CN102495146B - 用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法,采用气质联用仪分离和检测胃癌细胞代谢产物中痕量挥发性有机化合物的浓度并经绘制而成,其中所述4-异丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇质量体积浓度之比为:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40。胃癌细胞代谢产物还存在特征峰:3-辛酮,2-丁酮。只要将被测细胞代谢产物中挥发性有机物与本发明指纹图谱模型进行比对,便可用于早期胃癌的筛选和预警。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型及建立方法,为胃癌的早期预警提供帮助。
背景技术
胃癌的发生率在我国恶性肿瘤中居第2位,病死率居第1位。且近年来青年患者比例在逐年增加。目前临床上主要基于X线钡餐法,纤维胃镜内窥(包括超声内窥)、组织病理学检查、血清肿瘤标记物等一种或多种技术相结合的方法来检测胃癌。上述方法患者在检查过程中接受的辐射和所服用的药剂带来一定副作用,且适用对象局限性大。而且这些方法是基于肿瘤尺寸诊断胃癌,对于早期或者微小胃癌的确证率不高。往往在癌症晚期才得以确诊,使得患者的治疗和预后为时已晚。如何确诊早期胃癌是一个挑战性的医学难题。事实证明,细胞代谢产物中含有许多疾病标志物,而挥发性细胞代谢物中含有大量从未发现、可以作为癌症标志物的产物。细胞由于癌变,发生生理生化状况的异常改变,产生一些易挥发代谢物,例如,细胞在癌变过程中氧化应激增强,导致氧自由基的活动增强,从而引起细胞膜表面多不饱和脂肪酸氧化为为易挥发的烷烃类、醛类等化合物。因此,建立胃癌细胞挥发性代谢产物指纹图谱,可能对早期胃癌的发现、确诊具有一定医学价值。
质谱技术由于其较高的检测灵敏度近年来被广泛用于癌细胞挥发性代谢产物检测。固相微萃取是一种绿色,无需溶剂,方便快捷的样品富集浓缩技术,原理是依据物质的极性差异,选择不同纳米材料的固相吸附涂层,对于一定体系中某一类挥发性有机目标物实现选择性吸附、浓缩。目前广泛使用的是Supelco公司生产的萃取头。然而,上述技术是基于良好的样品来源基础上。如果细胞挥发性代谢物在进行固相微萃取之前,没有得到较好的保留,就会导致一些潜在的癌症标志物被遗漏,主要原因包括:1、癌细胞代谢产物中挥发性物质的浓度较低,含量通常在痕量甚至超痕量级;2、癌细胞代谢产物是一个依赖时间的动态过程,大部分挥发性标志物是细胞中间代谢产物,因而细胞培养时间对标志物筛选极其重要;3、固相微萃取条件会直接影响检测结果。
中国专利ZL200410053327.1,该专利提供了一种可用于诊断肝癌的蛋白质指纹图谱模型,用蛋白质芯片飞行时间质谱系统,检测正常人及肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者的外周血清样品,找出与肝癌患者差异显著的特异蛋白质峰,根据各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A,得到蛋白质指纹图谱,包括肝癌与肝硬化、肝癌与慢性肝炎、肝癌患者与正常人及肝癌与非肝癌鉴别的蛋白质指纹图谱。只要将被测人血清中相应蛋白质的m/z及其A值与本发明指纹图谱逐一对比分析,就可初步用于肝癌诊断。
检索中,尚未见与胃癌细胞代谢产物中痕量挥发性有机物的检测密切相关的报道,也未见用于早期胃癌诊断和预警的指纹图谱模型。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型,可用于早期胃癌的筛选和预警,为早期胃癌的筛查提供新的科学依据。
本发明所要解决的另一技术问题是提供上述用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明所述的用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型,是采用气质联用仪分离和检测胃癌细胞代谢产物中痕量挥发性有机化合物4-异丙氧基丁醇,壬醛,4-丁氧基正丁醇的质量体积浓度,并将这些物质的质量体积浓度与正常胃粘膜细胞的质量体积浓度进行比对统计,根据比对结果绘制而成,所述模型中4-异丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇质量体积浓度之比为:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40,所述模型中的物质浓度是以正常胃粘膜细胞中这些物质的质量体积浓度为100%作为参考值。
本发明上述的用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型,将被测细胞代谢产物中挥发性有机物中4-异丙氧基丁醇(Peak5)、壬醛(peak6)以及4-丁氧基正丁醇(peak9)的浓度,与本发明指纹图谱模型进行比对分析,则可初步用于提示早期胃癌。
进一步的,所述用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型,其中挥发性有机代谢产物中存在特征峰:3-辛酮(peak2),2-丁酮(peak8)。所谓的特征峰是相对于正常细胞而言,胃癌细胞中存在,但是正常细胞中不存在(为0),所以,只要质谱能检测到该物质,则可以进一步补充和加强早期胃癌的预警效果。
本发明所述的用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法,通过细胞培养、样品制备过程、固相微萃取条件优化,采用顶空萃取技术,选择性富集胃癌细胞代谢产物中挥发性有机物,包括烷烃类,甲基化烷烃类、醛类、酮类、醇类、不饱和烷烃类、苯类衍生物、卤化物等。利用气质联用仪对萃取得到的化合物进行分离检测,筛选与胃癌细胞相关的挥发性有机代谢物,利用质谱自带图库NIST08对被检测到的物质进行初步定性分析;利用相对峰面积,对被检测物进行定量分析,通过绘制从而建立胃癌细胞挥发性化合物的“指纹图谱”模型。
本发明上述建立方法具体包括如下步骤:
a)收集胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1培养液;
b)利用顶空固相微萃取技术对样品中挥发性代谢物进行富集浓缩,采用75μm CAR/PDMS萃取浓缩,37℃水浴1200rpm/min搅拌,萃取40min。
c)利用气质联用仪对b)富集的物质进行分离和检测;
d)筛选胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1代谢产物中存在质量体积浓度差异的物质;
e)基于差异物质的质量体积浓度对比统计,经绘制建立指纹图谱模型,所述指纹图谱模型中4-异丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇质量体积浓度之比为:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40,则可用于早期胃癌的初步筛选。
本发明所采用的方法,操作简单、安全,待测样品为体外培养的细胞代谢产物,也可采用胃病患者的胃液、唾液和尿液等样品进行分析,样品来源无痛无创,资源丰富,适用于任何年龄阶段人群。
本发明弥补了现有早期胃癌筛查技术的不足,寻找并筛选胃癌细胞代谢产物中挥发性有机化合物“指纹图谱”模型,用于早期胃癌预警。本发明的指纹图谱在多种癌细胞包括肺癌,乳腺癌,黑色素瘤癌与胃癌细胞的鉴别中,对胃癌细胞检出率达98%。同时,所得指纹图谱也存在胃癌患者的呼出气体中,而在胃良性病变患者,正常对照受试组中无明显差别。这将为该指纹图谱用于临床早期胃癌的预警和筛选提供一定依据。
附图说明
图1胃癌细胞与正常胃粘膜细胞代谢产物气相色谱图;
图2胃癌细胞与正常胃粘膜细胞代谢产物中定量差异物;
图3为本发明一实施例中的指纹图谱模型。
图4为本发明另一实施例中的指纹图谱模型。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件试验,或按照制造厂商建议的条件,试剂都为细胞培养专用。
试剂与仪器:改良型RPMI-1640细胞培养液(Hyclone)、新生牛血清(GIBCO)、青霉素-链霉素、胰酶细胞消化液(杭州四季青)、细胞培养箱(Thermo)、GC/MS(QP-2010E,日本岛津)、75cm2密封型细胞培养瓶(前尘生物科技有限公司);57330U型手动进样手柄、75μm CAR/PDMS SPME(SUPELCO);
人源胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1来源于中科院细胞库。
实验步骤:贴壁培养的人源胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1经胰酶消化、离心、收集、血球计数计数、以1*106/mL密度传代于75cm3密闭细胞培养瓶中。加入40mL含5%新生牛血清的改良型RPMI-1640细胞培养基。拧紧瓶盖,在5%CO2,37℃恒温培养18-24h,保持细胞活力在90%左右。
分别收集胃癌细胞MGC-803生长的培养液6mL,胃粘膜细胞GES-1生长的培养液6mL以及无细胞生长,同样条件下培养的培养基6mL,于20mL顶空瓶中。
样品分别经HS-SPME(75μm CAR/PDMS)萃取浓缩,37℃水浴1200rpm/min搅拌,萃取40min。于气相色谱进样口280℃热解吸附2min,使目标分子彻底解吸附,以无分流模式进样,1min后打开分流阀,分流比1:20。经毛细管色谱柱Rxi-5ms(30m*0.22mm*0.25μm)分离。程序升温条件:初始温度40℃保留5min;然后以10℃/min升至260℃,保留10min。质谱仪全范围扫描42-400amu,电子轰击能量70eV,四级杆质谱离子源温度200℃,载气是高纯氦气,流速44.2cm/s。被检出物质用质谱自带NIST08图库进行初步定性,相似度75%以上的物质使用相对峰面积定量。
结果:
胃肠粘膜细胞株GES-1、胃癌细胞株MGC-803以及空白培养基中挥发性有机物的气相色谱图,如图1所示。从图中可以看到GES-1细胞与MGC803细胞代谢产物中挥发性有机物存在定性差异。胃癌细胞MGC-803挥发性有机代谢产物中存在特征峰:3-辛酮(peak2),2-丁酮(peak8),Peak10(待定性物质)。
除定性差异外,胃癌细胞与正常胃粘膜细胞挥发性代谢产物中,至少存在三种物质,存在浓度差异(如图2所示),分别是4-异丙氧基丁醇(Peak5)、壬醛(peak6)以及4-丁氧基正丁醇(peak9)。其浓度比为:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40。这些物质浓度是以正常胃粘膜细胞中这些物质的质量体积浓度为100%作为参考值。一般在正常胃粘膜细胞中上述三种物质的质量体积浓度:4-异丙氧基丁醇0.05%,壬醛0.06%,4-丁氧基正丁醇0.23%。
通过上述物质浓度差异以及特征物质,绘制得到胃癌细胞挥发性代谢产物“指纹图谱”模型,用于区别正常胃粘膜细胞与胃癌细胞,为早期胃癌的筛选提供新的依据。
需要指出的是,本领域的技术人员完全可以通过常识,将本发明以相对峰面积标识的所述各目标分子分析实验临界点值转换为其它单位,但不限于ng/ml、pg/ml所标识的分析实验临界点值。
实施例1
如图3所示,取待测细胞,检测其中的挥发性代谢产物中4-异丙氧基丁醇(Peak5)、壬醛(peak6)以及4-丁氧基正丁醇(peak9)的浓度,将检测结果与本发明所述的有机化合物指纹图谱模型进行比较,4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40,可以初步筛选为早期胃癌。
实施例2
如图4所示,取受检者待测细胞,检测其中的挥发性代谢产物,将检测结果与本发明所述的有机化合物指纹图谱模型进行比较,按照该模型所示的流程进行分析:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40,可以初步筛选为早期胃癌。进一步检测到挥发性有机代谢产物中存在特征峰:3-辛酮(peak2),2-丁酮(peak8)。则可以进一步加强提示早期胃癌的效果。
本发明利用上述的模型,在体外细胞水平,进行早期胃癌预警。该指纹图谱模型在用于黑色素瘤细胞,肺癌细胞、胃癌细胞,对照组细胞的检测中,对胃癌细胞的检出率为98%。
本发明不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只预作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明内容还包括功能等同的方法和组分。实际上除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
Claims (2)
1.一种用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法,其特征在于包括如下步骤:
a)收集胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1培养液;
b)利用顶空固相微萃取技术对样品中挥发性代谢物进行富集浓缩,采用75μm CAR/PDMS萃取浓缩,37℃水浴1200rpm/min搅拌,萃取40min;
c)利用气质联用仪对b)富集的物质进行分离和检测;
d)筛选胃癌细胞MGC-803和胃粘膜细胞GES-1代谢产物中存在质量体积浓度差异的物质;
e)基于差异物质的质量体积浓度,进行比对统计,经绘制建立指纹图谱模型,所述指纹图谱模型中4-异丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇质量体积浓度之比为:4-异丙氧基丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.31,壬醛[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.36,4-丁氧基正丁醇[胃癌细胞]/[正常胃粘膜细胞]≤0.40,所述模型中的物质浓度是以正常胃粘膜细胞中这些物质的质量体积浓度为100%作为参考值;
上述指纹图谱模型建立的色谱和质谱条件为:样品分别经HS-SPME即75μmCAR/PDMS萃取浓缩,37℃水浴1200rpm/min搅拌,萃取40min;于气相色谱进样口280℃热解吸附2min,使目标分子彻底解吸附,以无分流模式进样,1min后打开分流阀,分流比1:20;经30m*0.22mm*0.25μm的毛细管色谱柱Rxi-5ms分离;程序升温条件:初始温度40℃保留5min;然后以10℃/min升至260℃,保留10min;质谱仪全范围扫描42-400amu,电子轰击能量70eV,四级杆质谱离子源温度200℃,载气是高纯氦气,流速44.2cm/s;被检出物质用质谱自带NIST08图库进行初步定性,相似度75%以上的物质使用相对峰面积定量。
2.根据权利要求1所述的用于早期胃癌诊断/预警的化合物指纹图谱模型的建立方法,其特征在于:所述指纹图谱模型,其中挥发性有机代谢产物中进一步包括正常胃粘膜细胞中没有的3-辛酮,2-丁酮。
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张晓丽、王济国等.胃癌患者唾液蛋白质指纹图谱诊断模型的初步研究.《中国中医药科技》.2010,第17卷(第4期),338-339. |
胃癌与慢性胃炎唾液蛋白质组鉴别诊断模型;张晓丽、王济国等;《世界华人消化杂志》;20100328;第18卷(第9期);926-931 * |
胃癌患者唾液蛋白质指纹图谱诊断模型的初步研究;张晓丽、王济国等;《中国中医药科技》;20100731;第17卷(第4期);338-339 * |
血清蛋白指纹图谱筛选胃癌血清标志物的初步探讨;刘春、徐亮等;《中国普外基础与临床杂志》;20090131;第16卷(第1期);23-27 * |
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