CN103013933B - 人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，该方法包括以下步骤，即浓缩病毒液、添加灭活剂、病毒灭活液的转移、水解去除灭活剂。本发明的灭活方法对人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活效果好，加入灭活剂后10小时即可完全灭活，且对狂犬病病毒的抗原含量没有负面影响。本发明提供的病毒液灭活方法操作步骤简单、灭活时间短、成本低、无污染，适宜在疫苗制备领域大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，属于生物制品制备技术领域。
背景技术
狂犬病是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病死亡率为100%。卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬病的死亡率第一，死亡数第三，狂犬病已成为我国最严重的公共卫生问题之一。
为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗，主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Vero传代细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白，外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素。人二倍体细胞狂犬病疫苗目前只在欧洲有上市，如美国Wyeth厂，法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，通过几十年的市场销售，已证实具有良好的免疫原性和安全性，这得益于生产工艺的稳定。
国内目前狂犬病疫苗主要为灭活疫苗，灭活疫苗已失去对机体的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激机体产生相应的免疫力，抵抗野毒株的感染，灭活疫苗免疫效果良好。灭活剂主要为福尔马林和β-丙内酯，但是福尔马林对狂犬病毒有持续的灭活作用，导致疫苗效力不断下降，而β-丙内酯灭活的疫苗经37℃作用后能完全水解，所以保持交苗效力的相对称定，国内目前狂犬病毒疫苗灭活工艺，采用超滤浓缩后加入β-丙内酯4℃灭活24h后水解灭活剂，工艺较粗略，对灭活过程较少监控，只在灭活完成后进行灭活效果验证，存在灭活过程的 不确定性，给大规模化的生产带来未知性，也对终产品的放行具有潜在危险因素。本方法不止在灭活前对技术参数确认，并且在灭活过程中进行灭活效果监控，灭活后进行灭活效果验证试验，通过在灭活步骤增加过滤及转移，以及对灭活条件参数的确定，达到最终生产出的灭活疫苗安全性。
发明内容
本发明目的是提供一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法。
本发明提供的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，包括以下步骤：
（1）浓缩人二倍体狂犬病疫苗病毒液，浓缩倍数为10～20倍，获得病毒浓缩液；
（2）添加灭活剂β-丙内酯，搅拌；
（3）灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第1次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第1次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中；
（4）水解去除灭活剂。
其中，步骤（1）浓缩病毒液的方法是将人二倍体狂犬病疫苗病毒液经3～6μm的过滤器和0.8μm的过滤器过滤，再进行超滤浓缩.
所述的超滤浓缩是采用10KB的超滤膜包进行超滤。
超滤浓缩前，用不含人血白蛋白的冲洗液平衡超滤膜包，膜包平衡后的回流液的pH值为6.0～8.0。
所述的冲洗液为BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠。
进一步，本发明灭活方法中，步骤（1）还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3～6μm的过滤器和0.45μm的过滤器过滤。
本发明的狂犬病病毒液浓缩液存放于2～8℃不超过30天。
本发明实施例中所用的人二倍体狂犬病疫苗病毒液是在人用二倍 体细胞上接种狂犬病病毒株得到的狂犬病病毒收获液。所述的人用二倍体细胞可以为KMB-17、WI-38、MRC-5、2BS中的一种。优选地，本发明所述的狂犬病病毒为狂犬病病毒固定毒PM-1503-3M（简称PM株）。在本发明的实施例中，所用的人用二倍体细胞为MRC-5。
进一步地，步骤（1）获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40～60mg/ml，浓缩液的pH值为7.0～9.0，10～15℃下平衡。
更进一步地，步骤（1）获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为45～55mg/ml，浓缩液的pH值为7.5～8.5。
本发明方法中，步骤（2）添加添加灭活剂β-丙内酯的方法是：先将β-丙内酯用灭菌水1：40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中。
其中，步骤（2）搅拌条件为10～15℃下，155～180r/min。
其中，步骤（3）中在灭活剂添加后的第50～70min时，进行第1次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌，待添加灭活剂后的第600min～700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第1400～1500min。
进一步地，步骤（3）的操作在10-15℃条件下进行。
本发明灭活方法中，将步骤（3）获得的灭活液于37℃进行水解140～160min。
本发明的灭活方法对狂犬病毒液的灭活效果好，加入灭活剂后10小时即可完全灭活，且对狂犬病病毒的抗原含量没有负面影响。本发明提供的病毒液灭活方法步骤简单、灭活时间短、灭活效果良好、成本低、无污染，适宜在疫苗制备领域大规模推广应用。
说明书附图
图1为β-丙内酯灭活病毒灭活效果曲线图。
图2为β-丙内酯水解曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中使用的狂犬病病毒为固定毒PM-1503-3M（简称PM株），人二倍体细胞为MRC-5，均购自法国Sanofi Pasteur公司。人二倍体狂犬病疫苗病毒液来自北京民海生物科技有限公司。
实施例1 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（1）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为6.0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为14.6，浓缩后的单次浓缩液先经3μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后存放于2℃28天。根据收获的次数，将单次病毒收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至45mg/ml，测得浓缩液的pH值为7.50，再将温度平衡至12℃过夜，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，12℃下持续搅拌，转速为155r/min，在加入β-丙内酯后第58min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（155r/min）灭活，在加入β-丙内酯后第660min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1420min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为12℃。将容器转移水浴锅中，37℃水解150min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例1。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，见表1。
表1 β-丙内酯水解情况分析
通过检测结果分析，β-丙内酯在水解150分钟时其浓度由未水解时的299.4ppm降至34.4ppm，低于该方法定量限以下，说明β-丙内酯在37℃水解150分钟可完全达到水解效果。
实施例2 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（2）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经4.5μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为7.0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为18.8倍，浓缩后的单次浓缩液先经4.5μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后存放于4℃20天。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8.43，再将温度平衡至11℃。将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，11℃下，持续搅拌，转速为160r/min，在加入β-丙内酯后60min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（160r/min）灭活，在680min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1440min（即加入灭活剂后第24小时）时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为11～12℃之间。将容器转移水浴锅中，37℃水解144min，水解后的灭活液称为原液。命名为实 例2。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，其水解情况同实施例1类似，β-丙内酯在水解144分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β-丙内酯在37℃水解144分钟可完全达到水解效果。
实施例3 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（3）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经6μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为8.0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为16.7倍，浓缩后的单次浓缩液先经6μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后置于6℃环境下保存30天。根据收获的次数，将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至48mg/ml，测得浓缩液的pH值为8.30，再将温度平衡至11.5℃，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，在11～12℃条件下持续搅拌，转速为170r/min，在加入β-丙内酯后62min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（170r/min）灭活，在加入β-丙内酯后第700min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1460min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为11～12℃之间。将容器转移水浴锅中，37℃水解156min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例3。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，其水解情况同实施例1类似，β-丙内酯在水解156分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β-丙内酯在37℃水解156分钟可完全达到水解效果。
实施例4 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（4）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为7.5，符合要求后进行浓缩浓缩后的单次浓缩液先经3μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后存放于8℃3天。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为16.8。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至60mg/ml，测得浓缩液的pH值为7.90，再将温度平衡至12.5℃过夜，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，保持温度为12～13℃之间，持续搅拌165r/min，在加入β-丙内酯后60min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（165r/min）灭活，在加入β-丙内酯后620min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1400min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度在12～13℃之间。将容器转移水浴锅中，37℃水解140min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例4。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，其水解情况同实施例1类似，β-丙内酯在水解140分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β-丙内酯在37℃水解140分钟可完全达到水解效果。
实施例5 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（5）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液， 含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为7.8，符合要求后进行浓缩，浓缩后的单次浓缩液先经3μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后存放于2℃。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为13.2。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8.00，再将温度平衡至12℃过夜，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，在12℃下持续搅拌170r/min，在加入β-丙内酯后50min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（160r/min）灭活，在加入β-丙内酯后690min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1430min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为12℃。将容器转移水浴锅中，37℃水解148min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例5。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，其水解情况同实施例1类似，β-丙内酯在水解148分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β-丙内酯在37℃水解148分钟可完全达到水解效果。
实施例6 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法（6）
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经6μm滤器过滤再经0.8μm滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤（10KB），超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为7.6，符合要求后进行浓缩，浓缩后的单次浓缩液先经6μm滤器过滤，再经0.45μm滤器过滤后存放于4℃ 10天。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为17.1。将单次收获液浓缩后合并，调 整人血白蛋白的浓度至40mg/ml,，测得浓缩液的pH值为9.0，再将温度平衡至10℃，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1：40倍稀释，再按照1：100的体积比滴加到浓缩合并液中，10～12℃温度范围内，持续搅拌，转速为180r/min，在加入β-丙内酯后70min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌（165r/min）灭活，在加入β-丙内酯后670min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1500min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为10～12℃温度之间。将容器转移水浴锅中，37℃水解160min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例6。
通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况，其水解情况同实施例1类似，β-丙内酯在水解160分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β-丙内酯在37℃水解160分钟可完全达到水解效果。
实施例7 灭活效果的验证（动物试验）
按实施例1～6的方法，分别于灭活剂加入后第1、3、5、7、10、12、14小时和原液取灭活病毒悬液各5ml，在20分钟内进行脑腔注射20只小鼠，每只0.03ml，小鼠为SPF级昆明小鼠，12～15g，雄性，注射后每日观察，连续观察22天，记录小鼠是否有体重减轻或麻痹、瘫痪等狂犬病病症。试验结束后计算小鼠体重平均增加情况.，并计算动物死亡率。
表2 β-丙内酯灭活狂犬病疫苗病毒液接种小鼠死亡率情况
表3 β-丙内酯灭活狂犬病疫苗病毒液接种小鼠脑腔体重观察
实例1在1小时灭活病毒悬液注射脑腔小鼠全部死亡，3小时组80%小鼠死亡，5小时20只小鼠全部存活；实例4在1小时灭活病毒悬液注射脑腔的小鼠全部死亡，3小时组80%小鼠死亡，5小时组尚有40%小鼠死亡。所有实例10小时灭活病毒悬液攻击小鼠后动物全部存活。实验结束对动物全部健存的组别进行平均增重统计。实例1和实例2的5小时组及以后动物均健存，体重平均增加16.5～19.3g；实例3 和实例4的7小时组及以后动物均健存，体重平均增加17.1～19.2g，实例6虽7小时仍有动物死亡，但10小时及以后动物均健存，体重增加17.9～19.6g。说明灭活病毒悬液已无活的狂犬病毒和其他毒性外源性因子。使用1:4000β-丙内酯10小时能将狂犬病毒灭活。说明实施例1-6的灭活方法获得的人二倍体狂犬病疫苗灭活病毒液灭活效果良好，缩短了灭活时间，提高了灭活效率。
实施例8 灭活效果的验证（细胞法）
按实施例1～4的灭活方法，取原液按照每3cm2细胞接种1ml的比例将灭活后的狂犬病疫苗病毒液接种于MRC-5细胞，培养7天后传代，继续培养至21天，将细胞悬液接种Lab-tek腔室载玻片（购自Thermo公司），于3～4天后对Lab-tek用免疫荧光法观察是否存在狂犬病毒。其中14天和21天分别更换细胞维持液（MEM液含4%的胎牛血清），并收集细胞上清进行小鼠脑腔攻击，观察小鼠21天。实验同时设立细胞阴性对照和病毒阳性对照，以确定试验的有效性。
表4 四批供试品的检测结果
注：结果中的“左孔右孔”为Lab-tek腔室载玻系统左右两个腔室。“+”表示Lab-tek中有免疫荧光，即有狂犬病毒。“-”表示Lab-tek中无免疫荧光，即无狂犬病毒。
实例1到实例4四批原液进行检测，四批原液试验有效，均无狂犬病毒存在，细胞上清注射小鼠，均无小鼠死亡。本实施例说明本发 明的灭活方法取得了非常好的灭活效果。
实施例9 灭活效果的验证（抗原含量分析）
按实施例1～3的方法，在单次浓缩液及原液取样检测狂犬病毒抗原含量，采用双抗体夹心法测定抗原含量。在测定时，把样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
表5 灭活前后病毒抗原结果分析（IU/ml）
R1，R2，R3代表单次病毒液收获次数
通过结果分析，实例1原液抗原含量3.3IU/ml,实例2原液抗原含量6.7IU/ml,实例3原液抗原含量4.8IU/ml均分别高于灭活前理论的病毒抗原含量2.5IU/ml，5.5IU/ml，4.0IU/ml，说明灭活过程对病毒的抗原无影响，灭活方法稳定。
Claims (4)
1.一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将人二倍狂犬病病毒液先后经3～6μm的过滤器和0.8μm的过滤器过滤，然后进行超滤浓缩，浓缩倍数为10～20倍，获得病毒浓缩液；所述的超滤浓缩是采用10KB的超滤膜包进行超滤，获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40-60mg/ml，浓缩液的pH值为7.0～9.0，10-15℃下平衡；
（2）添加灭活剂β-丙内酯，搅拌，搅拌条件为10～15℃下，155～180r/min；先将β-丙内酯用灭菌水1：40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中；
（3）灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第1次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第1次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中；其中，在灭活剂添加后的第50～70min时，进行第1次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌，待添加灭活剂后的第600min～700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第1400～1500min；
（4）水解去除灭活剂。
2.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3～6μm的过滤器和0.45μm的过滤器过滤。
3.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤（3）的操作在10～15℃条件下进行。
4.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，将步骤（3）获得的灭活液于37℃进行水解140～160min。
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| CN103083654A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-05-08 | 万里明 | Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 应用b-丙内酯灭活双价Vero细胞肾综合征出血热病毒纯化疫苗;陈伟 等;《沈阳部队医药》;20030930;摘要 * |
| 陈伟 等.应用b-丙内酯灭活双价Vero细胞肾综合征出血热病毒纯化疫苗.《沈阳部队医药》.2003,369-370. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103013933A (zh) | 2013-04-03 |
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