上的增值速度及病毒滴度均明显高于MRC-5细胞。

表35种病毒在Walvax-2及MRC-5细胞上的敏感性

实验例5Walvax-2细胞株的培养

5.1Walvax-2细胞株不同代次细胞生长情况比较

在T75培养瓶中培养Walvax-2细胞，以1:2的分种率传代。在10代、20代、30代、40代、50代时，以500万/T75瓶的细胞量接种，37℃密闭培养。接种后的Walvax-2细胞分别进行1~5天的细胞观察及细胞计数，细胞计数结果见图4

如图4所示，细胞在10代、20代、30代时均保持旺盛的生长活力，细胞增殖快，40代时，细胞增殖速度变慢，高峰期时细胞量相较前3个代次减少。50代时细胞的生长速度明显慢于前30代，细胞高峰期时细胞量明显少于其他4个代次，但仍良好生长至薄单层。

5.2Walvax-2细胞株在不同血清含量的培养液中生长情况比较

培养Walvax-2细胞20代，以500万/T75瓶的细胞量分别接种含有2%NBS，5%NBS，8%NBS，10%NBS的培养液中，37℃密闭培养。对接种后的Walvax-2细胞20代分别进行1~5天的细胞观察及细胞计数，细胞计数结果见图5。

如图5所示，细胞在5%、8%或10%NBS含量的培养液中均保持旺盛的活力，细胞增殖快，两者无明显区别。细胞在2%NBS含量的培养液中，生长速度减慢，且高峰期的细胞量少于在含有5%、8%或10%NBS培养液中的Walvax-2细胞20代细胞量。

实施例6：Walvax-2细胞株与MRC-5，WI-38的比较

6.1细胞生长速度比较

测定30代Walvax-2细胞株的生长曲线，和30代MRC-5(ATCC CCL171)和WI-38(ATCC CCL75)细胞株生长曲线做比较。

6.1.1在T75培养瓶中培养三种细胞株已形成致密单层，PBS洗细胞面1～3次，用胰蛋白酶消化后加入培养液终止消化，收集细胞液，1000rpm离心3分钟。

6.1.2将离心细胞的沉淀悬浮于培养基中，以5×10⁵细胞/瓶的细胞量加入T25培养瓶中，37℃密闭培养。

6.1.3每24小时，按步骤1收集细胞，用Cedex XS细胞计数仪对细胞进行计数，见图6。如图6所示，本发明的Walvax-2细胞对数期早于与MRC-5和WI-38细胞，且细胞数比MRC-5和WI-38细胞大约多2倍。

6.2不同血清浓度下的生长状况比较

在T75培养瓶中培养Walvax-2、MRC-5、WI-38细胞以形成单层，消化细胞制备细胞悬液，并进行细胞计数。以5×10⁵个细胞量接入每个T25培养瓶，在37℃条件下培养细胞。每24小时收集细胞进行计数，细胞计数采用Cedex XS细胞计数仪进行测定。结果见图7。图7记载了在含有5%或10%的NBS的MEM培养基中细胞培养5天后计数情况，Walvax-2细胞株、MRC-5细胞株、WI-38细胞株的细胞数对比。如图7所示，培养在含有5%NBS的MEM培养基中Walvax-2细胞数接近于在含有10%NBS的培养基中得到的细胞数。而在含有5%NBS的MEM中MRC-5与WI-38均生长缓慢，这表明本发明的Walvax-2细胞株对血清要求低，更具有经济优势。

6.3手足口病毒在细胞中的增殖研究比较

复苏Walvax-2、MRC-5、WI-38三种人胚肺细胞，37℃,细胞生长至覆盖95%培养容器的表面，以1:2的分种率传代细胞至单层。手足口病毒EV71以感染剂量（MOI）为0.01接种到上述细胞中，更换无血清维持液，培养7天，观察记录，结果见表4。手足口病毒COX.A16以感染剂量（MOI）为0.01接种到上述细胞中，更换无血清维持液，培养7天，观察记录；同时设阴性对照。分别收获Walvax-2细胞、MRC-5细胞及WI-38细胞中培养的手足口病毒液，测定收获病毒液的滴度，结果见表5。

如表4、表5所示本发明中Walvax-2细胞株中培养手足口病毒EV71及CA16毒株的活性明显高于其他常规细胞株中的活性。

表4不同人胚肺二倍体细胞接种手足口病毒后病变速率

表5手足口病毒在不同人胚肺二倍体细胞上增殖的CCID₅₀检测

实施例7感染复数MOI的影响

复苏培养并制备Walvax-2细胞，培养至单层细胞。分别以0.001、0.005、0.01、0.05、0.1的MOI用EV71及CA16病毒接种，收获病毒液后测定其滴度，结果见图8。图8记载了Walvax-2细胞株中手足口病毒EV71及CA16的滴度随MOI的变化，当MOI为0.01时，病毒的产量最高。

实施例8：病毒纯化

取已灭活的EV71或COX.A16病毒液，采用100KDPall膜超滤浓缩至原体积的1/10，然后再采用0.01M的PBS恢复到原体积，继续采用0.01M的PBS超滤浓缩至原体积的1/10，如此操作，反复5次，最后一次浓缩到原体积的1/50，收集浓缩液。0.8μm滤芯澄清过滤（142型PALL弹筒滤器），收集过滤后浓缩液。

Sepharose4Fast Flow琼脂糖凝胶柱（GE XK50/100），用0.2M的NaCl平衡，流速为13ml/min，平衡5～10个柱体积，测定出液端pH，pH在7.0~7.4之间，即可上样。

将上述浓缩液加入已平衡好的Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱上，上样量为90ml，用0.2MNaCl流洗，流速约8ml/min，在线检测波长为280nm的紫外吸光值变化，分段收集峰的流出液。经ELISA试验检测，第一峰流出液的前1/4~3/4部分为灭活的病毒颗粒，第二峰无病毒颗粒。收集病毒颗粒洗脱液，无菌条件下0.2μm滤芯除菌过滤（142型Pall弹筒滤器）。收集过滤后病毒液即为精制灭活EV71或COX.A16病毒原液，4℃存放。无菌检测应为阴性，采用Lowry法测定蛋白含量在200μg/ml以上。采用HPLC液相色谱柱测定病毒纯度应不低于95%。

实施例9：不同浓度Al(OH)₃佐剂吸附EV71及COX.A16灭活病毒的研究

将灭活的EV71和COX.A16病毒以不同终浓度的Al(OH)₃佐剂吸附，Al(OH)₃佐剂的终浓度分别为0.5mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml，1.2mg/ml，1.5mg/ml，EV71及COX.A16的蛋白含量终浓度为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml。

方法一：将稀释后的灭活EV71和COX.A16病毒混合，在混合病毒液中加入Al(OH)₃佐剂吸附，制成双价手足口病毒灭活疫苗。

方法二：将稀释后的灭活EV71和COX.A16分别用Al(OH)₃佐剂吸附，混合两种吸附后溶液，制成双价手足口病毒灭活疫苗。

方法三：将稀释后的灭活EV71先用Al(OH)₃佐剂吸附，再补加稀释后的COX.A16灭活病毒，制成双价手足口病毒灭活疫苗。

方法四：将稀释后的灭活COX.A16先用Al(OH)₃佐剂吸附，再补加稀释后的EV71灭活病毒，制成双价手足口病毒灭活疫苗。

以上述四种方法的任意一种制备双价手足口病毒灭活疫苗，所得疫苗采用ELASA方法检测不同浓度的Al(OH)₃佐剂吸附制备的双价手足口病毒灭活疫苗的吸附完全性。采用腹腔免疫BALA／c小鼠法测定不同吸附方法制备的双价手足口病毒灭活疫苗效力。0、7、21天免疫小鼠，腹腔注射，0.5ml/只。最后一次免疫4周后处死小鼠，测定血清中的中和抗体效价滴度。结果见表6～表10。如表6～表10所示，Al(OH)₃佐剂浓度在1.0mg/ml时吸附效果均大于98%，浓度在1.2mg/ml时吸附效果均大于99%。吸附抗原含量在20μg/ml时中和抗体滴度较高，在此抗原含量下Al(OH)₃佐剂浓度在1.2mg/m时免疫小鼠产生的中和抗体滴度大于Al(OH)₃佐剂浓度在1.0mg/ml时产生的中和抗体滴度，抗原含量大于20μg/ml时中和抗体滴度无显著性差异。

表6 5μg/ml的EV71和COX.A16灭活蛋白Al(OH)₃佐剂吸附结果表

表7 10μg/ml的EV71和COX.A16灭活蛋白Al(OH)₃佐剂吸附结果表

表8 20μg/ml的EV71和COX.A16灭活蛋白Al(OH)₃佐剂吸附结果表

表9 40μg/ml的EV71和COX.A16灭活蛋白Al(OH)₃佐剂吸附结果表

表10 80μg/ml的EV71和COX.A16灭活蛋白Al(OH)₃佐剂吸附结果表

实施例10：配比制备二价手足口病毒疫苗

纯化后的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml或250μg/ml，1.2mg/mlAl(OH)₃佐剂分别吸附不同蛋白浓度的病毒，制备不同浓度配比的二价手足口病毒疫苗半成品，吸附制备方法参照实施例9。

10.1双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:1，以下为配制10L疫苗的物质组成（以体积百分比计）：

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原5μg，COX.A16病毒蛋白抗原5μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

10.2双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:0.5，以下为配制10L疫苗的物质组成（以体积百分比计）：

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg，COX.A16病毒蛋白抗原10μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

10.3双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:1，以下为配制10L疫苗的实例：（以体积百分比计）

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg，COX.A16病毒蛋白抗原20μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

10.4双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:1.25，以下为配制10L疫苗的实例：（以体积百分比计）

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg，COX.A16病毒蛋白抗原25μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

10.5双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:1.5，以下为配制10L疫苗的实例：（以体积百分比计）

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg，COX.A16病毒蛋白抗原30μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

10.6双价灭活手足口病毒疫苗的配制

将已经纯化的EV71或COX.A16病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到250μg/ml，EV71：COX.A16配比为1:1，以下为配制10L疫苗的实例：（以体积百分比计）

每毫升灭活双价疫苗中含EV71病毒蛋白抗原80μg，COX.A16病毒蛋白抗原80μg，氢氧化铝佐剂1.2mg。

上述6种不同配比的双价手足口病毒灭活疫苗，分别接种4周龄的SPF级的BALA／c小鼠，随机分为7组(1、2、3、4、5、6、7组)，每组8只。免疫程序为0、7和21天，腹腔注射，0.5ml/只。1组接种的EV71蛋白含量为5μg/ml配比为1:1；2组接种的EV71蛋白含量为20μg/ml配比为1:0.5；3组接种的EV71蛋白含量为20μg/ml；配比为1:1，4组接种的EV71蛋白含量为20μg/ml，配比为1:1.25；5组接种的EV71蛋白含量为20μg/ml，配比为1:1.5；6组接种的EV71蛋白含量为80μg/ml，配比为1:1；7组为阴性对照。最后一次免疫4周后处死小鼠，分离血清，ELISA法测定血清中和抗体。

表11描述了7组小鼠血清中和抗体的效价。如表10所述，阴性对照7组未检测出中和抗体，1、2、3中COX.A16的中和抗体效价较低，4、5、6组中和抗体滴度无显著性差异。

表117组小鼠血清中和抗体效价

实施例11：不同浓度灭活EV71或COX.A.16病毒的免疫原性

购买4～6周龄SPF级的BALA／c小鼠132只，随机分为12组，1～10组又分A、B亚组，每组12只，每亚组6只，11及12组每组共6只。用Al(OH)₃佐剂(12mg/ml)或PBS分别稀释灭活EV71或COX.A.16病毒原液，使得每毫升含灭活EV71或COX.A16的病毒量为5、10、20、40、80μg。1～10组BALA／c小鼠分别免疫不同含量的稀释后EV71或COX.A16病毒，A亚组免疫Al(OH)₃佐剂稀释的病毒液，B亚组免疫PBS稀释的病毒液，11组为阴性对照免疫不含抗原的Al(OH)₃佐剂溶液(1.2mg/ml)，第12组为阴性对照免疫PBS。0、7、21天免疫小鼠，腹腔注射，0.5ml/只。最后一次免疫4周后处死小鼠，分离血清，储存于-20℃下备用。

待测血清56℃灭活30分种。取96孔细胞培养板，第二列至第10例每孔加入50μlMEM培养液，第一列以1:10的比例加入血清样本与MEM培养液共100μl，第1列孔向第2列孔移50μl液体，混合均匀，第2例孔向第3列移50μl液体，以此类推，2倍系列稀释，取后一个排吸出50μl液体丢弃。每个样本血清按上述方法在96孔板中各稀释4排，分别加入与免疫抗原对应的EV71或COX.A16病毒50μl（100CCID₅₀）。37℃条件下封闭1h后加入RD细胞，100μl/孔，35℃，5%CO2，培养7天观察结果，同时进行阴阳性血清对照、病毒回归、血清毒性对照及正常细胞对照，当病毒回归与对照试验全部成立时，计算样本血清中和抗体效价。

结果如表12所示，Al(OH)3佐剂吸附的EV71或COX.A16抗原免疫小鼠可显著提高小鼠血清中的中和抗体效价。其中5、10μg/ml产生的血清抗体效价要低于20、40、80μg/ml产生的血清抗体效价。20、40、80μg/ml产生的血清抗体效价检测结果无显著性差异。

表12EV71或COX.A16抗原免疫小鼠后的中和抗体效价

Claims (14)

1.一株人胚肺二倍体成纤维细胞株，其特征在于,该细胞株为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055。

2.一种生产二价手足口病毒灭活疫苗的制备方法，该方法包括如下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC  C201055的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2细胞，并分别培养EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变时分别收获细胞病毒液；

D.用甲醛分别灭活病毒；

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX. A16灭活浓缩病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，并加氢氧化铝佐剂，分装，成为二价手足口病毒灭活疫苗。

3.根据权利要求2中所述方法，其中利用含体积百分比为2％～10％新生牛血清的MEM营养液在步骤A中培养Walvax-2细胞形成单层。

4.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤A中以1:2～1:4的分种率接种细胞，细胞生长至对数生长期，覆盖85～95%培养容器的表面。

5.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤B中加入到Walvax-2细胞中的手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16感染复数为0.001～0.1 MOI。

6.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤B中培养手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16的维持液为无血清的MEM营养液。

7.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤C中细胞出现典型病变达到75%-95%时，收获细胞病毒液。

8.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤D中加入1:2000～1:6000的甲醛灭活，40℃灭活72小时～120小时。

9.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤E中灭活后的病毒在4℃条件下离心，8000～10000rpm，5～10min 收集上清液；采用超滤膜超滤浓缩病毒液10倍，补加缓冲液超滤浓缩，重复2～5次；最后一次浓缩至原体积的1/50，收集浓缩液，并清洗滤膜，在Sepharose-4FF凝胶过滤柱进一步去除杂质。

10.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗加氢氧化铝佐剂1.0～1.2mg。

11.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗含纯化的灭活EV71病毒5～80μg。

12.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗含纯化的灭活COX. A16病毒5～80μg。

13.根据权利要求2中所述方法，该方法包括如下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC  C201055的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种感染复数为0.01 MOI手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2细胞，并分别培养EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变达75～95%时分别收获细胞病毒液；

D.用1:4 000甲醛在40℃，96小时分别灭活病毒； 

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX. A16灭活浓缩病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，每毫升二价灭活疫苗加氢氧化铝佐剂1.2mg，分装，成为二价手足口病病毒灭活疫苗。

14.权利要求1中所述Walvax-2细胞株在制备二价手足口病毒灭活疫苗中的应用。

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