CN111398460A - 一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,属于含量检测领域。它解决了现有当呼出气中的一些VOCs的浓度范围很小时,基本无法对其进行定量检测等问题,一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,包括如下步骤包括如下步骤:S01:收集人体呼出气;S02:将人体呼出气通入附着有衍生试剂的吸附装置,用洗脱剂洗脱吸附装置,得到待测液;S03:对待测液进行检测。本发明具有灵敏高、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于含量检测领域,特别涉及一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法。
背景技术
人体呼出气体是直接由肺呼出,最早是由pauling等人在1971年采集了正常人的呼出气体,并检测到其中250种挥发性有机物。后来越来越多的研究者对这些有机物进行系统研究,研究发现这些有机物主要是脂质过氧化过程的产物。
近几年,呼出气的分析已经成为国际研究的前沿,目前已有报道利用传感器,质子-传递反应质谱,气相色谱-质谱,离子迁移谱等技术用于呼出气VOCs(挥发性有机物)中相关潜在肿瘤标记物的检测。研究表明,呼出气中包含的挥发性有机化合物和人体疾病代谢状态密切相关(即通过检测挥发性有机物,、代表患有某种疾病的风险,需要进一步确诊)。但由于人体中这些VOCs含量低,甚至低于仪器检测的最低定量误差要求。例如:呼出气中的一些VOCs的浓度范围仅在ppt-ppb之间,已经低于很多仪器的定量要求。而呼出气中有些成分如水蒸气、CO2等含量又极高,又干扰仪器的定量测定。最后呼出气还含有如醇、酮、醛等化学多样性特征的混合物,这使得疾病生物标记的鉴定复杂化。
故现有的人体呼出气挥发性检测的方法中,大多为定性检测方法,定量检测困难,尤其是当呼出气中的一些VOCs的浓度范围很小时,基本无法对其进行定量检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题,提供了一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S01:收集人体呼出气;
S02:将人体呼出气通入附着有衍生试剂的吸附装置,用洗脱剂洗脱吸附装置,得到待测液;
S03:对待测液进行检测。
优选地,所述的吸附装置为吸附采样管,所述的吸附采样管采用如下步骤制备:
(1)将衍生试剂用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为3%的涂渍液;
(2)将固定相填料填充到空白吸附柱上;
(3)将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上,最后用氮气吹干,4℃密封冷藏保存;
所述的衍生试剂的化学式为R-NH-NH2,制备过程中在低醛酮环境中进行,要求以甲醛计≤0.1ug,以丙酮计≤0.25ug。
优选地,所述的衍生试剂为2,4-二硝基苯肼。
优选地,步骤S02中,对收集的人体呼出气进行加热恒温处理,处理的温度在40-70℃之间,然后以恒定的流速流经吸附装置,再用洗脱剂洗脱吸附装置,过滤得到待测液。
优选地,步骤S02中,人体呼出气流经吸附装置的流速在5-1000ml/min之间。
优选地,步骤S01中,用预处理后的气袋收集人体呼出气0.1L-10L。
优选地,预处理后的气袋的背景测试要求满足醛类物质以甲醛计≤0.1ug,酮类物质以丙酮计≤0.25ug。
优选地,洗脱剂为甲醇、乙腈中的一种或两种混合;洗脱剂洗脱后,过滤并用洗脱剂定容至2ml待测。
优选地,步骤S03中,检测前,先配置待测液的混合标准溶液,混合标准溶液为醛酮-DNPH标准溶液,用液相色谱-串联质谱仪对混合标准溶液进行测定,得到混合标准溶液中,以混合标准溶液中每个对应的醛酮标记物的浓度含量为横坐标,对应的测定出来的峰面积为纵坐标作图绘制线性回归工作曲线,并以3倍的信噪比处的量作为检测限,以9倍的信噪比处的量作为定量限。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1、本发明检测方法的灵敏高,最低可定量的呼出气醛酮低至0.05ng/L(以醛酮计,3L呼出气)。稳定性好,所有醛酮标记物的RSD%都控制在5%以内(标准质控所有标记物)。精密度高,不同时间测试定量结果所有标记物相对标准偏差都控制在15%以内(标准质控所有标记物)。
2、本发明针对人体呼出气中醛酮类含量的定量检测,即使人体呼出气中醛酮类的含量很小,也可以检测得到。
3、本发明的需要对气袋进行预处理,是为了防止气袋内的残留有醛酮类物质或者其他会影响检测准确度的物质,故采用惰性气体将气袋清洗干净。
4、本发明的气袋在收集人体呼出气后,进行加热恒温处理,再以该温度流经吸附采样管,在40-70℃之间,吸附采样管能够尽可能的选择性吸附人体呼出气中的醛酮类物质,有利于醛酮类物质尽可能的和衍生试剂发生反应,从而后续的检测结果更准确。
5、本发明的衍生试剂选用2,4-二硝基苯肼,2,4-二硝基苯肼能够吸附在固定相上,且气态挥发性醛酮类物质能与涂渍在固定相上的衍生试剂发生化学反应且具有持续性,生成的产物能够从固定相上洗脱下来。
6、本发明的反应选择性高,吸附采样管只能选择性吸收醛酮类物质,而不会吸收人体呼出气中的其他物质,只针对醛酮类物质,故最后定量检测的结果更为准确。
7.本发明能够准确定量人体呼出气中极低含量的醛酮物质。如果不进行选择性的富集吸收很难进行准确定量检测,与此同时采用选择性采样管衍生吸附后,能够达到准确定量的目的,也能排除呼出气其他其他杂质的干扰问题,同时达到同一种醛酮物质在不同人体呼出气中的吸附效率是一致的。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的描述,但本发明并不限于这些实施例。
吸附装置包括但不限于吸附采样管。
吸附采样管的制备
将2,4-二硝基苯肼(DNPH)用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为3%的涂渍液;再将固定相填料200mg填充到空白吸附柱上;最后将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上,涂渍方法采用直接涂渍法进行。涂渍前先用乙腈润洗空白吸附柱,负压固相萃取系统除去润洗的乙腈试剂,然后将3%的涂渍液直接涂渍在吸附柱上,涂渍饱和后采用负压固相萃取系统除去多余的涂渍液,制成能够进行选择性吸附呼出气醛酮类物质的选择性吸附柱,用氮气吹干吸附柱并在4℃下密封保存待用。制备过程中需要在低醛酮环境中进行,要求以甲醛计≤0.1ug,以丙酮计≤0.25ug。固定相可以选用硅胶填料、C18填料和弗洛里硅藻土填料中的一种或任意组合。
气袋的预处理
先对气袋进行预处理,气袋可以是泰德拉气袋或者nalophen或者PFV或者其他材质的气袋。
将气袋放入恒温控制箱中,温度设定在60℃之间,再往气袋内充入氮气,氮气在气袋内停留3-5分钟,再抽出氮气,重新通入氮气,反复4次后,进行气袋的清洁验证。
改变温度、清洗次数、通入的气体,其他步骤同上。
气袋的清洁验证:气袋清洗完成后,充入3L的氮气,加热50℃恒温条件下,用吸附采样管吸收,将袋子的气体全部吸收完成,吸附采样管用溶剂洗脱并定容至2ml过滤测试背景,背景测试满足要求后(采样袋背景中测定的标记物定量结果醛类物质以甲醛计,换算后结果以甲醛计≤0.1ug,酮类物质以丙酮计,换算后结果以丙酮计≤0.25ug),袋子才能使用。
实验证明:当温度在60-80℃,往气袋内通入氮气或者氦气,在气袋内停留30分钟,抽出再通入,反复4-8次,其背景测试均能满足要求。
实施例1
人往气袋内吹入气体,气袋收集人体呼出气3L,对收集到的人体呼出气随气袋一起进行加热处理,将温度控制在40℃,控制精度要求±0.5℃。
在40℃的温度下,将人体呼出气全部以20mL/min的流速流经吸附采样管,吸附采样管的温度也控制在40℃,控制精度要求±0.5℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的醛酮类物质。
再用洗脱剂甲醇洗脱吸附采样管,洗脱后的溶液过滤,并用甲醇定容至2ml作为待测液,液相色谱-串联质谱联用仪对待测液进行检测。
实施例2
人往气袋内吹入气体,气袋收集人体呼出气9L,对收集到的人体呼出气随气袋一起进行加热处理,将温度控制在55℃,控制精度要求±0.5℃。
在55℃的温度下,将人体呼出气全部以60mL/min的流速流经吸附采样管,吸附采样管的温度也控制在55℃,控制精度要求±0.5℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的醛酮类物质。
再用洗脱剂乙腈洗脱吸附采样管,洗脱后的溶液过滤,并用乙腈定容至2ml作为待测液,液相色谱-串联质谱联用仪对待测液进行检测。
实施例3
人往气袋内吹入气体,气袋收集人体呼出气15L,对收集到的人体呼出气随气袋一起进行加热处理,将温度控制在70℃,控制精度要求±0.5℃。
在70℃的温度下,将人体呼出气全部以100mL/min的流速流经吸附采样管,吸附采样管的温度也控制在70℃,控制精度要求±0.5℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的醛酮类物质。
再用洗脱剂(甲醇乙腈的混合物,任意配比)洗脱吸附采样管,洗脱后的溶液过滤,并用洗脱剂(甲醇乙腈的混合物,任意配比)定容至2ml作为待测液,液相色谱-串联质谱联用仪对待测液进行检测。
液相色谱-串联质谱联用仪对待测溶液的检测
1、标准溶液的制备(外标法)
共有25种标记物,制备25种标准溶液,混合得到混合标准溶液。
测试人体呼出气中的醛酮物质前,在恒定的条件下需要将这些挥发性醛酮物质通过化学反应,将其转化成另一种物质后再进行测试。利用2,4-二硝基苯肼(DNPH)或者其他含有(R-NH-NH2,R代表不同的化学基团)与醛酮发生腙化反应的特性,来选择性测试呼出气的醛酮成分。故选用醛酮-DNPH标准溶液作为本发明的标准溶液,如表1所示。
表1 25种标记物及其对应的醛酮类物质
标准溶液的名称代表是该种标准溶液是由对应的醛酮和DNPH进行反应,标记物的分子式表示对应的醛酮和DNPH进行腙化反应得到物质即为标记物,其分子式和反应的摩尔比如表1中所示。
实验选择的标准溶液单标购自国家标准物质网(北京世纪奥科生物技术有限公司)。所有配置的标记物都是购买的以醛酮计(相当于定量结果为实际对应的醛酮)的液体标准溶液。如果需要以醛酮-DNPH计需要乘以各标记物对应的换算系数。
将上述25种标准溶液混合,用液相色谱-串联质谱联用仪对标准溶液进行检测,以混合标准溶液中每个对应的醛酮标记物的浓度含量为横坐标,对应的测定出来的峰面积为纵坐标作图绘制线性回归工作曲线。表2为任选的8种标记物外标曲线浓度点范围。
表2任选的8种标记物外标曲线浓度点范围
测试时,设置的仪器参数如表3所示:
表3任选的8种标记物仪器参数
本发明方法检测的灵敏度高(最低可定量的呼出气醛酮低至0.05ng/L(以醛酮计,3L呼出气)。稳定性好,所有醛酮标记物的RSD%都控制在5%以内(标准质控所有标记物)。精密度高,不同时间测试定量结果所有标记物相对标准偏差都控制在15%以内(标准质控所有标记物)。表4为标记物质控日内定量结果的稳定性测定结果;表5为标记物质控日间定量结果的稳定性测定结果。
表4标记物质控日内定量结果的稳定性测定结果
表5标记物质控日间定量结果的稳定性测定结果
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (9)
1.一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S01:收集人体呼出气;
S02:将人体呼出气通入附着有衍生试剂的吸附装置,用洗脱剂洗脱吸附装置,得到待测液;
S03:对待测液进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,所述的吸附装置为吸附采样管,所述的吸附采样管采用如下步骤制备:
(1)将衍生试剂用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为3%的涂渍液;
(2)将固定相填料填充到空白吸附柱上;
(3)将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上,最后用氮气吹干,4℃密封冷藏保存;
所述的衍生试剂的化学式为R-NH-NH2,制备过程中在低醛酮环境中进行,要求以甲醛计≤0.1ug,以丙酮计≤0.25ug。
3.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,所述的衍生试剂为2,4-二硝基苯肼。
4.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,步骤S02中,对收集的人体呼出气进行加热恒温处理,处理的温度在40-70℃之间,然后以恒定的流速流经吸附装置,再用洗脱剂洗脱吸附装置,过滤得到待测液。
5.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,步骤S02中,人体呼出气流经吸附装置的流速在5-1000ml/min之间。
6.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,步骤S01中,用预处理后的气袋收集人体呼出气0.1L-10L。
7.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,预处理后的气袋的背景测试要求满足醛类物质以甲醛计≤0.1ug,酮类物质以丙酮计≤0.25ug。
8.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,洗脱剂为甲醇、乙腈中的一种或两种混合;洗脱剂洗脱后,过滤并用洗脱剂定容至2ml待测。
9.根据权利要求1所述的一种人体呼出气中醛酮类物质含量的检测方法,其特征在于,步骤S03中,检测前,先配置待测液的混合标准溶液,混合标准溶液为醛酮-DNPH标准溶液,用液相色谱-串联质谱仪对混合标准溶液进行测定,得到混合标准溶液中,以混合标准溶液中每个对应的醛酮标记物的浓度含量为横坐标,对应的测定出来的峰面积为纵坐标作图绘制线性回归工作曲线,并以3倍的信噪比处的量作为检测限,以9倍的信噪比处的量作为定量限。
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