CN104919318A - 利用呼出气体的肺癌的非侵入性检测 - Google Patents
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Abstract
提供一种检测或筛查对象样本中肺癌的非侵入性方法。该方法包括检测来自对象样本的呼出气体中为肺癌生物标志物的一种或更多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC)的升高水平。该方法还可以包括从对象样本获得呼出气体;形成含羰基的VOC与反应性化合物的加合物;对含羰基的VOC的加合物进行定量以确定每一种加合物的对象值;和比较每个对象值与含羰基的VOC的每一种加合物的健康样本阈值。数量上大于健康样本阈值的一个或更多个对象值也可用于对象样本中肺癌的筛查。
Description
政府资助支持条款
本发明是在由国家科学基金授予的资助奖金1159829号的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定权利。
相关申请的交叉引用
根据37 C.F.R.§1.78(a),本申请要求2013年8月28日提交的在先提交且同样未决的临时申请第61/871,024号的利益和优先权,其明确地通过引用完整地并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测和筛查癌症的非侵入性方法,更具体地涉及用于检测和筛查肺癌疾病的非侵入性方法。
背景技术
肺癌是世界范围的死亡的主要原因,但是肺癌的早期检测是提高肺癌患者生存率的关键因素。目前,CT和支气管镜检是通过识别肺部结节以用于肺癌检测的主要技术,如果满足特定的预定标准,则对肺部结节进行侵入性活检以确定结节的病理学。最近的美国国家肺癌筛查试验发现重度吸烟者的定期计算机化断层显像(CT)筛查可以降低肺癌死亡率多达20%。然而,发病率、成本和因追查非恶性的肺部结节和腺病而招致的偶然死亡率抵消了该益处。因此,随着用于肺癌的计算机化断层显像(CT)扫描筛查的出现和越来越多地被接受,区分良性与恶性胸内疾病的重要性不断增加。相应地,开发使不患有重大疾病的患者的诊断负担最小化同时加快实际患有肺癌的患者的治疗的可靠方法是重要的。
在近几年,因为呼出气体的分析对于非侵入性健康诊断的适用性,其已经成为国际研究前沿。已经开发了分析呼出气体的几种方法,包括例如使用传感器阵列、质子转移反应质谱(PTR-MS)、选择离子流动管质谱(SIFT-MS)和气相-质谱(GC-MS)。尽管呼出气体中一些挥发性有机化合物(VOC)已经被报道为潜在的肺癌生物标志物,但是因为缺少用于可靠地预测肺癌疾病状态的癌症特定VOC标记,所以还没有临床采用用于诊断的呼气分析方法。
此外,在已经在人类呼气中识别了超过1700种内源性挥发性有机化合物(VOC)的情况下,分析呼出气体的癌症指示生物标志物、即排出的代谢产物是个艰巨的任务。另外,这些内源性VOC中许多以小于用于检测和/或识别它们的检测方法的实验误差的量存在于呼出气体中。例如,呼气中的许多VOC范围为万亿分之几(ppt)至十亿分之几(ppb)浓度;呼气样品中的许多化学物质的浓度是有效VOC、如水蒸气和二氧化碳的浓度的数百万倍,可能需要将它们去除以避免使多数分析仪器不能使用。另外,呼气是化学上多种多样的混合物,其含有醇、酮和醛的类似物/同系物/同分异构混合物,这使得疾病生物标志物的识别复杂化;且呼气中的VOC可能包含非代谢成分,这可能在呼气分析中引入错误的生物标志物。
因此,为了有效且准确地分析呼气中的VOC以检测或识别疾病状态,有多个障碍要克服。要克服的第一障碍是所关注VOC的浓缩。从稀的气体样品中浓缩一种或更多种所关注VOC的一般方法集中在以下之一:化学方法、低温方法和吸附方法。第二障碍是识别生物标志物之间的特定关系和/或特定生物标志物的量,这可能与疾病状态的存在的高度确定性、低概率的假阴性相关。
因此,考虑到检测/识别和筛查肺癌的传统方法的缺点和挑战,存在对新的非侵入性方法的需求。
发明内容
本发明的实施方案提供用于检测或筛查肺癌的方法。
根据本发明的一个实施方案,提供用于检测或筛查对象样本中的肺癌疾病状态的非侵入性方法。该方法包括对来自对象样本的呼出气体中为肺癌生物标志物的一种或更多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC)的水平进行定量,和如果一种或更多种含羰基的VOC的水平升高至高于其各自的健康样本阈值,则将该对象样本诊断为具有肺癌疾病状态的可能性。在一个实施方案中,含羰基的VOC是由脱水反应形成的反应性化学物质的加合物。含羰基的VOC生物标志物选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛。升高的生物标志物的数量与肺癌的可能性相关,意思是越多升高的生物标志物涉及增加的肺癌可能性。
根据另一个实施方案,提供筛查对象样本中的肺癌疾病状态的方法,该方法包括以下步骤:从对象样本获得呼出气体,其中所述呼出气体包含多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC);形成多种含羰基的VOC与反应性化合物的加合物;对多种含羰基的VOC中每一种的每一种加合物进行定量以确定每一种加合物的对象值;和将每个对象值与多种含羰基的VOC的加合物中每一种的健康样本阈值进行比较以确定数量上大于其各自健康样本值范围的一种或更多种对象值的存在,由此指示对象样本中肺癌疾病状态的实质可能性,健康样本阈值对应于由健康样本计算的值。适合于使用本文所述方法的检测的肺癌的示例性类型包括但不限于小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞癌和腺癌。在其他实施方案中,两种或更多种、或三种或更多种、或四种或更多种对象值升高至高于它们各自的健康样本值。
根据另一个实施方案,提供检测对象样本中的肺癌疾病状态的非侵入性方法,该方法包括以下步骤:浓缩从对象样本获得的呼出气体中所包含的多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC),其中所述多种含羰基的VOC选自:2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛,所述含羰基的挥发性有机化合物与反应性化合物形成加合物;对多种含羰基的VOC的加合物进行定量以确定多种含羰基的VOC的加合物中的每一成员的对象值;和将多种含羰基的VOC的加合物中的每一成员的对象值与多种含羰基的VOC的加合物中的每一成员的健康样本阈值进行比较以确定数量上大于其各自健康样本值范围的一种或更多种对象值的存在,由此指示对象样本中肺癌疾病状态的实质可能性。在另一个实施方案中,两种或更多种、或三种或更多种、或四种或更多种对象值升高至高于它们各自的健康样本值。在另一个实施方案中,多种含羰基的VOC选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮和4-羟基-2-己烯醛。
根据另一个实施方案,如以下更详细描述的,通过对呼出气体中的4-羟基-2-壬烯醛和/或C5H10O化合物的混合物进行定量可以区别各种类型的肺癌,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛,和/或通过对呼出气体中的2-丁酮进行定量可以指示癌症疾病状态的分期。
附图说明
并入本说明书并构成其一部分的附图示出了本发明的实施方案,并且与以上给出的本发明的一般说明和以下给出的详细说明一起用来说明本发明。
图1是根据本发明的一个实施方案的用于浓缩空气样品或气态呼气样品中含羰基的VOC的示意设置。
图2A是示出适合于在图1中所示的示意图中使用的连接至两个熔融石英管的预浓缩器;该预浓缩器显示为放置在美国一角硬币上以指示其尺寸。
图2B是示出在图2A中所示的预浓缩器内的微柱阵列的扫描电子显微照片。
图3是通过分析从(a)肺癌患者、(b)吸烟者对照和(c)非吸烟者对照获得的呼气样品得到的三个FT-ICR-MS谱图的比较。
图4A是示出未患癌症的对象和患有疾病进展不同阶段的NSCLC的对象的呼出气体中2-丁酮之间的关系的箱线图。
图4B是示出未患癌症的对象和患有不同类型肺癌的对象的呼出气体中4-羟基-2-己烯醛(4-HHE)之间的关系的箱线图。
图5A是示出未患癌症的对象和患有SCLC和NSCLC的对象的呼出气体中C5H10O(其包括2-戊酮和戊醛)之间的关系的箱线图。
图5B是示出未患癌症的对象和患有SCLC和NSCLC的对象的呼出气体中4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)之间的关系的箱线图。
图6是示出非吸烟者对象对照(NS)、吸烟者对象对照(SC)和患有I期(SSI)至IV期(SSIV)的NSCLC的对象的呼出气体样品中4-HHE的浓度的箱线图。
图7A-7D是示出非吸烟者对象对照(NS)、吸烟者对象对照(SC)和患有NSCLC和SCLC的对象的呼出气体样品中2-丁酮(图7A)、3-羟基-2-丁酮(图7B)、2-羟基-乙醛(图7C)和4-羟基-2-己烯醛(图7D)的浓度的箱线图。
图8是在癌症切除术之前和之后来自肺癌对象的呼气样品的FT-ICR-MS谱图。
图9是肺癌相对于良性肺组的九种含羰基的VOC的受试者工作曲线(ROC)分析。
图10是肺癌相对于健康非吸烟者对照的九种含羰基的VOC的ROC分析。
图11是肺癌相对于健康吸烟者对照的九种含羰基的VOC的ROC分析。
具体实施方式
根据本发明的一个实施方案,提供用于检测或筛查对象样本中的肺癌疾病状态的方法。
在一个实施方案中,方法包括检测来自对象样本的呼出气体中为肺癌生物标志物的一种或更多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC)的水平,和如果一种或更多种含羰基的VOC的水平升高至高于其各自的健康样本阈值,则将该对象样本诊断为具有肺癌疾病状态的可能性。在一个优选实施方案中,分析含羰基的VOC的加合物。加合物是通过与反应性化学物质的脱水反应形成的,并且有利地允许在分析测试之前预浓缩呼出气体中的含羰基的VOC。根据本发明的实施方案,含羰基的VOC生物标志物选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛。升高的生物标志物的数量与肺癌的可能性相关,意思是越多升高的生物标志物涉及增加的肺癌可能性。
在另一个实施方案中,方法包括以下步骤:从对象样本获得呼出气体,其中呼出气体包含多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC);形成多种含羰基的VOC与反应性化合物的加合物;对多种含羰基的VOC中每一种的每一种加合物进行定量以确定每一种加合物的对象值;和将每个对象值与多种含羰基的VOC的加合物中每一种的健康样本值范围进行比较以确定数量上大于其各自健康样本值范围的至少三种对象值的存在,由此指示对象样本中肺癌疾病状态的实质可能性,健康样本值范围对应于由健康样本计算的值。适合于使用本文所述方法的检测的肺癌的示例性类型包括但不限于小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞癌和腺癌。
根据本发明的实施方案,多种含羰基的VOC生物标志物选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛(“4-HHE”)、4-羟基-2-壬烯醛(“4-HNE”)和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛。
如本文中所使用的,“健康样本”定义为不具有任何肺部结节(如通过CT扫描指示的)并且不具有可诊断的肺癌疾病状态的样本。
如本文中所使用的,“对象样本”定义为为了诊断或筛查肺癌疾病状态的存在/不存在而由其获得呼出气体样品的样本。可以使用计算机断层显像(CT)预先筛查对象样本,其中检测到可疑的病变或结节,有利的是利用高于其各自健康样本阈值的两种或更多种、或三种或更多种生物标志物值的更高特异性(真阴性)测试。为了筛查,可能没有使用CT扫描对对象样本进行筛查,但对象样本可能具有其他风险因素(例如,吸用烟草),并且有利的是利用高于其各自健康样本阈值的一种或更多种生物标志物值的更高选择性(真阳性)测试。
如本文中所使用的,“健康样本阈值”意思是通过对多个健康样本进行测试方法所确定的值,其中对象值超过确定的健康样本阈值指示肺癌疾病状态。
如本文中所使用的,“肺癌疾病状态的实质可能性”意思是基于测试方法的置信水平,肺癌疾病状态在对象样本中存在的可能性为约80%或更大,而“肺癌疾病状态的可能性”意思是基于测试方法的置信水平,肺癌疾病状态在对象样本中存在的可能性为约50%或更大。当然,还预期了可能性的中间水平,例如约60%或更大,或约70%或更大。
如本文中所使用的,“加合物”或“结合物”表示反应性化合物与含羰基的VOC肺癌生物标志物的反应产物。这些加合物通过醛或酮的脱水反应形成,这使挥发性肺癌生物标志物转化成非天然的、非挥发性化合物。
如上文之前所述的,呼气分析是具有使疑似肺癌的病情检查简化的潜力的开发中的模式。然而,直至本发明的发现,由于多种因素,如所涉及含羰基的VOC生物标志物化合物的极低的浓度,这些化合物的分离方法复杂,和缺少对临床医生有用的诊断算法,还没有方法证实临床实用性。肺癌患者的呼气分析的先前报道已经产生了令人困惑的一系列广泛不同的化合物和数据图,并且还没有确定呼气分析的诊断实用性。然而,本发明的实施方案专注于选择含羰基的VOC,例如2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛。
根据本发明的实施方案,检测肺癌的方法包括选择性捕获和浓缩特定肺癌生物标志物,即含羰基的VOC,这可以通过使呼出气体穿过化学预浓缩器组合件10来实现,化学预浓缩器组合件10包括化学预浓缩器15,所述化学预浓缩器15具有允许呼出气体样品从其中穿过的入口17和出口19,如图1中所示的。组合件10还包括可充气的聚合物膜装置25,其可以流畅地耦接至在化学预浓缩器15的入口17之前的流量计35。化学预浓缩器15的出口19可以流畅地耦接至压力计40、阀门45和真空泵50,如下文更详细地描述的。
可以将来自对象样本的一个或更多个呼出气体的样品收集在可充气聚合物膜装置25中。适合于呼出气体样品收集的一个示例性可充气聚合物膜装置是一升的气体取样袋(Sigma-Aldrich Co.,LLC,圣路易斯,MO),其包括阀门。关于样品收集,对象可以通过阀门直接呼气到气体取样袋中,这提供了非侵入性收集技术。
流量计35不特别地限于任何特定类型的流量计。有利地,流量计35应当能够准确地测量进入化学预浓缩器15的气体的体积,这可以允许对呼出气体样品中含羰基的VOC的浓度进行定量。
压力计40、阀门45和真空泵50同样地不特别地限于任何特定类型。真空泵50抽真空,通过调节阀门45可以调整真空泵50或使其与化学预浓缩器15隔离。压力计40可以用于指示真空泵50和整个化学预浓缩器组合件10的正常运行和/或操作。
如上所述,呼出气体中许多生物标志物的浓度水平低于许多标准分析技术的检测限。然而,利用醛和酮的羰基官能团与特定反应性化学物质的化学反应性,可以在分析之前预浓缩呼出气体中的含羰基的VOC。相应地,美国专利第8,663,581号中描述了可用于预浓缩呼出气体中的含羰基的VOC的一种合适的预浓缩器15,该专利完整地并入到本文中并在本文中对其进行进一步描述。应理解,尽管本文所述的本发明的实施方案中采用了在美国专利第8,663,581号的教导中实施的预浓缩器和方法,但是本发明不特别地限于此。可以利用其它预浓缩器装置和/或方法,只要装置和方法在预浓缩呼出气体中必需的含羰基的VOC以提供分析样品方面有效。
因此,根据一个实施方案,化学预浓缩器15可以包括支撑结构和在支撑结构表面上的反应性化合物的层。如本文中所使用的,短语“反应性化合物”包括通过共价键结合在一起的分子化合物和通过离子键结合在一起的盐。反应性化合物与含羰基的VOC形成结合物或加合物以影响收集和预浓缩。如本文中所使用的,“含羰基的”是指醛和酮。
一般地,反应性化合物包括能够与关注的VOC上的羰基官能团反应的反应性末端;能够在支撑结构的表面上可逆地进行层的形成的锚定部分,和在反应性末端和锚定部分之间的连接基团。如在以下式(I)中表示的,反应性末端包括与杂原子(Z)键合的氨基基团(NH2)、连接基团(L)和锚定部分(Y),其中Z、L和Y为以下所定义的。根据本发明的实施方案,反应性化合物具有根据式(I)的通式:
H2N—Z—L—Y 式(I)
其中,Z为NH、NR或O;L为连接基团;Y为二取代或三取代的N或P部分;R选自烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并且任选地含有一个或更多个杂原子。
根据一个实施方案,Y可以是–NR1R2、或–NR1R2R3、–PR1R2、–PR1R2R4,其中R1、R2、R4独立地选自烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一中都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子;和R3选自H、烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子。在一个替代实施方案中,R1与R2结合还可以形成杂环,例如哌啶或吗啉部分。
根据本发明的另一个实施方案,反应性化合物可以包含反应性末端、阳离子部分和它们之间的连接基团L。当Y是–NR1R2R3或–PR1R2R4时,反应性化合物是阳离子盐,其还可以包含为阴离子反离子的–A。相应地,阳离子部分可以包含阳离子氮、如铵离子,或阳离子磷、如鏻。
当Y是磷时,R1、R2和R4可以都是芳基基团,如苯基。当Y是氮时,R1、R2和R3可以是烷基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子。在一个替代实施方案中,当Y是氮时,R1、R2可以是烷基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子,和R3可以是H。
根据本发明的实施方案,反应性末端可以包含肼或氨基氧基团。例如,Z可以是氮,如NH或NR,由此形成肼末端。或者,Z可以是氧,由此形成氨基氧末端。肼或氨基氧末端形成反应性化合物的反应性官能团,并且因此,醛和酮经由脱水或缩合反应与肼或氨基氧官能团反应。因此,反应性化学物质的反应性末端和VOC的羰基官能团是形成含羰基的VOC肺癌生物标志物的加合物的缩合反应的互补反应剂。
根据本发明的实施方案,式(I)的反应性化合物之间形成的结合物或加合物为腙(当Z=N时)或肟(当Z=O时)。在任一个加合物形式中,共价键合使VOC固定到锚定部分,并由此在分析之前预浓缩含羰基的VOC肺癌生物标志物。
在反应性化合物中,连接基团L将反应性末端共价地键合至锚定部分。反应性化合物不特别地受限于其连接基团。然而,在反应性末端附近增加的取代会增加空间位阻并由此影响化合物的反应性。因此,如果需要的话,变化取代可以使得能够区分醛和酮分析物。根据本发明的实施方案,连接基团可以包括非离子片段,其可以是经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基、或醚。例如,连接基团L可以是乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基片段。连接基团L可以包括醚,例如聚乙二醇(PEG)。
当反应性化合物是盐时,反应性化合物的阴离子成员(A)是抵消带正电荷部分的带负电荷物质。根据另一个实施方案,A可以是强酸的共轭碱。例如,A可以是卤化物,如溴化物或氯化物。根据另一个实施方案,A可以是弱酸的共轭碱。例如,A可以是羧酸盐,如苯甲酸盐。在一个实施方案中,Z是O,Y是氮,并且反应性化合物具有根据式(II)的通式:
其中,L、R1、R2、R3和A为如上所定义的。在另一个实施方案中,R1、R2和R3中的至少一个为甲基基团,和A为卤化物。
还预期反应性化合物可以包含多个反应性末端。例如,R1、R2和R3中的至少一个可以是经取代的或未经取代的烷基,其包含至少两个杂原子,并具有-L1-Z-NH2的通式,其中L1为铵态氮和Z之间的连接基团。
如方案1中所示的,根据L为乙基时的式(II)的示例性反应性化合物(4)可以通过三步骤合成序列来实现。可以通过在Mitsunobu条件下首先用N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2)处理氨基醇(I)来将氨基醇(1)转化成相应的邻苯二甲酰保护的氨基氧铵盐(3),然后使用烷基卤化物(R3-X)进行季铵化反应以提供被保护的盐(3)。通过肼解去除邻苯二甲酰基团提供反应性化合物(4)。示例性反应性化合物在以下表1中示出。
方案1:氨基氧反应性化合物(4)的合成。
在又一个实施方案中,Z为O,Y为氮,并且反应性化合物具有根据式(III)的通式:
根据式(III)的反应性化合物可以通过省去方案1中所示合成序列中的季铵化步骤(2)来制备。例如根据L为乙基时的式(III)的示例性反应性化合物可以通过两步骤合成序列来实现。可以通过在Mitsunobu条件下首先用N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2)处理氨基醇(1)来将氨基醇(1)转化成其相应的邻苯二甲酰保护的氨基氧。通过肼解去除邻苯二甲酰基团提供根据式(III)的叔胺反应性化合物(4)。示例性叔胺反应性化合物为N-(2-(氨基氧)乙基)-吗啉(AMA)。
根据一个实施方案,叔胺基团可以被用作锚定基团。在一个替代实施方案中,可以通过用质子酸处理将叔胺反应性化合物转化成其盐。例如,可以将式(III)的叔胺反应性化合物溶解于合适的有机溶剂,并用酸处理以制备其中R3为H且A为酸的共轭碱的式(II)的反应性化合物。
反应性化合物可以溶解在一种或更多种溶剂中,然后沉积在支撑结构的表面上。溶剂不做特别限定,但是应当能够挥发并同时在支撑结构表面上留下反应性化合物。合适的溶剂包括极性质子溶剂、极性非质子溶剂或其组合。示例性的极性质子溶剂包括但不限于水和醇,如甲醇和/或乙醇。示例性的极性非质子溶剂包括但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和硝基甲烷。反应性化合物可以作为通过将反应性化合物与至少一种溶剂结合获得的液体来提供,然后施用到支撑结构的表面。移除溶剂,从而将反应性化合物作为层沉积在支撑结构的表面上。
根据本发明的实施方案,化学预浓缩器的支撑结构提供了在移除溶剂之后反应性化合物可以被保留其上的表面。有助于将反应性化合物保留在支撑结构的表面上的结合力是反应性化合物的锚定部分(例如氨基)和支撑结构表面上的官能团、如羟基之间的相互作用,如在下文进一步讨论的。
支撑结构的构造不特别地限定为任意的具体构造,但是当存在时,特征如入口和出口结构、形状和阵列图案可以影响反应性化合物捕获期望的化学分析物的效率。相应地,支撑结构可以构造为使表面积和流动动力学最优化。
参考图2A,提供了显示连接至两个熔融石英管的预浓缩器的照片,其显示为放置在美国一角硬币上以指示其尺寸。在图2B中,提供了显示在图2A中所示的预浓缩器内的微柱阵列的扫描电子显微照片。可以使用预浓缩器的其它表面构造。
支撑结构可以包含与反应性化合物相容并且基本上不溶于用于沉积化合物的溶剂媒介物的任何材料。更特别地,支撑结构的可以与支撑结构的底下部分相同或不同的表面可以包含选自介电材料和半导体的材料,其有助于使用MEMS技术来进行制造。例如,表面材料可以是硅、多晶硅、氧化硅、氮化硅、氧氮化硅、碳化硅、钛、氧化钛、氮化钛、氧氮化钛、碳化钛、铝、氧化铝、氮化铝、氧氮化铝、碳化铝、或其组合。有利地,反应性化合物对包含氧化硅、氧化钛、氧化铝或其组合的支撑结构表面表现出超常的结合。
支撑结构的表面可以影响用于将反应性化合物黏附至支撑结构的结合力。例如,晶片的硅表面的热氧化或二氧化硅的沉积可以控制微柱的SiO2表面上的静电电荷和/或硅烷醇基的密度。
化学预浓缩器15还可以包括围绕支撑结构的壳体,其中所述壳体具有入口17和出口19。根据一个实施方案,化学预浓缩器包括在支撑结构的表面处引导的气流导管。气流导管可以包括管状装置,其不附着到支撑结构,或者可以构建到支撑结构中。出口19和/或入口17可以构造成与取样泵耦接从而有助于将气态样品在壳体外侧的部分通过入口转移到壳体中。
反应性化合物可以通过任何合适的方法施用到支撑结构的表面。在一个实施方案中,使包含第一溶剂和反应性化合物的液体与支撑结构的表面接触,并且在减压下通过蒸发移除第一溶剂。如果需要的话,可以在真空炉中蒸发第一溶剂。例如,可以由溶解于约0.5mL第一溶剂的3.5mg反应性化合物来制备反应性化合物的稀溶液,所述第一溶剂仅仅用作载体溶剂。将约10μL至约20μL的稀溶液施用至预浓缩器,然后在减压下移除第一溶剂以将约0.07至0.14mg反应性化合物的装载量提供到预浓缩器中。在移除第一溶剂之后,化学预浓缩器就准备好用于浓缩含羰基的VOC生物标志物。
在实践中,使经测量的体积的呼出气体样品穿过化学预浓缩器,使得含羰基的VOC与保留在支撑结构的表面上的反应性化合物形成加成物,由此有效提供加成物的浓缩样品。在暴露被中断之后,可以用能够溶解VOC加成物的第二溶剂处理化学预浓缩器,以有助于将VOC加成物从支撑结构的表面移除,并提供VOC加成物的浓缩样品用于分析测试。合适的溶剂包括极性质子溶剂、极性非质子溶剂或其组合。示例性的极性质子溶剂包括但不限于水和醇,如甲醇。示例性的极性非质子溶剂包括但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和硝基甲烷。如果需要的话,可以通过蒸发第二溶剂的至少一部分来进一步浓缩洗脱的浓缩样品。
可以分析VOC加成物的浓缩样品的至少一部分以识别和定量VOC加成物。一种示例性分析工具是质谱仪,其可以与色谱仪联用或不与其联用。例如,可以利用与质谱仪耦接的高效液相色谱(HPLC-MS)或与质谱仪耦接的气相色谱(GC-MS)来分析结合物。中性化学结合物,如可以通过根据通式(III)的叔胺反应性化合物获得的那些中性化学结合物,适于利用GC-MS来分析。叔胺反应性化合物的一个有利特征是其被酸质子化并形成正电荷的能力,这对于下文讨论的通过傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS)的分析是尤其合适的。通过比较FT-ICR-MS和GC-MS结果,所有的酮和醛加成物通常可以被识别和/或定量。应理解,其它分析技术、如激光光谱等也可以用于定量生物标志物加成物。还可以使用内标来辅助识别和/或定量过程。
在所使用的反应性化合物为根据通式(II)的阳离子盐的情况下,另一可用的分析结合物的方法是FT-ICR-MS。阳离子官能团也对利用纳米电喷雾技术的[+]离子FT-ICR-MS提供超常高的灵敏度。这种超常高的灵敏度使得能够实现从飞摩尔到阿摩尔范围内的检测限。该灵敏度为大于甚至最灵敏的GC-MS的大小级别,所述GC-MS通常需要100-1000飞摩尔或更多来进行检测。而且,因为VOC被转变成非挥发性的,所以最终的分析溶液可以被浓缩(例如至干燥)并通过非常少量的溶剂带走。另外,纳米电喷雾FTMS仅需要几微升的样品体积。
而且,FT-ICR-MS还可以与化学离子化(CI)或光离子化(PI)联用并且在负[-]离子模式下操作。负[-]离子模式下的操作排斥阳离子相并且允许分析保留在化学预浓缩器中的其它化学品。在任一模式中,通过用溶剂溶解将反应性化合物的VOC加成物从预浓缩物的结构支撑表面解吸,然后直接进行FT-ICR-MS分析。
可以由健康对象对照、吸烟者对象对照和具有良性肺部疾病和早期肺癌的对象获得的含羰基的VOC加成物的浓缩样品可以利用FT-ICR-MS进行分析并定量。然后可以利用统计方法、如Wilcoxon检验对对象组之间的分析结果进行比较,以确定对象组之间的统计学显著性差异。根据本发明的该实施方案,已经识别出特定的含羰基的VOC生物标志物(即2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛,和C5H10O的混合物,所述C5H10O包括2-戊酮和戊醛)以统计学显著升高的水平存在于肺癌患者的呼出气体中。
在本文中我们描述了使用硅微反应器化学预浓缩器来捕获含羰基的VOC的定量分析,所述含羰基的VOC与呼出气体中包含的含羰基的VOC形成加成物;以及与肺癌分期和组织学相关的特定的含羰基的VOC的识别和/或定量。本文所述的方法仅仅要求对象患者提供足量的呼出气体,例如利用呼出气体填充一升Tedlar袋。然后可以对呼出气体样品进行进一步处理和定性分析,例如通过质谱分析。
本文所述的方法的前提是经认可的原理:肺癌引发氧化应激和氧化酶,这进而在呼出气体中产生更高浓度的特定的含羰基的VOC。含羰基的VOC在生物化学途径中作为中间体被产生出来,并且一些VOC对于给定的途径是独特的,如由自由基引发的脂质氧化。因此,研究着重于利用我们之前开发的用于捕获和分析空气和呼出气体中的痕量羰基VOC的硅微反应器化学预浓缩器技术来识别呼出气体中的含羰基的VOC肺癌生物标志物。
下文描述根据本说明书的用于检测肺癌疾病状态的方法的非限制实施例。这些实施例仅仅用于举例说明,而不应被视为限制本发明的范围或其可以被实施的方式。本领域普通技术人员会理解其它实施例。
实施例
化学预浓缩器
利用标准微电子机械系统(MEMS)制造技术由4”-硅晶片制造化学预浓缩器(或硅微反应器),所述标准微电子机械系统(MEMS)制造技术例如在Li,M.等人(2012)的Preconcentration and Analysis of Trace VolatileCarbonyl Compounds(Anal.Chem.84:1288-1293)和美国专利第8,663,581号中描述。微反应器(图2A)包括限定微流体通道的微柱阵列(见图2B)。微柱具有通过干反应性离子蚀刻(DRIE)创造的尺寸为50μm×50μm×250μm的高长径比。微柱中心到中心的距离为100μm。通道尺寸为7mm×5mm,微反应器中的总体积为约5μL。微反应器包括多于5000的方形微柱,其对应于约260mm2的总微柱表面积。微反应器的入口和出口利用硅类黏结剂装配有190μm O.D.、100μm I.D.的钝化熔融石英管(见图2A)。
通过将甲醇溶液中已知浓度的2-(氨基氧)-N,N,N-三甲基乙铵(ATM)碘化物(表1中的结构4a)从一个连接端口注射到微反应器中和然后使溶剂在真空下蒸发来利用ATM碘化物对通道和微柱进行表面功能化。氧化硅微柱的轻度负表面电荷允许阳离子ATM静电结合到微柱的表面上。ATM通过高反应性的肟化与呼出气体中的痕量含羰基的VOC化学选择性地反应。
呼出气体样本收集和处理
将空气和呼出气体样品收集在一升袋(Sigma-Aldrich,美国)中。用于收集呼出气体样品的详细研究方案是由路易斯维尔大学(Universityof Louisville)的伦理审查委员会(Institutional Review Board(IRB))批准的。分析健康吸烟者和非吸烟者对照(n=88)和具有肺部结节的患者(n=129)的呼出气体样品,并确定所有含羰基的化合物的浓度。在将呼出气体样品的收集与肺癌和良性肺部的临床诊断结果与基于呼出气体样品的分析结果的结论进行比较之后,做出具有肺部结节的患者的所有临床诊断。
对于呼出气体的样品收集,对象通过尖端直接呼气到袋中,由此提供容易被患者接受的非侵入式收集技术。在收集呼出气体之后,将袋通过一个熔融石英管连接至微反应器的入口端口。将微反应器的出口端口通过微反应器上的另一熔融石英管连接至真空泵,如图2A中所示的。图1中显示的用于捕获含羰基的VOC的分析组合件10包括拉动来自袋的气态呼气样品穿过涂覆有ATM的预浓缩器15的真空泵50。在呼出气体样品已经被拉动穿过预浓缩器15并且通过真空排空之后,断开预浓缩器15。最后,用100μL冷甲醇将ATM-VOC加成物从预浓缩器15洗脱,以提供99%的ATM-VOC回收率。经洗脱的溶液直接用FT-ICR-MS分析。将甲醇中已知量的ATM-丙酮-d6添加至洗脱物作为内标。通过对相对丰度和所添加的作为内标参照物的ATM-丙酮-d6的丰度进行比较来确定呼出气体中所有羰基化合物的浓度。
FT-ICR-MS仪器分析法
通过配有具有电喷雾芯片(喷嘴内径为5.5μm)的TriVersa NanoMate离子源(Advion BioSciences,Ithaca,NY)的混合型线性离子阱-FT-ICR-MS(Finnigan LTQ FT,Thermo Electron,Bremen,德国)来分析洗脱物。在没有头压力的情况下通过施加2.0kV以正离子模式操作TriVersa NanoMate。起初,在1分钟内获取低分辨率MS扫描以确保电离的稳定性,之后使用FT-ICR分析器收集高质量准确度数据。在800m/z处以100000的目标质量分辨率获取FT-MS扫描8.5分钟。将自动增益控制(AGC)最大离子时间设定为500ms(但是通常使用的<10ms),并且对每个保存的谱图获取五个“微扫描(μscan)”;由此每个经转换和保存的谱图的周期为约10秒。使用QualBrowser 2.0(Thermo Electron)将FT-ICR质谱图作为确切的质量列表导出到电子表格文件中,通常导出所有观察到的峰。通过基于所观察的内标质量首先施加小的(通常<0.0005)线性校正,基于ATM和ATM-VOC的准确质量来对ATM和ATM-VOC进行归属。
统计数据分析
将所测量的呼出气体样品中的羰基VOC浓度分成健康对照组、NSCLC组、SCLC组和具有良性肺部结节的患者组。NSCLC组进一步分成腺癌子组和鳞状细胞癌子组,并通过Wilcoxon检验进行分析以确定两个子组之间的统计学显著性差异。使用第16.0版Minitab进行Wilcoxon检验。
结果和讨论
涂覆有ATM的预浓缩器的羰基捕获效率首先通过使用单个羰基标准和羰基标准的混合物来表征。捕获效率受VOC混合物流动通过预浓缩器的速度以及ATM/羰基化合物的摩尔比影响。在优化的预浓缩器微结构和操作条件下对痕量的酮和醛已经获得了大于98%的捕获效率。
在呼出气体分析之前,确定来自实验室空气、医务室空气和街道空气样品的羰基VOC的浓度。然后,测量来自88个健康对照(45个吸烟者和43个非吸烟者)和147个具有肺部结节的患者的呼出气体样品中的羰基VOC的浓度。已经检测了来自健康对象和具有肺部结节的患者的呼出气体样品中的C1(甲醛)至C12的含羰基的VOC。
已进一步证明,所识别的特定的含羰基的VOC生物标志物与吸烟不相关。而且,已经证明了针对与良性肺部疾病不同的早期肺癌的高特异性和灵敏度。另外,与PET扫描相比,证明了对肺癌诊断具有相似的灵敏度,但是在识别良性疾病而不是肺癌方面的特异性更大,由此潜在地避免了对从没有癌症的患者的侵入式过程。
在被研究的147个对象患者和88个健康志愿者中证明了临床相关性。总计107个对象患者具有肺癌,40个具有良性肺部疾病。仔细检查了最初10个肺癌患者的FT-ICR-MS谱图,并且将其与正常对照(即健康对象志愿者)进行比较。在该研究中,在肺癌患者中以提高的水平存在的四种羰基化合物被表征为肺癌生物标志物,并且可望在剩余的患者中进一步研究。它们是2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮和4-羟基-2-己烯醛(4-HHE)。尽管平均而言这些选定的四种化合物在癌症组中相比健康对照群体(P值均<0.0001)全部都显著提高,但是两个组中的值的范围存在重叠。
在收集呼气样品之后,通过活检或切除术对具有肺部结节的147个患者进行诊断。已证实,在107个患者中存在肺癌的病理诊断,在40个患者中存在良性结节。基于呼气样品收集之后至少六个月的时间内结节尺寸的减小,五个患者被临床诊断为具有良性肺部结节。107个肺癌患者包括8个SCLC患者,97个NSCLC患者,1个兼有小细胞肺癌和非小细胞肺癌的患者,和1个类癌瘤患者。
2-丁酮浓度(图3A中的ATM-C4H8O)通常是肺癌患者的呼出气体中的所有含羰基的VOC中最高的。乙醛浓度(图3B中的ATM-C2H4O)是健康吸烟者中最高的,可能是由于其在香烟中的丰度的原因。健康的不吸烟者通常在其呼出气体中具有丙酮(图3C中的ATM-C3H6O)作为最高浓度的羰基化合物。图3还显示肺癌患者比健康吸烟者(图3B)和非吸烟者(图3C)具有明显更高的2-丁酮和3-羟基-2-丁酮(ATM-C4H8O2,Mw=189.15982)浓度(图3A)。Wilcoxon统计检验表明,肺癌患者组的呼出气体样品中的2-丁酮(p<0.0001)、3-羟基-2-丁酮(p<0.0001)、2-羟基乙醛(p<0.0001)和4-HHE(p<0.0005)的浓度显著高于健康对照组中的浓度。使用购自Sigma-Aldrich和Cayman公司的相同化合物作为标准参照物,通过FT-ICR-MS/MS证实了所识别的呼出气体样品中肺癌的VOC。对于健康对照组、具有肺癌的患者组和具有良性肺部结节的患者组,这四种VOC的浓度范围在表2中示出。
表2:与肺癌相关的四种含羰基的VOC生物标志物的浓度范围
p*:所有的p值都在健康对照组和肺癌患者组之间。
这四种含羰基的VOC肺癌生物标志物的浓度范围存在重叠。注意,在环境空气中存在2-丁酮、3-羟基-2-丁酮和2-羟基乙醛。然而,空气中这三种VOC的浓度为呼出气体中发现的浓度的至多1/10。此外,在空气中未检测到4-HHE。潮的呼气或环境空气对呼出气体中这些羰基VOC的浓度的影响可以忽略不计。因此,推测这些羰基物质主要来自肺泡呼气,并且其浓度随癌症的存在而增加。
表3列举出了在如表2所示的针对具有肺部结节的129个患者的肺癌浓度范围中的四种羰基VOC的总数。以指示肺癌的浓度呼出四种羰基VOC的所有患者(n=29)都被诊断为患有肺癌,而以指示肺癌的浓度呼出3种羰基VOC的35个患者中的34个被诊断为患有肺癌。有两个癌症患者没有以指示肺癌的浓度呼出四种VOC中的任一种。通过限定指示肺癌的四种VOC中的至少两种的升高的简单和实用的诊断规则,获得了89.8%的灵敏度和81.3%的特异性。尽管这些结果对于临床应用是非常有前景的,但是测试数目大得多的具有肺部结节的患者以开发甚至更为可靠的肺癌诊断方法可能是有利的。
表3:在肺癌(LC)和良性肺部结节(BN)患者的呼气样品中浓度在表2所示的肺癌的范围内的含羰基的VOC肺癌生物标志物的总数。
为了确定含羰基的VOC肺癌生物标志物是否可能与肺癌分期相关,还通过Wilcoxon检验分析了患有I期的34个患者、患有II期的16个患者、患有III期的24个患者和患有IV期NSCLC的11个患者中2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE的浓度。3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE的浓度看起来与肺癌分期不相关。然而,如图4A中所示的,2-丁酮的浓度可能与I期肺癌相关。患有I期肺癌的患者的呼出气体样品中的2-丁酮的浓度显著高于健康对照和具有良性肺部结节的患者中的浓度,但是低于患有II期至IV期肺癌的患者中的浓度。看起来患有II期至IV期肺癌的患者中的2-丁酮浓度没有显著差异。
为了确定这些含羰基的VOC肺癌生物标志物和NSCLC的癌症组织学之间可能存在的关系,还对患有腺癌的33个患者、患有鳞片细胞癌的32个患者和患有低分化NSCLC或两类NSCLC的组合(在图4B中标记为ONSCLC)的15个患者中的四种VOC生物标志物的浓度进行了分析。患有鳞片细胞癌的患者比患有腺癌(p=0.03)的患者具有显著更高的4-HHE浓度(图4B)。然而,在腺癌组和ONSCLC组之间没有观察到4-HHE浓度的显著差异。并且在腺癌或鳞状细胞癌患者的不同分期中的4HHE浓度中没有观察到显著差异(图6)。
为了使用呼气分析结果用于未来诊断患有SCLC的患者,对患有局限期SCLC的5个患者和患有晚期SCLC的4个患者的呼气样品中所有的羰基VOC的浓度进行了分析,并且将其与患有NSCLC的患者(n=88)进行比较。当与NSCLC患者组进行比较时,SCLC患者中的2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE的浓度中不存在显著差异。然而,图5显示对于SCLC患者而言在4-HNE(p<0.0001)和C5H10O(p=0.0001)的浓度中存在显著增加。使用GC-MS分析来确定呼出气体中的C5H10O是2-戊酮和戊醛的混合物。4-HNE是研究最多的由脂质过氧化反应产生的不饱和醛之一,并且最新的证据已经指向可能引发肺癌发展的炎症起源。4-HHE和4-HNE两者被识别为脂质过氧化反应的产物,所述脂质过氧化反应可以由肺癌的调节异常引起。相应地,除了2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE之外,4-HNE和C5H10O也可以是可用于肺癌疾病状态的诊断、分期和/或确定组织学的含羰基的VOC生物标志物。
为了验证升高的2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE浓度可以用于早期(I和II期)NSCLC的诊断,对癌症切除术之前和之后从15个患有I期和II期NSCLC的患者获得的呼出气体样品进行分析和比较。在切除术之前,含羰基的VOC生物标志物板的数据图为典型的肺癌患者的数据图(即类似于图3A),并且所提到的VOC的浓度在指示肺癌的升高范围内。在癌症切除术和术后至少两周的时间之后,呼出气体中的VOC数据图类似于健康对照的数据图(如图8中显示的),并且四种VOC肺癌生物标志物的浓度在健康对照的范围内。
综上所述,使用涂覆有ATM的硅微反应器,已经识别了当其处于升高的浓度时可靠地诊断肺癌的呼出气体中的四种含羰基的VOC。特别地,呼气中的2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-HHE的浓度容易地通过各ATM-VOC加成物的FT-ICR-MS分析来定量,并且这些加成物相对于健康患者或甚至具有良性肺部结节的患者中的浓度而言升高的浓度指示肺癌的存在。2-丁酮的浓度可以用于将I期肺癌与II至IV期区分开。另外,4-HHE的浓度可以用于将鳞状细胞癌与腺癌和其它NSCLC区分开,并且4-HNE和C5H10O的浓度也可以用于将SCLC患者与NSCLC患者区分开。这些发现具有作为用于诊断肺癌的准确、非侵入式手段的直接应用。进一步的研究可以表明它们是与CT扫描联用来早期检测肺癌的有效手段以及监测切除术后肺癌复发的有效手段。
一种用于确定恶性肿瘤风险的方法来源于统计给定患者中升高的肺癌生物标志物的数目。升高的标记物定义为高于针对该标记物的对照群体的范围。将患有良性疾病的患者和患有初期和晚期癌症的患者之间的结果进行比较。如果对象患者的呼出气体样品中的三种或四种肺癌生物标志物升高,则约95%地可能是患者具有癌症。相反,如果没有肺癌生物标志物或其中仅一种升高,则良性疾病的可能性为85%。如果肺癌生物标志物中的两种、三种或四种升高,则灵敏度和特异性大于80%。这些结果是真实的,并且对于初期和晚期肺癌两者都是一致的。这些结果证明,呼出气体分析可以将早期肺癌与看起来在放射照相方面相似的良性疾病区分开。
而且,在81个患者中早期肺癌与良性疾病的诊断中将呼出气体分析(BA)与PET扫描相比较,呼气分析具有类似的灵敏度(83%BA,90%PET)但是更高的特异性(74%BA,39%PET)。因而,已发现在肺癌的诊断中呼出气体分析整体上比PET更为准确。
受试者工作特征(ROC)分析:
图9-11示出在呼出气体中所检测的用于区别肺癌患者与比较对象组的9种羰基化合物的受试者工作特征(ROC)曲线。ROC曲线是测试的灵敏度和特异性之间存在的关系的图表呈现,并且它是通过绘制总的实际阳性中真阳性的比例相对于总的实际阴性中假阳性的比例来生成的。在图9中,ROC曲线是示出患有肺癌的107位患者与具有良性肺部结节的40位患者相比较的评价。在图10中,ROC曲线是示出患有肺癌的107位患者与43位健康的非吸烟者对照相比较的评价。而在图11中,ROC曲线是示出患有肺癌的107位患者与45位健康的吸烟者对照相比较的评价。存在用于生成ROC曲线的各种R程序包,但本文中呈现的结果使用Caret R程序包,版本为5.15-023。(参见Kuhn M.“Caret:Classification and Regression Training”R程序包,版本5.15-023,2012)比较9种羰基化合物的灵敏度、特异性、总准确度和受试者工作特征(ROC)曲线下方的面积(AUC)。基于本研究,2-丁酮、2-戊酮和戊醛的混合物、和3-羟基-2-丁酮看起来对作为用于区别肺癌患者与良性肺部结节患者的单个标记的用途显示更高的特异性。3-羟基-2丁酮和2-丁酮实现用于区别肺癌与良性肺部结节、非吸烟者和吸烟者对照的高于85%的灵敏度和80%的特异性。
表4提供可以用于肺癌的单种物质筛查的9种含羰基的VOC生物标志物中六种的阈(截止)值(其以纳摩尔每升呼出气体的单位表示)。还示出了含羰基的VOC生物标志物的灵敏度。使用2-丁酮和3-羟基-2-丁酮以从非吸烟者和吸烟者组筛查肺癌的置信水平(肺癌的灵敏度)为约85%。使用C5羰基化合物(戊醛和2-戊酮的混合物)时,灵敏度为约80%,而2-羟基乙醛、4-羟基-2-己烯醛和4-羟基-2-壬烯醛的灵敏度分别为约62%、约67%和约72%。灵敏度和特异性取决于每种单独标记物的截止(阈值)浓度。
表4:用于诊断和筛查肺癌的六种含羰基的VOC的阈值浓度(纳摩尔/升气态样品)。
因此,根据本发明的另一个实施方案,提供在对象样本中筛查肺癌疾病状态的非侵入性方法。该方法包括检测来自对象样本的呼出气体中为肺癌生物标志物的一种或更多种含羰基的VOC的水平,和如果一种或更多种含羰基的VOC的水平升高至高于其各自的阈值,则将该对象样本识别为具有大于60%的肺癌疾病状态的可能性。如在表4中所示的,通过使用不同的VOC生物标志物可以增加灵敏度。还应注意,在本研究中,仅5位肺癌对象没有升高的生物标志物,而102位肺癌对象具有至少一种升高的表4中所列的生物标志物。相应地,针对选自表4的生物标志物中的至少一个升高的水平来筛查对象样本显示出约95%的灵敏度。
尽管已经通过实施方案的描述来举例说明本发明,并且尽管已经相当详细地描述了说明性实施方案,但是本发明人并不旨在将所附的权利要求的范围约束或以任何方式限制于该详细说明。另外的优势和改良方案对于本领域技术人员而言会是容易想到的。本发明在其广义的方面因此不限于所示出和描述的具体细节、代表性设备和方法、以及说明性实施例。因此,在不脱离本发明人的总发明构思的范围的条件下,可以由这些详细说明进行变化。
Claims (21)
1.一种检测对象样本中肺癌疾病状态的非侵入性方法,所述方法包括以下步骤:
从所述对象样本获得呼出气体,其中所述呼出气体包含多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC);
形成多种含羰基的VOC与反应性化合物的加合物;
对所述多种含羰基的VOC中的每一种的每一种加合物进行定量以确定每一种加合物的对象值;和
将每个对象值与所述多种含羰基的VOC的每一种加合物的健康样本阈值进行比较以确定数量上大于其各自健康样本阈值的一个或更多个对象值的存在,由此指示所述对象样本中肺癌疾病状态的实质可能性,所述健康样本阈值对应于由健康样本计算的值。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述肺癌疾病状态选自小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞癌和腺癌。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多种含羰基的VOC选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛和C5H10O化合物的混合物,所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛。
4.根据权利要求1所述的方法,其还包括:
浓缩从多个健康样本获得的呼出气体中所包含的多种含羰基的VOC,其中所述多种含羰基的VOC与反应性化合物形成加合物;和
对所述多个健康样本中的多种含羰基的VOC的加合物进行定量以确定所述多种含羰基的VOC的每一种加合物的健康样本阈值。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,从所述对象样本获得呼出气体包括将呼出气体收集在可充气的、聚合物膜装置中以提供包含呼气样品的经充气的装置;和其中,形成所述多种含羰基的VOC与反应性化合物的加合物包括使所述呼气样品穿过包含反应性化学物质的化学预浓缩器。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,使所述呼气样品穿过化学预浓缩器包括将经充气的装置连接至所述化学预浓缩器的入口,并使所述化学预浓缩器的出口减压以使所述呼气样品从经充气的装置流动穿过所述化学预浓缩器。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述反应性化合物具有以下通式(I):
(I)H2N—Z—L—Y,
其中,Z为NH、NR或O;L为连接基团;Y为二取代或三取代的N或P部分;R选自烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并且任选地含有一个或更多个杂原子,并且其中所述多种含羰基的VOC通过脱水反应与所述反应性化合物反应以形成其加合物。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,Z为O,Y为二取代或三取代的氮以提供具有以下通式(II)的反应性化合物:
其中,R1和R2独立地选自烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子,或者其中,R1与R2结合形成杂环;R3选自H、烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子;和A是阴离子反离子;并且其中所述连接基团L包含选自经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的芳基、和醚的非离子片段。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,Z为O,Y为二取代的氮以提供具有以下通式(III)的反应性化合物:
其中,R1和R2独立地选自烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基,其中每一个都可以是经取代的或未经取代的,并任选地含有一个或更多个杂原子,或者其中,R1与R2结合形成杂环。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述反应性化学物质为2-(氨基氧)-N,N,N-三甲基乙铵盐。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,对所述多种含羰基的VOC的加合物进行定量以确定所述多种含羰基的VOC的加合物的每一成员的对象值包括使用质谱仪分析所述多种含羰基的VOC的加合物。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述质谱仪使用傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述质谱仪耦接有色谱设备。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述多种含羰基的VOC包括C5H10O化合物的混合物和4-羟基壬烯醛(4-HNE),所述C5H10O化合物包括2-戊酮和戊醛,所述方法还包括:
通过确定以下值来区别所述对象样本中的SCLC疾病状态和NSCLC疾病状态:
a)反应性化学物质的4-HNE加合物的对象值,
b)反应性化学物质的C5H10O加合物的对象值,或
c)a)和b)二者。
15.根据权利要求14所述的方法,其还包括:
d)确定所述反应性化学物质的4-HNE加合物的SCLC浓度范围,和所述反应性化学物质的4-HNE加合物的NSCLC浓度范围;
e)确定所述反应性化学物质的C5H10O加合物的SCLC浓度范围,和所述反应性化学物质的C5H10O加合物的NSCLC浓度范围;或
f)d)和e)二者。
16.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多种含羰基的VOC包括4-羟基己烯醛(4-HHE),所述方法还包括:
通过确定以下值来区别所述对象样本中的鳞状细胞癌、腺癌和NSCLC疾病状态:
a)反应性化学物质的4-HHE加合物的对象值。
17.根据权利要求16所述的方法,其还包括:
b)确定所述反应性化学物质的4-HHE加合物的鳞状细胞癌浓度范围、所述反应性化学物质的4-HHE加合物的腺癌浓度范围和所述反应性化学物质的4-HHE加合物的NSCLC浓度范围。
18.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多种含羰基的VOC包括2-丁酮,所述方法还包括:
通过确定以下值来区别所述对象样本中的I期肺癌疾病状态和II至IV期肺癌疾病状态:
a)反应性化学物质的2-丁酮加合物的对象值。
19.根据权利要求18所述的方法,其还包括:
b)确定所述反应性化学物质的2-丁酮加合物的I期肺癌疾病状态浓度范围。
20.一种筛查对象样本中肺癌疾病状态的非侵入性方法,所述方法包括以下步骤:
浓缩从所述对象样本获得的呼出气体中所包含的多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC),其中,多种含羰基的VOC选自2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮和4-羟基己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛、2-戊酮和戊醛,其与反应性化合物形成加合物;
对所述多种含羰基的VOC的加合物进行定量以确定所述多种含羰基的VOC的加合物的每一成员的对象值;和
将所述多种含羰基的VOC的加合物的每一成员的对象值与所述多种含羰基的VOC的加合物的每一成员的健康样本阈值进行比较以确定数量上大于其各自健康样本阈值的一个或更多个对象值的存在,由此指示所述对象样本中肺癌疾病状态的实质可能性。
21.一种检测或筛查对象样本中肺癌疾病状态的非侵入性方法,其包括:
检测来自所述对象样本的呼出气体中为肺癌生物标志物的一种或更多种含羰基的挥发性有机化合物(VOC)的水平,和如果一种或更多种含羰基的VOC的水平升高至高于其各自的健康样本阈值,则将所述对象样本诊断为具有肺癌疾病状态的可能性。
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