CN114965667A - 一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法 - Google Patents

一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，包括以下步骤：在飞行时间质谱靶板表面贴上镂空防水薄膜；将贴有薄膜的靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置5‑10min；将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20‑30min；将靶板表面的防水薄膜撕下，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；制备待测样品溶液；飞行时间质谱仪数据分析。本发明中的金纳米粒子用作飞行时间质谱仪基质对液体活检样品具有低检测限和较高的灵敏度，增强了待测物质在飞行时间质谱仪中的检测信号，同时满足使用者快速简便操作的需求。

Description

一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的 方法
技术领域：
本发明属于质谱分析技术领域，具体涉及一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法。
背景技术：
金纳米颗粒材料物理化学性能稳定且优越，具有极高的可用性与适用性，是当今被最广泛地研究应用的一种人工纳米材料，由于其独特的物理化学性质、良好的生物兼容性以及极微薄的毒性等卓越性能，在人体健康和生物医药的相关研究与近代科学技术发展中，金纳米颗粒正发挥着越来越重要的作用；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪 (简称飞行时间质谱仪或MALDI-TOF MS)利用有机基质吸收激光能量实现待测物的激光解吸电离并分析数据，免标记、高通量且自动化的特点实现了对非挥发性样品的数据分析，与同类质谱相比具有较高的耐盐、耐缓冲剂及非挥发性成分的优点，并且分析的大多数样品分子都被解离为单电荷分子、离子，因此最终的质谱图比较简单利于图谱解析。
液体活检是以血液等非固态生物组织为标本进行取样和分析的体外诊断技术，“液体”以血液为主，也包括粪便、尿液、唾液以及其他体液样品，液体活检广泛应用于肿瘤检测、无创产前检测以及肌肉骨骼系统结缔组织疾病检测，反映病灶的综合信息并对其精准治疗，根据检测物的不同，目前已有循环肿瘤细胞技术、游离DNA技术、外泌体技术以及循环RNA技术等分支但是仍不能满足当前需求，而MALDI-TOF MS结合液体活检则有望弥补这一空白。
目前MALDI-TOF MS结合液体活检的可用基质选择主要包括以CHCA、DHAP、SA为代表的蛋白多肽类，以DHB为代表的多糖类，以及以HPA、THAP为代表的核酸类以及IAA等合成聚合物类，适用于肽段、糖肽与各类大分子化合物的分析，而适用于小分子质量待测物的基质选择则有待考量，其主要制约因素在于有机小分子基质会发生破裂及分子之间的缔合，从而产生严重的基质背景干扰现象，且需要每次检测过程中均滴加基质溶液。因此，本发明立足于附有金纳米颗粒的制备方法与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(飞行时间质谱仪)应用技术联用，着眼于液体活检方向，致力于透彻研究分析适用于不同液体活检样品附着的基质靶板以及详细的制备研究方法，研究一种基于能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子的纳米材料辅助飞行时间质谱仪基质，且可直接制备成附着该纳米材料的靶板，不仅能够检测分析包括低分子质量范围内的代谢组学物质且使用过程中不需额外滴加基质，有效保证基质的均匀性，使分析数据更加稳定。而且能够更加透彻的分析人体液体活检样品的待测信息，为人类健康筛查事业的进一步发展添砖加瓦。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，将质谱靶板与特定的Au纳米颗粒基质相结合，利用合适的基质提高信号的灵敏度和检出限，无需在样品检测过程中额外添加基质，同时可以排除现有基质所产生的质谱峰干扰。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，包括以下步骤：
S1：在飞行时间质谱靶板表面贴上镂空防水薄膜；
S2：将贴有薄膜的靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S3：将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置5-10min；
S4：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20-30min；
S5：将靶板表面的防水薄膜撕下，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；
S6：制备待测样品溶液：移取液体活检样品到离心管内，加入提取试剂，混匀，离心，得到待测样品溶液，将制备好的待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；或直接将待测样本溶液滴加到靶板待测区域内；
S7：飞行时间质谱仪数据分析：将滴加样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
作为优选，所述的步骤S1中防水薄膜材质为PET、PP有机高分子材料。
作为优选，所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式可选择自然晾干，也可选择真空抽干、惰性气体吹干的干燥方式。
作为优选，所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状为球形、方形、锥形、棒形中的一种或几种，粒径尺寸范围为10-100nm。
作为优选，所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25-5mg/ml。
作为优选，所述的步骤S3优选化学还原法为主，采用柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm。
作为优选，所述的步骤S7中待测物包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质。
作为优选，所述的步骤S6中所测样品为液体活检样品，包括血清、血浆、关节液、组织液、尿液、唾液、汗液、脑脊液以及其他体液，其他体液包括胸水、腹水、羊水、阴道分泌液，并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、直接使用：直接使用获得的液体活检样品；
b、试剂提取制备：对液体活检样品进行试剂提取，试剂提取法移取样品的体积范围适宜在5-500µL，加入的提取试剂混匀后离心，混匀时间和离心条件适宜即可；
c、富集分离制备：富集分离方法包括磁珠分离法、微量层析柱提取法、固相萃取柱提取法。
作为优选，所述的步骤S6中所测样品提取试剂，包括使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，其他水溶液用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
与现有技术相比，本发明的有益之处是：本发明将金纳米粒子作为飞行时间质谱仪基质，并制作成附有金纳米颗粒的一次性使用靶板，使用过程中无需额外添加基质，具有背景干扰小、耐盐性好、解吸（电离）效率高等优点，且金纳米粒子具有很强的紫外吸收能力，能够在飞行时间质谱仪检测中快速的转移激光能量使分析物电离。通过金纳米粒子不容易在飞行时间质谱仪的真空下脱落的性质以及能量的快速转移可对待测物进行电离分析，使得本发明中的金纳米粒子用作飞行时间质谱仪基质对液体活检样品具有低检测限和较高的灵敏度，增强了待测物质在飞行时间质谱仪中的检测信号，同时满足使用者快速简便操作的需求。
附图说明：
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为贴有镂空防水薄膜的靶板示意图；
图2为附着Au纳米颗粒的靶板设计图；
图3为使用乙醇提取试剂提取血浆样品、15nm金颗粒溶液为基质的飞行时间质谱仪质谱图；
图4为直接使用血清样品、5nm金颗粒溶液为基质的飞行时间质谱仪质谱图。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述：
如图1至图4所示的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，包括以下步骤：
S1：在飞行时间质谱靶板表面贴上镂空防水薄膜；
S2：将贴有薄膜的靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S3：将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置5-10min；
S4：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20-30min。
S5：将靶板表面的防水薄膜撕下，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板，此靶板用于飞行时间质谱系统对液体活检样本的检测，优势在于靶板表面的Au纳米颗粒可直接做基质使用，无需额外滴加基质。
S6：制备待测样品溶液，移取液体活检样品到离心管内，加入提取试剂，混匀，离心，得到待测样品溶液，将制备好的待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；或直接将待测样本溶液滴加到靶板待测区域内；
S7，飞行时间质谱仪数据分析，将滴加样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
所述的步骤S1中防水薄膜材质为PET、PP有机高分子材料。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，材质可选不锈钢金属，而靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式并不局限于自然晾干，优选地也可选择真空抽干、惰性气体吹干干燥方式；
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状形状多样包括球形、方形、锥形、棒形，尺寸为10-100nm。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25-5mg/ml，优选1.0mg/ml-5.0mg/ml；
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S3中应用的制备方法多样，但是物理方法光化学、声化学、辖射和热解制备器材要求过高且制得的Au纳米颗粒直径不易控制，实验室实验优选化学还原法为主，如采用经典的柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，这种梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm，其他化学方法制得的粒径同样范围可控，并且利用晶种生长法加入不同表面活性剂可制得不同形状的Au纳米颗粒，不同的制备方法制得的Au纳米颗粒性质各有不同在飞行时间质谱检测方面适宜检测不同的小分子物质；
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S7中待测物包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质；
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S6中所测样品为液体活检样品，包括且不限于血清、血浆、关节液、组织液、尿液、唾液、汗液、脑脊液以及其他体液胸水、腹水、羊水、阴道分泌液），并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、直接使用：直接使用获得的液体活检样品；
b、试剂提取制备：对液体活检样品进行试剂提取，试剂提取法移取样品的体积范围适宜在5-500µL，加入的提取试剂混匀后离心，混匀时间和离心条件适宜即可；
c、富集分离制备：富集分离方法包括但不限于磁珠分离法、微量层析柱提取法、固相萃取柱提取法。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤S6中所测样品提取试剂，包括且不限于使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，如用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品可被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
实验开始之前首先对器材与试剂进行选择，对操作中所需要的组分进行预先取样，用于后续操作，器材与试剂选择包括选取离心管、移液枪、涡轮振荡器、超纯水、提取液、冰、样品；之后，检查防护措施，对操作中的安全进行保障，检查防护措施包括检查操作人员是否正确穿着实验服，检查操作人员是否正确佩戴防护手套，检查操作人员是否正确佩戴防护目镜，检查通风橱是否正常工作。
一切准备就绪后实验正式开始，严格按照以下标准步骤开展本次实验：
实施例1
一、靶板制备
1、取一块飞行时间质谱使用靶板，在其表面贴上镂空PP薄膜，勿将靶板靶点位置覆盖，使用异丙醇对其进行清洗并干燥；
2、取直径为15nm的Au纳米颗粒溶液10mL，加水稀释至40mL，混匀；
3、将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置10min，将有靶点位置朝上，使用超声仪进行震荡；
4、取出靶板，直接放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干20min；
5、靶板取出冷却后撕下薄膜，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
1、移取50μL血浆(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μL血清)到离心管内，加入150μL乙醇(此处提取液可为其他容量、种类的溶液，如175μL90%的乙腈和0.1%的TFA水溶液的混合物)，混匀1min，10000转离心10min，取上清液。
2、使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为100～1000Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
实施例2
一、靶板制备
1、取一块飞行时间质谱使用靶板，在其表面贴上镂空PET薄膜，勿将靶板靶点位置覆盖，使用乙醇对其进行清洗并干燥；
2、取直径为35nm的Au纳米颗粒溶液10mL，加乙醇稀释至50mL，混匀；
3、将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置5min，将有靶点位置朝上，使用超声仪进行震荡；
4、取出靶板，直接放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干20min；
5、靶板取出冷却后撕下薄膜，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
移取50μL血清(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μL血清)到离心管内，使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为50～1000Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
实施例3
一、靶板制备
1、取一块飞行时间质谱使用靶板，在其表面贴上镂空PET薄膜，勿将靶板靶点位置覆盖，使用异丙醇对其进行清洗并干燥；
2、取直径为5nm的Au纳米颗粒溶液10mL，加乙醇稀释至40mL，混匀；
3、将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置10min，将有靶点位置朝上，使用超声仪进行震荡；
4、取出靶板，直接放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干30min；
5、靶板取出冷却后撕下薄膜，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
1、移取50μL关节液(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μL血清)到离心管内，加入150μL乙醇(此处提取液可为其他容量、种类的溶液，如175μL90%的乙腈和0.1%的TFA的混合物)，混匀1min，10000转离心10min，取上清液，
2、使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为50～800Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
图3为使用乙醇提取试剂提取血浆样品、15nm金颗粒溶液为基质的飞行时间质谱仪质谱图，其中横坐标为质荷比、纵坐标为离子流的强度，通过对代谢物相对分子质量的测定以确定代谢物的化学式、结构式，并进行定性或定量分析；根据质谱图特征峰的峰高或峰面积结合计算公式可以推算血浆样品中待测物的含量，具有痕量分析、清晰直观以及稳定性强等优点；
图4为直接使用血清样品、5nm金颗粒溶液为基质的飞行时间质谱仪质谱图，其中横坐标为质荷比、纵坐标为离子流的强度，通过对代谢物相对分子质量的测定以确定代谢物的化学式、结构式，并进行定性或定量分析；根据质谱图特征峰的峰高或峰面积结合计算公式可以推算血清样品中待测物的含量，具有痕量分析、清晰直观以及稳定性强等优点。
专业术语解释：
血清：人体血液除去血细胞、再经凝血处理(自然凝血或添加凝血因子)所得液体；
血浆：血浆是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体；
血清乙醇提取液：血清按照[血清样品代谢物提取标准操作流程]处理，得到的液体样品；
血浆乙醇提取液：血浆按照[血浆样品代谢物提取标准操作流程]处理，得到的液体样品；
飞行时间质谱仪：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪；
靶板：与飞行时间质谱仪适配的、承载待分析样品的金属板；
靶点：靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品；
质荷比：离子的相对质量与离子所带电荷(以电子电荷为单位)的比值，简写为m/z。
需要强调的是：对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (9)

1.一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在飞行时间质谱靶板表面贴上镂空防水薄膜；
S2：将贴有薄膜的靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S3：将贴有薄膜的靶板浸入Au纳米颗粒溶液中放置5-10min；
S4：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20-30min；
S5：将靶板表面的防水薄膜撕下，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；
S6：制备待测样品溶液：移取液体活检样品到离心管内，加入提取试剂，混匀，离心，得到待测样品溶液，将制备好的待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；或直接将待测样本溶液滴加到靶板待测区域内；
S7：飞行时间质谱仪数据分析：将滴加样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
2.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S1中防水薄膜材质为PET、PP有机高分子材料。
3.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式可选择自然晾干，也可选择真空抽干、惰性气体吹干的干燥方式。
4.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状为球形、方形、锥形、棒形中的一种或几种，粒径尺寸范围为10-100nm。
5.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25-5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S3优选化学还原法为主，采用柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm。
7.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S7中待测物包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质。
8.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S6中所测样品为液体活检样品，包括血清、血浆、关节液、组织液、尿液、唾液、汗液、脑脊液以及其他体液，其他体液包括胸水、腹水、羊水、阴道分泌液，并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、直接使用：直接使用获得的液体活检样品；
b、试剂提取制备：对液体活检样品进行试剂提取，试剂提取法移取样品的体积范围适宜在5-500µL，加入的提取试剂混匀后离心，混匀时间和离心条件适宜即可；
c、富集分离制备：富集分离方法包括磁珠分离法、微量层析柱提取法、固相萃取柱提取法。
9.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱液体活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S6中所测样品提取试剂，包括使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，其他水溶液用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
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