CN112255354A - 马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了马尔尼菲篮状菌病诊断特征物及其筛选方法和应用，属于生物科学技术领域；所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物包括甲醛、乙醛、2,5‑二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。通过对待检测患者的呼出气体中的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物进行检测，能够准确诊断患者患马尔尼菲篮状菌的情况，实现马尔尼菲篮状菌病的早期诊断。本发明的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物能够简单、高灵敏度并且无损的用于马尔尼菲篮状菌病患者诊断。

Description

马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其涉及马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用。

背景技术

马尔尼菲篮状菌病，旧称马尔尼菲青霉菌病，是由双相真菌马尔尼菲篮状菌(Talaromyces Marneffei，以下简称TM)引起的一种机会感染性致死性真菌病，多发病于免疫缺陷或免疫功能抑制者。近年来伴随着人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的增加，以及免疫抑制宿主的增多，马尔尼菲篮状菌病的发病率也逐年增长。马尔尼菲篮状菌病是可治疗的，但发病隐匿，早期不易察觉，极易误诊而延误治疗，导致死亡率高达80％。目前，马尔尼菲篮状菌病的诊断仍依靠传统的真菌培养和形态学鉴定，不能满足高效的大规模疾病普查。因此需要开发一种简单、高效、无损的早期诊断技术-呼气诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用，利用本发明的特征物能够实现马尔尼菲篮状菌病患者的高效无损诊断。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了马尔尼菲篮状菌病诊断特征物，包括甲醛、乙醛、2,5-二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。

本发明提供了检测上述方案所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的试剂在制备马尔尼菲篮状菌病诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了一种筛选上述方案所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的方法，包括以下步骤：

1)分别采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体，分别采用2,4-二硝基苯肼衍生小柱对所述呼出气体进行富集、洗脱，得到患病富集样品和健康富集样品，采用超高液相色谱-质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及含量，得到患病文库和健康文库；

2)采用主成分分析和正交偏最小二乘法模型分析所述患病文库和健康文库，通过变量投影重要性值筛选对患病文库和健康文库之间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物，其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。

优选的，步骤1)中采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体的装置包括连接有吹嘴的Tedlar采样袋。

优选的，步骤1)中所述富集采用的装置包括以下顺次连通的组件：脱臭氧小柱、2,4-二硝基苯肼衍生小柱和空气采样泵；所述Tedlar采样袋的出口与脱臭氧小柱的入口连通。

优选的，步骤1)中样品泵入所述2,4-二硝基苯肼衍生小柱内的流速为100mL/min。

优选的，步骤1)中所述超高液相色谱-质谱联用分析中超高液相色谱的条件包括：使用超高效液相色谱系统；

色谱柱为C18柱，规格为：100mm×2.1mm，1.7μmparticlesize；

所述C18柱达到平衡的温度为30℃；

流动相A为乙腈，流动相B为体积百分含量为0.01％的甲酸水溶液，流速为0.4mL/min；

梯度淋洗程序：洗脱液B从体积百分含量为50％开始5min内升至70％，再2min升至100％，平衡3min后0.2min内降至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为14min；

进样量为2μL。

优选的，所述超高液相色谱-质谱联用分析的质谱条件包括：

毛细管电压为3.0kV；

萃取器电压为2V；

源温度为120℃；

脱溶剂温度为350℃；

氮气流速为80L/h、脱氮气体流量为600L/h；

在碰撞单元中，以氩气作为碰撞气体，碰撞诱导离解的压力为4～103mbar。

本发明的有益效果：本发明提供了马尔尼菲篮状菌病诊断特征物，包括甲醛、乙醛、2,5-二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。通过对待检测患者的呼出气体中的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物进行检测，能够准确诊断患者患马尔尼菲篮状菌病的情况，实现马尔尼菲篮状菌病的早期诊断。本发明的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物能够简单、高灵敏度并且无损的用于马尔尼菲篮状菌病患者诊断。

附图说明

图1为马尔尼菲篮状菌患者呼出气中OVOCs浓度特征；

图2为马尔尼菲篮状菌病患者呼出气中OVOCs质量百分比；

图3为对照组呼出气中OVOCs浓度特征图；

图4为对照组呼出气中OVOCs质量百分比；

图5为马尔尼菲篮状菌病患者呼出气与对照组的PCA分析图；

图6为马尔尼菲篮状菌病患者呼出气中OVOCs的OPLS-DA分析图，其中，C1，甲醛；C2，乙醛；C3，丙醛；C4，丁醛；C5，戊醛；C6，庚醛；C7，辛醛；C8，壬醛；C9，环己酮；C10，苯甲醛；C11，2,5-二甲基苯甲醛；C12，癸醛；C13，丙烯醛；C14，邻甲基苯甲醛；C15，异戊醛；C17，辛醛；C17，丁酮；C18，丙酮；C19，对甲基苯甲醛。

具体实施方式

本发明提供了马尔尼菲篮状菌病诊断特征物，包括甲醛、乙醛、2,5-二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。

本发明提供了检测上述方案所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的试剂在制备马尔尼菲篮状菌病诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了一种筛选上述方案所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的方法，包括以下步骤：

1)分别采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体，分别采用2,4-二硝基苯肼衍生小柱对所述呼出气体进行富集、洗脱，得到患病富集样品和健康富集样品，采用超高液相色谱-质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及含量，得到患病文库和健康文库；

2)采用主成分分析和正交偏最小二乘法模型分析所述患病文库和健康文库，通过变量投影重要性值筛选对患病文库和健康文库之间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物，其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。

本发明分别采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体，分别采用2,4-二硝基苯肼衍生小柱对所述呼出气体进行富集、洗脱，得到患病富集样品和健康富集样品，采用超高液相色谱-质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及含量，得到患病文库和健康文库。

在本发明中，采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体的装置包括连接有吹嘴的Tedlar采样袋；所述Tedlar采样袋的规格优选为1L。所述富集采用的装置包括以下组件：脱臭氧小柱、2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生小柱和空气采样泵。本发明具体实施过程中，所述2,4-二硝基苯肼衍生小柱购自于天津博纳艾杰尔科技有限公司；所述脱臭氧小柱优选为购自于上海安谱实验科技股份有限公司的SEP-PAK脱臭氧小柱；在本发明的一个实施例中，为了防止的管穿透现象，优选采用两根DNPH衍生小柱串联。在本发明中，所述Tedlar采样袋依次和脱臭氧小柱、2,4-二硝基苯肼衍生小柱、空气采样泵连接；样品泵入DNPH衍生小柱内的流速优选为100mL/min。所述DNPH衍生小柱的作用是对Tedlar采样袋内的呼出气样品进行富集稳定；所述脱臭氧小柱的作用是脱除呼气中臭氧，以避免DNPH衍生物被臭氧分解。

本发明在富集气体后，优选的还包括将富集气体的DNPH衍生小柱密封存放于4℃环境内，并于24h内洗脱；所述洗脱采用的试剂优选乙腈；所述洗脱的方式优选为淋洗；所述乙腈的用量优选为5mL/DNPH小柱；所述洗脱液的流向与采样时气流方向相反。本发明优选用0.22μm滤膜对淋洗液过滤、浓缩，得到浓缩液，即为进样样品；所述浓缩的方式优选为使用氮吹仪以20mL/min的高纯氮气流速将5mL淋洗液浓缩至1mL；所述浓缩液存放于优选的1.5mL棕色进样瓶中；所述存放的温度优选为-20℃，30天内进行UPLC-MS分析。

得到进样样品后，本发明分别采用超高液相色谱和质谱联用的方法分析所述进样样品，得到进样样品的色谱图和质谱图。

在本发明中，所述超高液相色谱和质谱联用的方法的色谱条件优选为：使用超高效液相色谱系统；色谱柱为C18柱，规格为：100mm×2.1mm,1.7μmparticlesize；所述C18柱达到平衡的温度为30℃，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分含量为0.01％的甲酸水溶液，流速为0.4mL/min；

梯度淋洗程序：洗脱液B从体积百分含量为50％开始5min内升至70％，再2min升至100％，平衡3min后0.2min内降至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为14min，进样量为2μL。

在本发明中，所述超高液相色谱和质谱联用的方法的质谱条件优选为：使用购自于赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher)的U3000高效液相色谱仪和的QExactive三重四级杆轨道肼傅里叶转换高分辨质谱仪；采用电喷雾源以负模式运行；ESI参数为：毛细管电压为3.0kV、萃取器电压为2v、源温度为120℃、脱溶剂温度为350℃、氮气流速为80L/h、脱氮气体流量为600L/h；在碰撞单元中，以氩气作为碰撞气体，碰撞诱导离解的压力优选为为4～103mbar。

得到进样样品的超高液相-质谱检测结果后，本发明根据进样样品的超高液相-质谱检测结果和标准曲线，得到进样样品中含氧挥发性有机物的种类及含量，得到患病文库和健康文库。

在本发明中，所述标准曲线的建立方法优选的包括：

将标准溶液进样到超高液相色谱中进行检测，得到标准色谱；

将标准色谱的峰面积与浓度进行线性拟合，得到标准曲线。

在本发明中，所述标准溶液含有20种OVOCs的2,4-二硝基苯腙混合标准试剂，所述OVOCs包括甲醛、乙醛、丙烯醛、丙醛、丁烯醛、甲基丙烯醛、丁醛、2-丁酮、苯甲醛、环己酮、戊醛、异戊醛、对甲基苯甲醛、间甲基苯甲醛、邻甲基苯甲醛、2,5-二甲基苯甲醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛。混合标准试剂中各成分的质量浓度分别优选为15μg/mL；所述混合标准试剂的溶剂优选为乙腈，配置质量浓度分别为0.006、0.024、0.12、0.6、1、3、5μg/mL的混合OVOCs-2,4-二硝基苯腙标准溶液系列；OVOCs与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙，按色谱条件进行测定，以OVOCs-2,4-二硝基苯腙的色谱峰面积为横坐标，与OVOCs-2,4-二硝基苯腙相对应OVOCs的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性相关系数R²。

对标准样品的超高液相-质谱检测与上述技术方案所述进样样品的超高液相-质谱检测一致，在此不再赘述。

本发明在采集第一呼出气体或采集呼出气体的过程中，马尔尼菲篮状菌病患者或健康人用清水漱口，深呼吸三次后深吸一口气并吐出一小部分气，对准一次性吹嘴将气体吹入苏玛罐或采样气袋，由采样者把控开关，停止吹气后患者可示意采样者关闭苏玛罐/气袋开关，然后患者可将一次性吹嘴从口中拿出。每个样品采集三个平行样，同时采集室内环境样；所述马尔尼菲篮状菌病患者的数量优选为3名；所述健康人的数量优选为4名；每名马尔尼菲篮状菌病患者或者健康人在治疗前进行两次连续取样，每次取样持续的时间为3d；取样的频率优选为1次/天；两次连续取样的间隔时间优选为4d。

得到患病文库和健康文库后，本发明采用主成分分析和正交偏最小二乘法模型分析所述患病文库和健康文库，通过变量投影重要性值(VIP值)筛选患病文库和健康文库之间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物，其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。

本发明提取UPLC-MS分析得到马尔尼菲篮状菌病患者和健康对照组的呼气中20种OVOCs浓度值，采用PCA与OPLS-DA模型进行多元统计分析，建立Logistic回归模型。通过OPLS-DA模型的变量投影重要性值(VIP)判别分析马尔尼菲篮状菌病患者与健康对照组之间含氧挥发性有机物的对其差异的贡献大小，变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。

本发明在得到马尔尼菲篮状菌病诊断特征物后，优选的还包括将所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物使用二元Logistic回归模型判断特征性OVOCs预测病人患病的可能性。对马尔尼菲篮状菌病患者和健康对照组进行赋值，患病为1，未患病为0，判别模型的灵敏度和特异性。后进行受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析，评估特征性OVOCs筛查的准确性。

本发明中所使用的术语“早期呼气诊断”是指确认病理状态的存在或特征。就本发明的目的而言，诊断用于确认是否属于肺部马尔尼菲篮状菌感染，可在早期确认患者是否发生感染。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例共采集了3位马尔尼菲篮状菌患者，分别为TM1、TM2和TM3。本实施例通过采集他们的呼出气VOCs，经DNPH小柱衍生化富集定容后，经过高效液相色谱-质谱联用仪分析，共得到19种OVOCs的浓度特征，如图1所示。

具体方法为：由于呼出气中的含氧挥发性有机物(OVOCs)活性高，不稳定，不适合长时间存放，因此，需对样品进行现场富集稳定，然后采用UPLC-MS对呼出气中OVOCs进行分析。采用经过清洗后的Tedlar采样袋(1L)采集马尔尼菲篮状菌病者呼气样品，采用商业化的DNPH(2,4-二硝基苯肼)衍生小柱对采集在气袋内的呼气样品进行现场富集。衍生实验采用了两根DNPH小柱串联。采样时应在DNPH吸附管前串联一只SEP-PAK脱臭氧小柱，以脱除呼气中臭氧，前端连接气体样品，后端连接空气采样泵，采样流速为100mL/min。采集后的小柱密封存放于4℃恒温箱内运回实验室24h内洗脱，洗脱实验采用5mL乙腈淋洗，洗脱液的流向应与采样时气流方向相反，并用0.22μm滤膜对洗脱液过滤，并使用氮吹仪以20mL/min的高纯氮气流速将淋洗液浓缩至1mL，然后将样品存放于1.5mL棕色进样瓶中-20℃冷冻保存，30天内进行UPLC-MS分析。

采样过程中，采样者先向患者示范采样过程，患者用清水漱口，深呼吸三次后深吸一口气并吐出一小部分气，对准一次性吹嘴将气体吹入苏玛罐/气袋，由采样者把控开关，停止吹气后患者可示意采样者关闭苏玛罐/气袋开关，然后患者可将一次性吹嘴从口中拿出。每个样品采集三个平行样，同时采集室内环境样。共采集两名马尔尼菲篮状菌病患者呼气样品，每名患者在治疗前连续同一时间采集三天，即周一至周三，每天采集一次，然后再于次周周三采集，重复两次采样。并采集护士及健康学生志愿者呼气作为对照组。

UPLC-MS标准曲线：

标准溶液含有20种OVOCs-2,4-二硝基苯腙混合标准试剂，混合标液各成分对应醛酮质量浓度均为15μg/mL。以乙腈为溶剂，配置质量浓度分别为0.006；0.024；0.12；0.6；1；3；5μg/mL的混合OVOCs-2,4-二硝基苯腙标准溶液系列；按色谱条件进行测定，以OVOCs-2,4-二硝基苯腙的色谱峰面积为横坐标，与OVOCs-2,4-二硝基苯腙相对应OVOCs的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性相关系数R²，如表1所示。从表中可以看出，各标准物质的检测限均较低，在1～100ppt范围内，满足本实施例测试需求。

表1. 20种OVOCs的标准工作曲线及方法检出限

色谱分析使用UPLC系统，色谱柱为C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm particlesize)。C18柱在30℃时达到平衡，流动相为乙腈和0.01％甲酸水，流速为0.4mL/min。梯度淋洗程序洗脱液B从50％开始5min内升至70％，再2min升至100％，平衡3min后0.2min内降至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为14min。进样量为2μL。

质谱分析使用赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher)的QExactive三重四级杆轨道肼傅里叶转换高分辨质谱仪(QE)。该仪器采用电喷雾(ESI)源以负模式运行。ESI参数为：毛细管电压3.0kV、萃取器电压2v、源温度120℃、脱溶剂温度350℃、氮气流速80L/h、脱氮气体流量600L/h。在碰撞单元中，以氩气作为碰撞气体，在4～103mbar的压力下进行碰撞诱导离解。

从图1中可以看出，这三位马尔尼菲篮状菌患者的呼出气中，浓度较高的五种OVOCs分别为丙酮，甲醛，乙醛，壬醛和2,5-二甲基苯甲醛。

实施例2

本实施例将把图1的质量浓度转化为质量浓度占比，筛选出质量浓度占比较高的5种OVOCs，分别为丙酮，壬醛，甲醛，乙醛和2,5-二甲基苯甲醛，如图2所示。此外，环己酮和癸醛含量也相对较高。

实施例3

本实施例一共选取了4名学生作为对照组，分别命名为Student1，Student2，Student3和Student4。采取与马尔尼菲篮状菌患者同样的采样条件和分析条件，获得了4位对照组的OVOCs浓度特征图，如图3所示。从图中可以看出，对照组中浓度较高的OVOCs含有丙酮，壬醛，环己酮，苯甲醛，辛醛和庚醛。此外，也含有一定量的庚醛和丙醛。

实施例4

本实施例将把图3的质量浓度转化为质量浓度占比，如图4所示。从图中可以看出，丙酮的占比最高，超过76％，与马尔尼菲篮状菌患者的丙酮含量相比，可以看出，无论是病人还是对照组，其呼出气中都含有大量的丙酮。其次，对照组中还含有大量的壬醛。

实施例5

为了筛选出潜在的马尔尼菲篮状菌患者的OVOCs特征物，本实施例进行了PCA分析，如图5所示。从图中可以看出，马尔尼菲篮状菌病患者中的OVOCs可以与对照组中的OVOCs很好的区分开。

实施例6

本实施例进一步对已分析到的马尔尼菲篮状菌病患者和对照组呼气中的OVOCs进行特征物筛选，图6表示出了本实施例中肺癌患者和对照组呼气VOCs运用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)模型得到的变量投影重要性值(VIP值)图，其中，C1，甲醛；C2，乙醛；C3，丙醛；C4，丁醛；C5，戊醛；C6，庚醛；C7，辛醛；C8，壬醛；C9，环己酮；C10，苯甲醛；C11，2,5-二甲基苯甲醛；C12，癸醛；C13，丙烯醛；C14，邻甲基苯甲醛；C15，异戊醛；C17，辛醛；C17，丁酮；C18，丙酮；C19，对甲基苯甲醛。VIP值越大，表明该物质对模型区分肺癌患者和健康对照组的贡献越大。从图6中可以看出，其中权重值大于1.5的物质有甲醛，乙醛，2,5-二甲基苯甲醛和环己酮。这也与之前对马尔尼菲篮状菌患者呼出气中OVOCs质量浓度占比分析相吻合，本实施例认为马尔尼菲篮状菌患者呼出气中的OVOCs特征物为甲醛，乙醛，2,5-二甲基苯甲醛和环己酮。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.马尔尼菲篮状菌病诊断特征物，包括甲醛、乙醛、2,5-二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。

2.检测权利要求1所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的试剂在制备马尔尼菲篮状菌病诊断试剂盒中的应用。

3.一种筛选权利要求1所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的方法，包括以下步骤：

1)分别采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体，分别采用2,4-二硝基苯肼衍生小柱对所述呼出气体进行富集、洗脱，得到患病富集样品和健康富集样品，采用超高液相色谱-质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及含量，得到患病文库和健康文库；

2)采用主成分分析和正交偏最小二乘法模型分析所述患病文库和健康文库，通过变量投影重要性值筛选对患病文库和健康文库之间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物，其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体的装置包括连接有吹嘴的Tedlar采样袋。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述富集采用的装置包括以下顺次连通的组件：脱臭氧小柱、2,4-二硝基苯肼衍生小柱和空气采样泵；所述Tedlar采样袋的出口与脱臭氧小柱的入口连通。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，样品泵入所述2,4-二硝基苯肼衍生小柱内的流速为100mL/min。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述超高液相色谱-质谱联用分析中超高液相色谱的条件包括：使用超高效液相色谱系统；

色谱柱为C18柱，规格为：100mm×2.1mm，1.7μmparticle size；

所述C18柱达到平衡的温度为30℃；

流动相A为乙腈，流动相B为体积百分含量为0.01％的甲酸水溶液，流速为0.4mL/min；

梯度淋洗程序：洗脱液B从体积百分含量为50％开始5min内升至70％，再2min升至100％，平衡3min后0.2min内降至50％，平衡时间为3.8min，总运行时间为14min；

进样量为2μL。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述超高液相色谱-质谱联用分析的质谱条件包括：

毛细管电压为3.0kV；

萃取器电压为2V；

源温度为120℃；

脱溶剂温度为350℃；

氮气流速为80L/h、脱氮气体流量为600L/h；

在碰撞单元中，以氩气作为碰撞气体，碰撞诱导离解的压力为4～103mbar。

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