CN105699476A - 一种多肽化衍生方法及其在maldi-tof-ms检测小分子化合物中的应用 - Google Patents

一种多肽化衍生方法及其在maldi-tof-ms检测小分子化合物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化学衍生化结合基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)的分析方法。本发明使用多肽对醛基和巯基类小分子代谢物进行衍生;小分子待测物衍生化后,通过MALDI-TOF-MS检测分析。将小分子物质多肽化后能得到简洁单一的准分子离子峰[M+H]+,不仅显著改善了这些小分子物质在质谱谱图中的辨识度,也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。该方法灵敏度高、普适性强、操作简便、无基质干扰、样本损耗少,且无需制备复杂的基质和衍生化试剂,就可以定量检测体液中含量极低的巯基化合物,在代谢组学的研究中有很大的应用前景。

Description

一种多肽化衍生方法及其在MALDI-TOF-MS检测小分子化合物中的应用
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域,具体涉及一种多肽衍生化结合MALDI-TOF-MS的方法及其在代谢组学领域的应用。
背景技术
代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后,又一表征生命体系状况的研究领域;生物体内的代谢物的检测对研究基因表达、探索生命过程、疾病诊断和预防等方面都具有深刻意义。因此,对代谢物的分析是分析化学领域中的一个重要的研究方向。
质谱作为代谢组学研究的重要手段,具有灵敏度高、专一性好、定性能力强等显著优点。目前对小分子代谢物的最常用的质谱检测技术是液相色谱-质谱联用(LC-MS)。虽然LC-ESI-MS的灵敏度较高,但是LC-MS的检测时间长,不适用于快速高通量分析。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)由于其检测快速、简便、高通量等特点,被广泛应用于DNA、蛋白质、多肽、多糖等大分子样品的检测。考虑到MALDI-TOF-MS检测的快速、简便、高灵敏度、高通量等优势,我们尝试将其拓展到对小分子代谢物的检测。但是MALDI-TOF-MS虽然在检测大分子物质上具有显著的优越性,却不适合检测代谢物这种小分子物质,主要是由于其通常所用的基质CHCA、DHB、3-HPA、2,4,6-THP等在小分子(<500Da)区段会对目标分析物有严重的基质干扰。为克服这一缺点,现有文献报道的方法主要分为两类:1)采用基质干扰小的基质,比如多孔硅、纳米微球、金属氧化物、碳材料等,但依然没有一种方便、广泛适用的基质被开发出来;2)设计大分子衍生化试剂衍生小分子待测物,现有文献报道的衍生化试剂的制备通常很繁琐和一定局限性。因此,在小分子化合物的MALDI-TOF-MS分析中迫切需要发展一种简便的、高灵敏度、普适的衍生方法。
本发明针对上述问题,首次开发以多肽作为衍生化试剂来衍生小分子代谢物的新型MALDI-TOF-MS检测手段,从而克服MALDI-TOF-MS在小分子物质检测方面的劣势,开拓MALDI-TOF-MS在代谢组学检测领域的应用。具有操作简便、快速、样品用量少等优点,特别适用于生物样品的分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种能应用于小分子代谢物检测领域中,结合化学衍生化策略的具有高灵敏度和普适性的MALDI-TOF-MS分析方法。
本发明提供的衍生化技术和分析方案包括如下步骤:
(1)通过PM3方法对多肽进行分子模拟和计算后,筛选到用于衍生化的多肽,该多肽含有在MALDI源中易电离的精氨酸、苯丙氨酸等基团;
(2)用步骤(1)获得的多肽衍生待测小分子物质,使这些小分子带上易电离的氨基酸残基链。
本发明通过分子模拟筛选出高灵敏度的多肽作为衍生化试剂,用N端修饰半胱氨酸和马来酰亚胺的多肽分别衍生醛类化合物和巯基类化合物,再用MALDI-TOF-MS检测这些经过多肽标记的小分子代谢物。
一种衍生化方法:采用序列为CFRGLRGF的多肽P2(如SEQNO.1所示)和序列为KFRGLRGF(Lys上修饰马来酰亚胺)的多肽P7(如SEQNO.2所示)分别作为醛类物质和巯基类物质的衍生化试剂,水作为反应溶剂,磷酸缓冲溶液作为缓冲剂;
反应条件为:醛类化合物/多肽P2(20~100,c/c)加入到pH为4~6的磷酸缓冲溶液中,25~37℃下衍生1~10h。巯基化合物/多肽P7(2~10,c/c)加入到pH为5~7的磷酸缓冲溶液中,4~37℃下衍生0.2~2h;
所述的衍生化反应是指含有Cys的多肽与醛类化合物发生的脱水缩合反应;Lys上修饰马来酰亚胺的多肽与巯基类化合物发生的点击化学反应。
优选地,醛类化合物、多肽P2以摩尔比为50:1加入到pH为4的磷酸缓冲溶液中,25℃下,发生脱水缩合反应,5h。
优选地,巯基类化合物、多肽P7以摩尔比为5:1加入到pH为6的磷酸缓冲溶液中,4℃下,发生点击化学反应,0.5h。
由于所述的多肽衍生化试剂带有容易在MALDI-MS中结合质子发生电离的氨基酸残基,包括Arg(精氨酸),Phe(苯丙氨酸)等,发现筛选出的多肽具有较高的质子亲和势,从而在质谱中容易结合质子,具有高灵敏度。
一种多肽化衍生结合MALDI-TOF-MS的定量分析方法:将小分子待测物衍生化后,与相应的稳定同位素内标1:1混匀,按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板;室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,根据目标分析物谱峰强度与稳定同位素谱峰强度的比值对其进行定量分析。
所述的稳定同位素内标制备方法:稳定同位素多肽衍生化试剂(多肽公司订购)与过量的待分析物进行衍生化反应后,真空冷冻旋干除去过量的小分子,再复溶于水中制成内标液。
所述的多肽化衍生法结合MALDI-TOF-MS的分析方法在代谢组学分析领域中的应用:经筛选用于衍生化的多肽含有在MALDI源中易电离的Arg(精氨酸),Phe(苯丙氨酸)基团,标记待测小分子物质后可以使这些小分子带上易电离的氨基酸残基链,显著增强它们在MALDI-TOF-MS中的离子化效率,从而导致方法的灵敏度得到极大的提高。由于多肽在MALDI-TOF-MS中的最低检出限(LOD)可以达到fmol,多肽衍生的小分子待测物在质谱中的LOD也可以达到fmol级别。而且,这种多肽化衍生策略可应用到许多其他小分子化合物的检测,除了发明中所述的醛类和巯基化合物外,还可以拓展到酮类、羧酸类、醇酚类、酯类等小分子化合物的MALDI-TOF-MS分析中,这些小分子化合物的检测对代谢组学的研究意义重大。
本发明的有益效果如下:
1.本发明中,方法操作简便,待测物标记后直接用MALDI-TOF-MS分析。
2.本发明涉及的多肽化衍生方法可以显著提高小分子待测物在MALDI-TOF-MS中的检测灵敏度(灵敏度比衍生之前提高了50000倍),检出限可达到fmol级别。
3.本发明用到的多肽衍生化试剂使待测小分子带上了分子量很大的标记物,避免了MALDI-TOF-MS中低分子区段(<500Da)基质效应对检测的干扰。
4.本发明涉及的多肽及同位素多肽都可以购买到商品化的产品,利于定量分析。
5.本发明涉及的衍生化反应具有较高的普适性,由于衍生化试剂多肽上有许多可供修饰的基团,利于多种小分子化合物的分析,具有很高的应用前景。
附图说明
图1多肽衍生化反应及反应前后的MALDI-TOF-MS检测效果对比图。
图2多肽P2、P7分别与醛基、巯基化合物衍生后MALDI-TOF-MS检测灵敏度。
图3肺癌病人尿液中巯基化合物的质谱图,图中(a)、(b)显示的为尿液中检测到的巯基化合物Cys,Cys-Gly和GSH,分别用多肽P7和7P7作为衍生化试剂;图中(c)、(d)显示的为巯基化合物Cys,Cys-Gly和GSH标品,分别用多肽P7和7P7作为衍生化试剂。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
1、首先配置工作溶液:将衍生化试剂多肽P2和P7溶解于水中,配成浓度为100μΜ的溶液备用;醛类待测物溶解于水或甲醇中配成浓度为100mM的储备液;巯基待测物溶解于1.0mmol/LEDTA(含有0.05%甲酸)中配成浓度为100μΜ的储备液。所有溶液在4℃下配制在-20℃下储存。
2、多肽化衍生步骤为:先将多肽衍生化试剂和待测物溶解在水溶液或其它溶剂中,再依据适当的比例加入到一定pH的磷酸缓冲液中,使得待测物在反应体系中的浓度为10μM涡旋混匀后在适宜的温度下进行衍生化反应。
衍生化反应条件为:醛类化合物/多肽P2(20~100,c/c)加入到pH为4~6的磷酸缓冲溶液中,25~37℃下衍生1~10h。优选为醛类化合物、多肽P2以摩尔比为50:1加入到pH为4的磷酸缓冲溶液中,25℃下,发生脱水缩合反应,5h。
衍生化反应条件为:巯基化合物/多肽P7(2~10,c/c)加入到pH为5~7的磷酸缓冲溶液中,4~37℃下衍生0.2~2h;其中能用MALDI质谱检测到的醛类化合物在反应体系中的浓度不低于20nM;巯基化合物在反应体系中的浓度不低于10nM。优选为巯基类化合物、多肽P7以摩尔比为5:1加入到pH为6的磷酸缓冲溶液中,4℃下,发生点击化学反应,0.5h。
3、反应结束后,将产物溶液与稳定同位素内标溶液混合,涡旋混匀后,按照1μL样品液混合1μL基质(CHCA)点板;室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱,采用正离子反射模式分析。
4、步骤3中所述的稳定同位素内标的制备方法为:将稳定同位素多肽7P2(多肽P2亮氨酸上有1个15N和6个13C标记,订购)或7P7(多肽P7亮氨酸上有1个15N和6个13C标记,订购)分别与过量醛类和巯基类待分析物进行衍生化反应后,真空冷冻旋干以除去过量的小分子,再复溶于水中制成内标液。
5、步骤3中所述的质谱检测条件为:采用日本Shimadzu公司的AximaTOF2型基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)。MALDIMS分析时采用波长为337nm的氮气激光器,其脉冲宽度为3ns;采用20kV的加速电压,在正离子反射模式下进行检测。每张谱图是200次激光扫描的平均结果。
【实施例1】几种醛类化合物、巯基类化合物多肽衍生化前后MALDI-TOF-MS检测灵敏度对比
表1多肽衍生化前后MALDI-TOF-MS检测灵敏度对比。
ND:1nmol未能检测到。
分析物未多肽化衍生灵敏度:按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板;室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,测出其LOD。
分析物多肽化衍生灵敏度:将小分子待测物衍生化后,按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板;室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析测出其LOD。
【实施例2】3-吡啶甲醛、巯基乙醇多肽化衍生后的检出限测定
不同量的小分子待测物(3-吡啶甲醛、巯基乙醇)利用上述方法进行多肽化衍生后,按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板;室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,得到小分子化合物的检出限。
【实施例3】肺癌病人尿液中巯基化合物的分析检测
肺癌病人的尿液样品通过标准的临床渠道从湖北省肿瘤医院获得。采集到的尿样保存在-80℃冰箱中。进行样品分析之前,尿样先在4℃下12000r/min离心5min,取上清液待测。为了分析巯基化合物,100μL的尿样与100nmol的TCEP在45℃反应60min还原二硫键。然后,20μL尿样与20nmol多肽P7或7P7加入到pH为6的磷酸缓冲溶液中,4℃下衍生0.5h,1μL反应液混合1μL基质(CHCA)点板;室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱,采用正离子反射模式分析。
检测结果:该方法能很好地消除基质对小分子化合物的干扰,同时排除复杂尿样的干扰,选择性地检测到三种巯基化合物。
【实施例4】多肽化衍生结合MALDI-TOF-MS的定量分析肺癌病人尿液中半胱氨酸的含量
尿样的获取及其衍生化如实施例3,反应完的溶液中加入稳定同位素内标,使其浓度为1μM,混匀后取1μL混合1μL基质(CHCA)点板;室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱,采用正离子反射模式分析,根据目标分析物谱峰强度与稳定同位素谱峰强度的比值对其进行定量分析,最终测得肺癌病人尿液中的半胱氨酸含量为32μM。

Claims (6)

1.一种多肽化衍生小分子化合物结合MALDI-TOF-MS的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)多肽化衍生小分子化合物:将醛类化合物、多肽P2以摩尔比为20~100:1加入到pH为4~6的磷酸缓冲溶液中,25~37℃下,发生脱水缩合反应,1~10h;多肽P2的氨基酸序列如SEQNO.1所示,N端修饰半胱氨酸,作为醛类物质的衍生化试剂;
(2)MALDI-TOF-MS分析:样品衍生化完成后,按照1μL样品液混合1μL基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板,室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱,采用正离子反射模式分析。
2.一种多肽化衍生小分子化合物结合MALDI-TOF-MS的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)多肽化衍生小分子化合物:将巯基类化合物、多肽P7以摩尔比为2~10:1加入到pH为5~7的磷酸缓冲溶液中,4~37℃下,发生点击化学反应,0.2~2h;多肽P7的氨基酸序列如SEQNO.2所示,Lys上修饰马来酰亚胺,作为巯基类物质的衍生化试剂;
(2)MALDI-TOF-MS分析:样品衍生化完成后,按照1μL样品液混合1μL基质α-氰基-4-羟基肉桂酸点板,室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱,采用正离子反射模式分析。
3.根据权利要求1所述的多肽化衍生方法,其特征在于,步骤(1)中醛类化合物、多肽P2以摩尔比为50:1加入到pH为4的磷酸缓冲溶液中,25℃下,发生脱水缩合反应,5h。
4.根据权利要求2所述的多肽化衍生方法,其特征在于,步骤(1)中巯基类化合物、多肽P7以摩尔比为5:1加入到pH为6的磷酸缓冲溶液中,4℃下,发生点击化学反应,0.5h。
5.一种多肽化衍生结合MALDI-TOF-MS的定量分析方法,其特征在于,将小分子待测物按照权利要求1~4任一项所述的方法多肽衍生化后,与相应的稳定同位素内标1:1混匀,按照1μL待测液混合1μL基质点板;室温风干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,根据目标分析物谱峰强度与稳定同位素谱峰强度的比值对其进行定量分析;所述的稳定同位素内标由稳定同位素多肽衍生化试剂与过量的小分子待测物进行衍生化反应后,真空冷冻旋干除去过量的小分子,再复溶于水中制成。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在代谢组学分析领域中的应用。
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