CN113607838A - 一种β-丙內酯残留量检测方法及其应用 - Google Patents

一种β-丙內酯残留量检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种β‑丙內酯残留量检验方法，采用气相色谱‑质谱联用，包括以下条件和步骤：(1)气相色谱‑质谱联用的条件和程序：毛细管色谱柱为ABFFAP，载体为He气，流速1ml/min，汽化室温度250℃，进样量0.4ul；质谱离子源温度200℃，接口温度250℃，定量离子42amu；程序为：初始温度100℃，保持1min，以20℃/min速率升温至180℃；(2)确定线性、检测限；(3)待测样品β‑丙內酯水解残留量测定。本发明提供的方法能准确分离出单一β‑丙內酯，降低β‑丙內酯检测限到1.95ppm，灵敏度更高，操作简便，能够更准确地监控β‑丙内酯残留，提高狂犬病疫苗生产的安全性。

Description

一种β-丙內酯残留量检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种β-丙內酯残留量检验方法及其应 用。
背景技术
人用狂犬病疫苗的生产过程中，β-丙內酯对病毒具有很强的灭活作用，但其 本身具有刺激性，现有方法通常采用气相色谱法检测灭活后β-丙內酯残留量，目 前该法检测β-丙內酯残留量时的检测限能达8.96ppm，当样品β-丙內酯残留量 低于8.96ppm时，检验结果出现假阴性，导致检测结果不够准确。而检测限越低 能够证明药品安全性越高，且现有方法中气相色谱法色谱峰中杂质峰较多，检测 结果不够准确。气相色谱杂质峰较多，会使检测结果受杂质峰影响。为解决现状， 亟需一种操作简便，准确率高且检测限低的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种β-丙內酯残留量检测方法及其应用，所述方法够准 确地分离出单一β-丙內酯，减少其它杂质，从而降低β-丙內酯检测限到1.95ppm， 操作简便。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种β-丙內酯残留量检验方法，其特征在于：采用气相色 谱-质谱联用法，包括以下步骤：
(1)气相色谱-质谱联用的条件和程序
所述气相色谱条件为：毛细管色谱柱为AB FFAP，载体为He气，流速 1ml/min，汽化室温度250℃，进样量0.4ul；
所述质谱条件为：质谱离子源温度200℃；接口温度250℃；定量离子42amu；
程序为：先经气相色谱再经质谱，条件均为初始温度100℃，保持1min，以 20℃/min速率升温至180℃；
(2)绘制标准曲线，确定线性、检测限；
(3)待测样品β-丙內酯水解残留量测定：将待测样品按照步骤(1)进样测 定，再通过步骤(2)的标准曲线计算β-丙內酯含量。
进一步地，步骤(2)中，绘制标准曲线，确定线性、检测限采用以下方法： 精密称取β-丙內酯100μl，加乙腈(色谱纯)900μl，得到稀释度为1：10的β- 丙內酯，再用乙腈依次稀释成为1:100、1:1000、1:2000、1：4000、1:8000:、1:16000、 1：32000、1：64000、1:128000、1:256000、1：512000，取1:1000～1：512000 分别进样，进行气相色谱-质谱联用法测定，再以β-丙內酯含量为横坐标，峰面 积为纵坐标，绘制标准曲线，同时以乙腈作空白对照，将信噪比大于3的供试品 浓度确定为本方法的检测限。
检测待测样品时，将待测样品进行气相色谱-质谱联用法测定，通过所述标 准曲线，计算待测样品的β-丙內酯含量。
本发明另一方面还提供上述β-丙內酯残留量检验方法在人用狂犬病疫苗的 生产工艺中的应用。在人用狂犬病疫苗生产工艺中，加入β-丙內酯灭活，37℃水 浴水解2h。在检测β-丙內酯含量时，分别于水解前后取样，进行气相色谱-质谱 联用法测定，再通过标准曲线，计算β-丙內酯含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的方法能够准确地分离出单一β-丙內酯，该方法检测灵敏度更 高，能够降低β-丙內酯检测限到1.95ppm，且样品用量少，结果准确度高，方法 准确可靠，操作简便，该方法能够更准确地监控β-丙内酯残留。较好的解决了狂 犬病疫苗生产中β-丙内酯残留量检测问题，提高了疫苗生产的安全性、质量可控 性，满足人用狂犬病疫苗(Vero细胞)浓缩液中残留的β-丙内酯检测的需要， 为病毒灭活工艺验证提供了依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中标准曲线图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的 实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】
(1)气相色谱-质谱联用
毛细管色谱柱为AB FFAP；载体为He气，流速1ml/min；汽化室温度250℃； 进样量0.4ul。质谱离子源温度200℃；接口温度250℃；定量离子42amu。程序： 初始温度100℃，保持1min，以20℃/min速率升温至180℃。
(2)确定线性、检测限
精密称取β-丙內酯100μl，加乙腈(色谱纯)900μl，得A液。再用乙腈依 次稀释成为1:100、1:1000、1:2000、1：4000、1:8000:、1:16000、1：32000、1： 64000、1:128000、1:256000、1：512000，详见下表1，取C～L分别进样，进行 气相色谱-质谱联用法测定。以β-丙內酯含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制 标准曲线，同时以乙腈作空白对照，将信噪比大于3的供试品浓度确定为本方法 的检测限。
表1
编号 稀释比例 乙腈(ul) 对照品溶液(ul) 含量(ppm)
A 1:10 900μl 原液100μl ——
B 1:100 900μl A 100μl ——
C 1:1000 900μl B 100μl 1000
D 1:2000 500μl C 500μl 500
E 1:4000 500μl D 500μl 250
F 1:8000 500μl E 500μl 125
G 1:16000 500μl F 500μl 62.5
H 1:32000 500μl G 500μl 31.2
I 1:64000 500μl H 500μl 15.6
J 1:128000 500μl I 500μl 7.8
K 1:256000 500μl J 500μl 3.9
L 1:512000 500μl K 500μl 1.95
(3)待测样品β-丙內酯水解残留量测定
选取3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)浓缩液按1:4000比例加入β-丙內酯 灭活，37℃水浴水解2h，分别于水解前后取样，10000r/min离心5min后，-20℃ 保存备用，进行气相色谱-质谱联用法测定，通过标准曲线，检测β-丙內酯含量。
(4)检测结果
标准品检测值如下表，并绘制标准曲线，确定线性、检测限；
表2
序号 稀释比例 含量(ppm) 峰面积
1 1:4000 250 223524
2 1:8000 125 111725
3 1:16000 62.5 51013
4 1:32000 31.2 24949
5 1:64000 15.6 11221
6 1:128000 7.8 5446
7 1:256000 3.9 2390
8 1:512000 1.95 1089
标准曲线图见图1。标准曲线：y＝901.77x-2210.1，相关系数R2＝0.9996，检测限为 1.95ppm。三批浓缩液检验结果见下表：
表3
Figure BDA0003185922390000041
结果判定：用该方法检测人用狂犬病疫苗浓缩液(Vero细胞)中β-丙內酯 残留量，标准曲线r2＞0.999、检测限＝1.95ppm。三批人用狂犬病疫苗(Vero细 胞)浓缩液批号为N201910023D034-02、199SN20191001-01、N201910024D035-02， 按1:4000比例加入β-丙內酯灭活、水解后，β-丙內酯残留量均低于7.88ppm， 可以保证水解后β-丙內酯残留量已降低至安全浓度7.88ppm以下。
【实施例2】
将现有技术与本申请技术通过三批人用狂犬病疫苗β-丙內酯残留量检测进 行比对，比对结果如下：
表4
Figure BDA0003185922390000042
Figure BDA0003185922390000051
本技术采用气相色谱-质谱联用法，以β-丙內酯含量为横坐标，峰面积为纵 坐标，绘制标准曲线，确定为本方法的检测限为1.95ppm，三批人用狂犬病疫苗 (Vero细胞)浓缩按1:4000比例加入β-丙內酯灭活、水解后能够检测出β-丙內 酯残留量分别为5.17ppm、3.80ppm、3.58ppm，均低于现有技术的检测限，且检 测结果低于β-丙內酯安全浓度，有利于提高药品安全性。

Claims (4)

1.一种β-丙內酯残留量检验方法，其特征在于：采用气相色谱-质谱联用法，包括以下条件和步骤：
(1)气相色谱-质谱联用的条件和程序：
所述气相色谱条件为：毛细管色谱柱为AB FFAP，载体为He气，流速1ml/min，汽化室温度250℃，进样量0.4ul；
所述质谱条件为：质谱离子源温度200℃，接口温度250℃，定量离子42amu；
程序为：先经气相色谱再经质谱，条件均为初始温度100℃，保持1min，以20℃/min速率升温至180℃；
(2)绘制标准曲线，确定线性、检测限；
(3)待测样品β-丙內酯水解残留量测定：将待测样品按照步骤(1)进样测定，再通过步骤(2)的标准曲线计算β-丙內酯含量。
2.如权利要求1所述的β-丙內酯残留量检验方法，其特征在于：所述步骤(2)采用以下方法，
精密称取β-丙內酯100μl，采用乙腈进行稀释，得到稀释比例为1:1000、1:2000、1：4000、1:8000:、1:16000、1：32000、1：64000、1:128000、1:256000、1：512000的β-丙內酯标准品，将标准品分别按照步骤(1)进样，再以β-丙內酯含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，同时以乙腈作空白对照，将信噪比大于3的供试品浓度确定为本方法的检测限。
3.一种权利要求1所述的β-丙內酯残留量检验方法在人用狂犬病疫苗的生产工艺中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：在人用狂犬病疫苗生产中，加入β-丙內酯灭活，37℃水浴水解2h，在检测β-丙內酯含量时，分别于水解前后取样，进行气相色谱-质谱联用法测定，通过标准曲线，检测β-丙內酯含量。
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