CN112857925B - 一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法、分析方法及其装置 - Google Patents
一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法、分析方法及其装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法、分析方法及其装置，属于定量分析技术领域。本方法在实时恒温条件下将生物气体样品中的痕量醛酮类物质富集收集同时进行2,4‑二硝基苯肼稳定化反应，洗脱后采用高效液相色谱高分辨质谱联用技术分析。本发明相比现有技术的优势：(1)实时恒温条件下富集采样，水汽干扰小，样品损失率低；(2)稳定化处理可实现样品离线存储以及提高醛酮类物质在后续检测环节的电离效率；(3)优化后的高效液相色谱高分辨质谱联用技术可使22种醛酮2,4‑二硝基苯腙化合物有效分离，且样品消耗量少，检测周期短，仅需15min，检测效率高；(4)本方法可实现22种醛酮‑2,4‑二硝基苯腙类化合物的准确定性和定量分析。
Description
技术领域
本发明属于定量分析技术领域，具体涉及一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法、分析方法及其装置。
背景技术
当生物体受到外界不利刺激或处于病理状态时，机体氧化应激引起的脂质过氧化以及细胞增殖将会影响体内醛酮类物质的存在水平，由于挥发性醛酮物质在血液中的溶解性低，可在肺泡中快速地完成气体血液交换，从而在生物气体样品中被检测到。近些年来，有大量研究人员尝试分析各种呼气(人体呼出气、动物呼出气)中的挥发性醛酮类物质来探究其是否可作为疾病(肺癌、流感、乳腺癌等)的潜在生物标志物，同时通过分析细胞顶空气中挥发性醛酮组分，来进一步探究验证疾病患者呼气中醛酮物质的产生机制。但是由于有些气体样品中醛酮类物质浓度较低，有些甚至低于检出限，导致在检出过程中丢失掉部分目标分析物；同时挥发性醛酮类物质属于反应性物质，在样品收集或存储的过程中易发生分解或反应，导致气态醛酮类物质分析技术受限，同时在液相色谱检测分析过程中由于流动相体系选择或者液相洗脱梯度条件不当时，无法有效分离醛酮类化合物，会出现多个物质共流出，导致分离度差、精密度低以及定性定量不准等不足。
目前，细胞顶空气、动物呼出气以及人体呼出气等生物气体样品中醛酮类物质收集的主要技术方案是将一定量的呼气用气袋或者苏玛罐收集或通过固相微萃取(Solid-phase microextraction，SPME)或吸附管将呼气中的化学组分收集后进行后续处理或直接实时在线检测。但这些方法并不适用于醛酮类物质，这主要是由于(1)呼气中的醛酮类物质浓度较低，有些可能低于检出限；(2)醛酮类物质化学性质活泼，在样品收集或存储的过程中易发生分解或反应；(3)气袋、苏玛罐和吸附管等对样品中的化学物质有一定的吸附作用，会丢失掉一些浓度较低的醛酮类物质。同时这些方法基本要求实时在线样分析或离线采样后需立即对样品分析，对实验场地条件和环境要求较高。赵伟军(专利号：CN111398463A)中利用气袋预先将人体呼气收集起来，再通过涂有衍生剂的吸附采样管或固相微萃取(SPME)去采集人体呼气中的化合物，但气袋、苏玛罐和吸附管等对样品中的化学物质有一定的吸附作用，样品损失率普遍在10％-50％，会导致部分痕量目标化合物丢失。
目前呼气中醛酮类物质的常用测定方法主要有气相色谱-质谱联用技术(GasChromatography Mass Spectrometry，GC-MS)以及利用衍生剂将挥发性醛酮转化为稳定的衍生化合物再进行高效液相色谱质谱联用技术(High performance liquidchromatograph-Mass Spectrometry，HPLC-MS)，但其中GC-MS对于低碳数醛酮类物质的检出效果较差，电离效率较低。而HPLC-MS由于干扰少、灵敏度高，可测物质范围广，分离效果好，是分析呼气中醛酮类物质的理想方法，但在实际应用中采用液相色谱法对醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物时，由于流动相体系选择或者液相洗脱梯度条件不当时，无法有效分离这22种化合物，会出现多个物质共流出，导致分离度差、检测周期长、精密度低以及定性定量不准等不足。张洪非(专利号：CN101876651B)中用溶液捕集卷烟主流烟气中的主要羰基化合物，通过高效液相色谱仪配合紫外检测器进行分析检测，但该方法只能有效的分离8种醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物，且进样体积为20μL和检测周期需35分钟，检测效率较低。
综上所述，开发一种分析方法可以实现将气态醛酮类物质富集收集后再将其转化为稳定的化合物便于存储和后续的分析，能够有效分离醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物的液相色谱质谱联用分析方法，对实现气态醛酮类物质的准确定性和定量分析具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术缺陷，本发明的首要目的是提供一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法。
本发明的另一目的是提供一种生物气体样品中醛酮类物质的采集装置。
本发明的再一目的是提供一种生物气体样品中醛酮类物质的分析方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种生物气体样品中醛酮类物质的采集方法，包括如下步骤：
S1、以恒定的流速将生物气体样品引入到空气采样泵中，经除臭氧小柱净化后，与DNPH(2,4-二硝基苯肼，Dinitrophenylhydrazine，)衍生小柱中的DNPH进行衍生化反应，得到稳定的腙类物质；除臭氧小柱可将气体样品中的臭氧除去，防止其与醛酮类物质发生反应干扰实验结果。
S2、取采样后的DNPH衍生小柱用洗脱剂进行反向洗脱，对洗脱液进行过滤，干燥，用洗脱剂进行复溶，得到待检测液。
所述的生物气体包括但不限于细胞顶空气、动物呼出气和人体呼出气。
优选的，对于步骤S1中所述的以恒定的流速将生物气体样品引入到空气采样泵中：
当所述的生物气体为细胞顶空气时，具体操作为：将干燥空气气瓶、质量流量控制器、细胞培养瓶和空气采样泵通过管路依次串联连接，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将细胞培养瓶中的细胞顶空气引入到空气采样泵中；其中，所述的细胞培养瓶和空气采样泵均放置在37℃恒温箱中；所述的细胞培养瓶中培养有正常生长的目标细胞。干燥空气气瓶可以为细胞培养瓶中的细胞提供维持细胞正常生长所需的氧气和二氧化碳等空气条件。由于恒温箱和室温存在一定的温差，会导致管路产生水汽，从而吸附一定量的醛酮类物质，所以为了避免水汽对实验的结果产生干扰，除干燥空气气瓶、质量流量控制器和干燥空气部分的进气管路放置在恒温箱外，细胞培养瓶以及空气采样泵等均放置在恒温箱中。
当所述的生物气体为动物呼出气时，具体操作为：将干燥空气气瓶、质量流量控制器、动物呼吸腔体和空气采样泵通过管路依次串联连接，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将动物呼吸腔体的动物呼出气引入到空气采样泵中；其中，所述的动物呼吸腔体中放置正常生长的目标动物。干燥空气气瓶可以为动物呼吸腔体中的动物提供维持生命所需的氧气和二氧化碳等空气条件，可实现活体动物呼气样品的采集。
优选的，所述的采样的条件设置如下：采样流速为100～200mL/min，采样时间为15～25min，采样体积为2～5L。更优选的，所述的采样的条件设置如下：采样流速为150mL/min，采样时间为20min，采样体积为3L。
当所述的生物气体为人体呼出气时，具体操作为：将质量流量控制器的一端连接Nafion管，另一端通过管路与空气采样泵连接，待测对象向Nafion管中吹气，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将人体呼出气引入到空气采样泵中。nafion管可以除去呼气中的水汽。通过空气质量流量控制计实时控制流速，多余的呼气将排至环境中。
优选的，当所述的生物气体样品为细胞顶空气时，所述的细胞培养瓶的数量设置为两个或两个以上，分别通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将细胞培养瓶中的细胞顶空气引入到对应的空气采样泵中。所述的干燥空气气瓶可同时与多个质量流量控制器连接，提供多个培养体系的空气条件。如图5所示，这样的采样方式可实现多个样品同时采集，可以解决平行样的采样时间不同会对分析结果造成一定的干扰的问题，比如细胞攻毒后，培养时间会影响细胞增殖、细胞凋亡、细胞病变等，多个样品同时采集可避免这些因素对细胞顶空气的成分以及浓度产生影响。
优选的，步骤S1中所述的管路均为特氟龙(PTFE)管。特氟龙管对于VOCs的吸附较小，管路样品损失率低。
优选的，步骤S1中所述的空气采样泵的采样流速与质量流速控制器的一致。这样可以保持系统气压的稳定。
优选的，步骤S1中所述的衍生化反应过程如下：
式中，R、R1为相同或不同的有机基团。
优选的，步骤S2中所述的洗脱在采样后12小时内完成，在这期间，所述的DNPH衍生小柱置于-20℃下保存。(采样结束后，为了防止收集完样品后的衍生柱在保存期间引入新的背景污染，对保存时间进行优化，采样后-20℃下冷藏12h内样品检测结果偏差较小，RSD<5％。
优选的，步骤S2中所述的洗脱剂为乙腈，所述的过滤所用的滤膜的孔径为0.22μm，所述的干燥通过氮吹仪实现。
优选的，步骤S2中所述的待检测液的保存条件为-20℃、避光、密封保存。
一种生物气体样品中醛酮类物质的采集装置，包括生物气体引入组件1和空气采样泵2；所述的生物气体引入组件1和空气采样泵2通过管路3连接；所述空气采样泵2中设置有除臭氧小柱21和DNPH衍生小柱22；
其中，当所述的生物气体为细胞顶空气时，所述生物气体引入组件1包括通过管路3依次串联连接的干燥空气气瓶11、质量流量控制器12和细胞培养瓶13，且所述的细胞培养瓶13和空气采样泵2连接；所述的采集装置还包括恒温箱4，所述的细胞培养瓶13和空气采样泵2设置在恒温箱4内；
当所述的生物气体为动物呼出气时，所述生物气体引入组件1包括通过管路3依次串联连接的干燥空气气瓶11、质量流量控制器12和动物呼吸腔体14，且所述的动物呼吸腔体14和空气采样泵2连接；
当所述的生物气体为人体呼出气时，所述生物气体引入组件1包括Nafion管15和质量流量控制器12，所述质量流量控制器12的一端与Nafion管15连接，另一端与空气采样泵2连接；所述的Nafion管15用于待测对象的人体呼出气的引入。
优选的，所述的管路3均为特氟龙管。
优选的，所述的动物呼吸腔体14为有机玻璃管或离心管。
一种生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其包括上述采集方法中的步骤，以及如下步骤：
(1)标准工作曲线的建立：
取22种醛酮-2,4-二硝基苯腙，以乙腈为溶剂，配置梯度浓度标准溶液，进行高效液相色谱高分辨质谱联用检测，以测得的色谱峰面积为横坐标，以醛酮-2,4-二硝基苯腙对应的质量浓度为纵坐标绘制标准工作曲线，并计算线性决定系数R2；其中，检测条件如下：
液相色谱条件为：色谱柱：C18，1.7μm，2.1×100mm(I.D.)；柱温：40℃；液相流动相：有机相乙腈，水相0.1％甲酸水；紫外检测器波长：270nm；流速：0.4mL/min；进样量：2μL；液相洗脱程序为：0-4min内乙腈从50％线性升至70％，0.1％甲酸水由50％线性降至30％；4-5.5min内乙腈从70％线性升至80％，0.1％甲酸水由30％线性降至20％；5.5-8min内乙腈从80％线性升至100％，保持3min后0.2min内降至50％，0.1％甲酸水由20％线性降至0％，保持3min后0.2min内升至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为15min；
质谱条件为：采用电喷雾(ESI)源，负离子采集模式，全扫描，质量范围70～1050Da，喷雾电压-2.5KV，毛细管温度350℃，鞘气30bar，辅助气10bar；
(2)物质峰定性：
通过22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物精确质荷比、化学式和保留时间以及出峰顺序对物质峰进行定性；
(3)待检测液的定性及定量分析：
用高效液相色谱高分辨质谱联用法按步骤(1)中所述的检测条件测定待检测液，记录色谱峰，得到待检测液中2,4-二硝基苯腙类化合物的种类；进一步通过标准工作曲线方程计算，得到待检测液中所含2,4-二硝基苯腙类化合物的浓度，即获得所述的待检测液的定性及定量分析结果。
所述的22种醛酮-2,4-二硝基苯腙分别为：甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、甲基丙烯醛、2-丁酮、丁醛、苯甲醛、环己酮、异戊醛、戊醛、对甲基苯甲醛、邻甲基苯甲醛、甲基异丁基酮、己醛、2,5-二甲基苯甲醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛对应的二硝基苯腙类化合物。
优选的，步骤(1)中所述的梯度浓度标准溶液包括高、中、低浓度范围的三组梯度浓度标准溶液，其中，高浓度范围组的浓度分别为：80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L、1000μg/L、2000μg/L；中浓度范围组的浓度分别为：2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L，低浓度范围组的浓度分别为：0.001μg/L、0.005μg/L、0.01μg/L、0.08μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1μg/L。
数据处理：通过HPLC-MS自带的数据处理软件Xcalibur 3.0对实验所得的原始数据进行批量处理，得到标准曲线函数关系式、决定系数(R2)、检出限(LOD)和定量限(LOQ)，并通过标准曲线方程计算得到各实验样品的浓度信息，将所得数据导出至Excel表格中进行相关参数的计算，如平均浓度(AVE)、偏差(SD)、相对偏差(RSD)等。
本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)流动相体系、流速、柱温和洗脱梯度条件在很大程度上决定了化合物的停留时间以及分离。本发明对细胞顶空气中醛酮类物质的采集方法进行了优化，实现22种醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物的有效分离。通过本发明的采集方法，能够快速高效地以较低样品损失率将气态痕量的醛酮类物质进行富集采集，并转化为稳定的化合物，稳定化处理可实现样品离线存储以及提高醛酮类物质在后续检测环节的电离效率，可大大缩短检测周期。
(2)进样量过大会造成色谱柱过载和污染，以及样品量少达不到进样量要求，而进样量过少会对分析方法的检出限以及精密度等造成影响。本发明根据选用色谱柱的填料、粒度和粒径等参数进行优化测试，根据测试结果确定进样量为2μL，较好的兼顾了分析方法精准性以及检测系统损耗以及寿命等方面。
(3)与现有技术相比，本发明通过对高效液相色谱分离条件的优化，可使22种醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物有效分离，分离度好，检出限低以及能够准确定性定量，同时精密度高、样品消耗量少、检测周期短，仅需15min，检测效率高。本方法可实现22种醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物的准确定性和定量分析。
附图说明
图1为细胞顶空气中痕量醛酮类物质富集采集装置示意图；
图2为醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物的洗脱程序图；
图3为动物呼出气中痕量醛酮类物质富集采集装置示意图；
图4为人体呼出气中痕量醛酮类物质富集采集装置示意图；
图5为三个细胞顶空气平行样品中痕量醛酮类物质同时采集系统的示意图；
图6为22种醛酮-2,4-二硝基苯腙标准物质TIC图；
图7为空白培养基、健康对照组以及流感细胞顶空气中醛酮类物质浓度对比图；
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1-生物气体引入组件，2-空气采样泵，3-管路，4-恒温箱，11-干燥空气气瓶，12-质量流量控制器，13-细胞培养瓶，14-动物呼吸腔体，15-Nafion管，21-除臭氧小柱，22-DNPH衍生小柱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1：细胞顶空气的富集采集及对应的装置
如图1所示，为本发明一种细胞顶空气中醛酮类物质的采集装置，包括生物气体引入组件1和空气采样泵2；所述的生物气体引入组件1和空气采样泵2通过管路3连接；所述空气采样泵2中设置有除臭氧小柱21和DNPH衍生小柱22；所述生物气体引入组件1包括通过管路依次串联连接的干燥空气气瓶11、质量流量控制器12和细胞培养瓶13，且所述的细胞培养瓶13和空气采样泵2连接；所述的采集装置还包括恒温箱4，所述的细胞培养瓶13和空气采样泵2设置在恒温箱内4。
本发明一种细胞顶空气中醛酮类物质的采集方法为：将培养好的目标细胞瓶放置在恒温箱(37℃)中，每个细胞培养瓶瓶盖已被带有进出口气路的橡胶塞代替，为了维持细胞正常所需的氧气和二氧化碳等空气条件，进口气路通入干燥空气；出口气路与空气采样泵相连来抽取细胞瓶中的顶空气，采样器的出口先后连接除一根除臭氧小柱和DNPH衍生柱，将收集到的细胞顶空气除去臭氧后与DNPH进行衍生化转化为稳定的腙类物质。采用特氟龙管按图1连接好所有的管路，通过质量流量控制器设置满足采样需求的干空气流速，同样，为了保持系统气压的稳定，空气采样泵的采样流速需要与质量流速控制器的一致，还可根据采样需求以及DNPH衍生柱的采样量控制采样时间。由于细胞顶空气的正常生长适宜温度为37℃，一般室内环境由于温差会导致采样过程中管路凝结水汽吸附部分醛酮类物质，而恒温环境可以有效地防止这种现象的发生。一定流速的干空气作为载气将细胞顶空气中的挥发性醛酮类物质载入至空气采样泵，再通过空气采样泵将采集的气体与2,4-二硝基苯肼进行衍生化处理，按所设定的采样流速和采样时间采集完后将DNPH衍生柱取下，快速封好两端后放置在-20℃下保存并于12h内进行洗脱。
醛酮-2,4-二硝基苯腙类化合物的洗脱程序：如图2所示，将采样后DNPH衍生小柱用一定量乙腈以缓慢匀速进行反向洗脱，并用0.22μm滤膜对洗脱液进行过滤后转移到一定量程的试管中，再使用氮吹仪以一定的流速用高纯氮气将洗脱液吹干后用乙腈进行复溶，存放于棕色瓶中，密封后用于分析或放置在-20℃冰箱下保存直至分析。
实施例2：动物呼出气的富集采集及对应的装置
如图3所示，为本发明一种动物呼出气中醛酮类物质的采集装置，包括生物气体引入组件1和空气采样泵2；所述的生物气体引入组件1和空气采样泵2通过管路3连接；所述空气采样2泵中设置有除臭氧小柱21和DNPH衍生小柱22；所述生物气体引入组件1包括通过管路3依次串联连接的干燥空气气瓶11、质量流量控制器12和动物呼吸腔体14，且所述的动物呼吸腔体14和空气采样泵2连接。
本发明一种动物呼出气中醛酮类物质的采集方法为：将小鼠放置在呼气腔单元中，采用特氟龙管按图3连接好所有的管路，在小鼠呼气样品在采集过程中，载气会不间断提供给小鼠呼吸维持生命，可实现活体动物呼气样品的采集。采用有机玻璃管或离心管作为小鼠呼气腔体，载气由进气口进入供小鼠呼吸，同时再将小鼠呼气载入空气采样泵中，具体的采样设置方法以及流程走向与细胞顶空气采样类似。
实施例3：人体呼出气的富集采集及对应的装置
如图4所示，为本发明一种人体呼出气中醛酮类物质的采集装置，包括生物气体引入组件1和空气采样泵2；所述的生物气体引入组件1和空气采样泵2通过管路3连接；所述空气采样泵2中设置有除臭氧小柱21和DNPH衍生小柱22；所述生物气体引入组件1包括Nafion管15和质量流量控制器12，所述质量流量控制器12的一端与Nafion管15连接，另一端与空气采样泵2连接；所述的Nafion管15用于待测对象的人体呼出气的引入。
本发明一种人体呼出气中醛酮类物质的采集方法为：人呼气首先通过nafion管除去呼气中的水汽后，通过空气质量流量控制计实时控制流速，多余的呼气将排至环境中，呼气进入到空气采样泵中进行富集采样。具体的采样设置方法以及流程走向与细胞顶空气采样类似。
实施例4：一种细胞顶空气中醛酮类物质的分析方法
(1)采样
A549细胞(美国ATCC公司)，在实验室传代及冻存。甲型H1N1流感病毒株(A/PR/8/34)(美国ATCC公司)，在实验室保存，使用前用鸡胚扩增，采用Reed-Muench法测定病毒半数组织感染量(TCID50)，毒株储存在-80℃备用。T75细胞培养瓶(美国Corning公司)；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25％EDTA胰酶、1×PBS均为美国Gibco公司提供。将细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基接种于T75培养瓶中，37℃、饱和湿度下5％CO2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长。实验均取对数生长期的细胞，细胞数为7×106/mL。细胞贴壁24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。使用PBS冲洗2遍后，用不含血清的DMEM将流感病毒(PR8/H1N1标准株)稀释为M.O.I＝0.1的病毒液，实验组每瓶加入15mL病毒液，对照组加入15mL2％胎牛血清含有1μg/mL的TPCK-胰酶的DMEM培养基，继续孵育24小时，观察细胞病变情况。
细胞孵育24小时后，将细胞瓶取出，开始采集细胞顶空气，图1为细胞顶空气中痕量醛酮类物质富集采集装置示意图。将细胞瓶置于恒温箱中，保持37℃，每个瓶盖已被带有进出口气路的橡胶塞代替，为了维持细胞正常所需的氧气和二氧化碳等空气条件，进口气路通入干燥空气；出口气路与空气采样泵相连来抽取细胞瓶中的顶空气，采样器的出口先后连接除一根臭氧小柱和DNPH衍生柱，将收集到的细胞顶空气除去臭氧后与DNPH进行衍生化转化为稳定的腙类物质。采样流速与进气流速均设为150mL/min，采样时间为20min，通过空气质量流量控制计实时控制流速，单个样品采样体积为3L。采集完后将DNPH衍生柱取下，快速封好两端后放置在-20℃下保存并于12h内进行洗脱。
洗脱：将采样后DNPH衍生小柱用5mL注射器吸取5mL乙腈以缓慢匀速进行反向洗脱，并用0.22μm滤膜对洗脱液进行过滤后转移到5mL试管中，再使用氮吹仪以20mL/min流速用高纯氮气将洗脱液吹干后用1mL乙腈进行复溶，存放于1.5mL棕色液相上样瓶，密封后用于HPLC-MS分析或放置在-20℃冰箱下保存直至分析。
通过以上操作得到了若干个待检测样品。
(2)标准工作曲线的建立
考虑到细胞顶空气中挥发性醛酮类物质浓度差异较大，本发明取22种醛酮-2,4-二硝基苯腙，以乙腈为溶剂，配置高、中、低浓度范围的三组梯度浓度标准溶液；高浓度范围80、100、200、400、800、1000、2000μg/L；中浓度范围2、4、8、10、20、40、80μg/L，低浓度范围0.001、0.005、0.01、0.08、0.1、0.2、0.4、0.8、1μg/L，进行高效液相色谱高分辨质谱联用检测，以测得的色谱峰面积为纵坐标，以醛酮-2,4-二硝基苯腙对应的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，并计算线性相关系数R2；检出限(LOD)按信噪比(S/N)＝3计算，定量限(LOQ)按S/N＝10计算。
液相色谱条件为：色谱柱：C18，1.7μm,2.1×100mm(I.D.)；柱温：40℃；液相流动相：有机相乙腈，水相0.1％甲酸水；紫外检测器波长：270nm，流速：0.4mL/min；进样量：2μL。质谱分析：采用电喷雾(ESI)源，负离子采集模式，全扫描，质量范围70～1050Da，喷雾电压-2.5KV，毛细管温度350℃，鞘气30bar，辅助气10bar。采用外标法对细胞顶空气中的挥发性醛酮类物质进行定量分析。其洗脱梯度程序为：0-4min内乙腈从50％线性升至70％，0.1％甲酸水由50％线性降至30％；4-5.5min内乙腈从70％线性升至80％，0.1％甲酸水由30％线性降至20％；5.5-8min内乙腈从80％线性升至100％，保持3min后0.2min内降至50％，0.1％甲酸水由20％线性降至0％，保持3min后0.2min内升至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为15min。
以乙腈为溶剂，配置质量浓度为0.5、50、500μg/L低、中、高3个质控浓度的22种醛酮2,4-二硝基苯腙混标，每个质量浓度各6个样品，连续测定三批，考察方法的准确性和精密度。取200μL上述三个质量浓度的混标质控样品分别加入DNPH衍生小柱中，反应2h后按醛酮-2,4-二硝基苯腙的洗脱程序操作，每个质量浓度各6个样品，根据测得的结果计算回收率和相对标准偏差(RSD)。
(3)物质峰定性
通过22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物精确质荷比、化学式和保留时间以及出峰顺序对物质峰进行定性。采用本发明的UHPLC-HRMS方法获得的22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物的出峰顺序为：1-甲醛、2-乙醛、3-丙烯醛、4-丙酮、5-丙醛、6-丁烯醛、7-甲基丙烯醛、8-2-丁酮、9-丁醛、10-苯甲醛、11-环己酮、12-异戊醛、13-戊醛、14-对甲基苯甲醛、15-邻甲基苯甲醛、16-甲基异丁基酮、17己醛、18-2,5-二甲基苯甲醛、19-庚醛、20-辛醛、21-壬醛、22-癸醛，如图6所示。从图中可以看到22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物分离度良好，能够对所测目标物进行准确的定性以及定量分析。
如表1所示，22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物高(40～1000μg/L)、中(8～400μg/L)、低(0.08～8μg/L)浓度范围标准曲线线性良好，各浓度范围标准曲线决定系数R2≥0.9984，线性范围均大于103，LODs范围在0.003～0.09μg/L之间。
表1 22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物的线性方程，线性范围，相关系数与检出限
如表2所示，综合0.5、50、500μg/L三个质量浓度标准样品的检出结果，22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物的日内准确度在96.11％-109.43％，日内精密度<3.91％；日间准确度在96.48％-105.69％，日间精密度<5.29％，表明所建立的方法具有较高的精密度和准确性；平均回收率在95.10％-109.58％，相应的RSD<5.83％，表明本方法的回收率良好。
表2 22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物HPLC-MS检测方法的准确度、精密度和回收率
(4)待检测液的定性及定量分析
用高效液相色谱高分辨质谱联用法按步骤(2)中所述的检测条件测定待检测液，记录色谱峰，得到待检测液中2,4-二硝基苯腙类化合物的种类；进一步通过标准工作曲线方程计算，得到待检测液中所含2,4-二硝基苯腙类化合物的浓度，即获得所述的待检测液的定性及定量分析结果。
根据数据处理软件Xcalibur 3.0批量处理得到的标准曲线方程计算出空白培养基(n＝1)、A549细胞(n＝5)、IAV感染A549细胞(n＝5)顶空气样本中22种醛酮-2,4-二硝基苯腙有机物的浓度(图7)。本研究中共检出19种有效物质，其中15种醛类物质(甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、甲基丙烯醛、苯甲醛、异戊醛、戊醛、己醛、对甲基苯甲醛2,5-二甲基苯甲醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛)和4种酮类物质(丙酮、2-丁酮、环己酮、甲基异丁基酮)，浓度范围在0.5-400μg/L之间。与空白培养基顶空气中化学组分相比，A549细胞顶空气中9种醛酮化合物浓度存在显著不同(>1.5倍)，这些物质可能与A549细胞的代谢过程有关；A549细胞经IAV感染后，与A549细胞相比，顶空气中10种物质浓度下降，1种酮类物质(丙酮)浓度上升，8种物质浓度基本持平。有趣的是在本研究中，与空白培养基相比，A549细胞顶空气中的乙醛、丁醛、异戊醛、戊醛呈下降趋势，而IAV感染A549细胞与A549细胞相比，顶空气中的大部分醛类(甲醛、乙醛、丙醛、苯甲醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、葵醛)也呈下降趋势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、以恒定的流速将生物气体样品引入到空气采样泵中，经除臭氧小柱净化后，与DNPH衍生小柱中的DNPH进行衍生化反应，得到稳定的腙类物质；
S2、取采样后的DNPH衍生小柱用洗脱剂进行反向洗脱，对洗脱液进行过滤，干燥，用洗脱剂进行复溶，得到待检测液；
对于步骤S1中所述的以恒定的流速将生物气体样品引入到空气采样泵中：
当所述的生物气体为细胞顶空气时，具体操作为：将干燥空气气瓶、质量流量控制器、细胞培养瓶和空气采样泵通过管路依次串联连接，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将细胞培养瓶中的细胞顶空气引入到空气采样泵中；其中，所述的细胞培养瓶和空气采样泵均放置在37℃恒温箱中；所述的细胞培养瓶中培养有正常生长的目标细胞；
当所述的生物气体为动物呼出气时，具体操作为：将干燥空气气瓶、质量流量控制器、动物呼吸腔体和空气采样泵通过管路依次串联连接，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将动物呼吸腔体的动物呼出气引入到空气采样泵中；其中，所述的动物呼吸腔体中放置正常生长的目标动物；
当所述的生物气体为人体呼出气时，具体操作为：将质量流量控制器的一端连接Nafion管，另一端通过管路与空气采样泵连接，待测对象向Nafion管中吹气，通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将人体呼出气引入到空气采样泵中；
S3、分析
（1）标准工作曲线的建立：
取22种醛酮−2,4−二硝基苯腙，以乙腈为溶剂，配置梯度浓度标准溶液，进行高效液相色谱高分辨质谱联用检测，以测得的色谱峰面积为纵坐标，以醛酮−2,4−二硝基苯腙对应的质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，并计算线性决定系数R2；
（2）物质峰定性：
通过22种醛酮−2,4−二硝基苯腙有机物精确质荷比、化学式和保留时间以及出峰顺序对物质峰进行定性；
（3）待检测液的定性及定量分析：
用高效液相色谱高分辨质谱联用法按步骤（1）中的检测的检测条件测定待检测液，记录色谱峰，得到待检测液中2,4−二硝基苯腙类化合物的种类；进一步通过标准工作曲线方程计算，得到待检测液中所含2,4−二硝基苯腙类化合物的浓度，即获得所述的待检测液的定性及定量分析结果；
所述的22种醛酮−2,4−二硝基苯腙分别为：甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、甲基丙烯醛、2−丁酮、丁醛、苯甲醛、环己酮、异戊醛、戊醛、对甲基苯甲醛、邻甲基苯甲醛、甲基异丁基酮、己醛、2,5−二甲基苯甲醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛对应的二硝基苯腙类化合物；步骤（1）中所述的高效液相色谱高分辨质谱联用检测的检测条件如下：
液相色谱条件为：色谱柱：C18，1.7 μm，2.1 × 100 mmI.D.；柱温：40℃；液相流动相：有机相乙腈，水相0.1%甲酸水；紫外检测器波长：270 nm；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；
质谱条件为：采用电喷雾源，负离子采集模式，全扫描，质量范围70~1050 Da，喷雾电压−2.5 KV，毛细管温度350 ℃，鞘气30 bar，辅助气10 bar。
2.根据权利要求1所述的生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：
液相洗脱程序为：0−4 min内乙腈从50%线性升至70%，0.1%甲酸水由50%线性降至30%；4−5.5 min内乙腈从70%线性升至80%，0.1%甲酸水由30%线性降至20%；5.5−8 min内乙腈从80%线性升至100%，保持3 min后0.2 min内降至50%，0.1%甲酸水由20%线性降至0%，保持3min后0.2 min内升至50%，平衡时间为3.8 min，总运行时间为15 min。
3.根据权利要求1所述的生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：
当所述的生物气体为细胞顶空气时，所述的细胞培养瓶的数量设置为两个以上，分别通过质量流量控制器设置满足采样需求的流速，将细胞培养瓶中的细胞顶空气引入到对应的空气采样泵中。
4.根据权利要求1所述的生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：
当所述的生物气体为细胞顶空气时，所述的采样的条件设置如下：采样流速为100～200 mL/min，采样时间为15～25 min，采样体积为2～5 L。
5.根据权利要求1所述的生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：
步骤S2中所述的洗脱在采样后12小时内完成，在这期间，所述的DNPH衍生小柱置于−20℃下保存；
步骤S2中所述的洗脱剂为乙腈，所述的过滤所用的滤膜的孔径为0.22 μm，所述的干燥通过氮吹仪实现。
6.根据权利要求1所述的生物气体样品中醛酮类物质的分析方法，其特征在于：
步骤S1中所述的空气采样泵的采样流速与质量流速控制器的一致；
步骤S1中所述的管路均为特氟龙管；
步骤S2中所述的待检测液的保存条件为−20℃、避光、密封保存。
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