CN104374852A - 一种提高寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱离子化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生化分析领域,涉及一种提高寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱离子化的方法。本方法采用2-氨基哌嗪对寡糖进行衍生,同时作为辅助基质,提高寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱的检测灵敏度。由于过量的2-氨基哌嗪衍生试剂在非还原胺化衍生反应后可作为辅助基质,故省去了样品纯化步骤。在最优反应条件下,寡糖的衍生产率达95%以上,其信噪比和信号强度提高了6倍。衍生化还可提高糖蛋白酶解肽段中糖链的检测。此外,衍生后的寡糖在二级质谱图中信号强度的提高有利于糖链结构的解析。本方法具有操作简便、无需除盐的特点,可成功用于鸡卵清蛋白N-糖链的质谱分析。
Description
技术领域
本发明属于生化分析领域,涉及基质辅助激光解吸飞行时间质谱离子化的方法,具体涉及一种寡糖衍生化用于提高基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)离子化的方法。本方法采用2-氨基哌嗪作为寡糖衍生化试剂,同时作为MALDI分析寡糖的辅助基质,能有效提高寡糖在质谱中的检测灵敏度。
背景技术
基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)因其具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点,已成为糖类物质分析中的重要工具。但是,天然寡糖的亲水性强,在气相中离子化效率较低,阻碍了MALDI-TOFMS对寡糖的研究。为提高寡糖在质谱中的离子化效率,研究者进行了各种尝试,其中通过对寡糖进行化学衍生可增强其疏水性和/或带电性质,从而提高寡糖的质谱检测信号。此外,化学衍生还可以影响寡糖在二级质谱中的碎裂方式,有利于其结构解析。
目前,基于寡糖还原端的衍生化方法占有重要地位。其中利用还原胺化的衍生反应操作简单、产率较高且胺类衍生试剂多样易得,因此广泛应用于寡糖衍生,提高其质谱检测灵敏度。然而早期的还原胺化衍生需要除去过量的衍生试剂及还原剂(如氰基硼氢化钠),这种后续除盐操作不仅费时费力,还会导致样品损失。利用寡糖还原端与肼、酰肼形成稳定腙类的衍生反应所得产物稳定,无需进一步还原,故一般不需复杂的除盐步骤。然而由于缺乏商业化的肼试剂,该方法在糖链分析中的应用受到极大限制。近年来,利用非还原胺化的寡糖衍生受到了广泛关注。该方法能省却衍生后样品的纯化步骤,提高质谱兼容性,具有较好的发展前景。
本申请的发明人拟针对目前的衍生方法进行进一步研究改进,以实现寡糖完全衍生化及质谱的高灵敏检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷,提供一种简便、完全的提高寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱离子化的方法。
为实现上述目的,本发明采用如下的技术方案:
1.以麦芽七糖为模式寡糖,优化2-氨基哌嗪(AP)衍生寡糖的反应,包括反应温度、乙酸浓度、溶剂类型与AP浓度,并计算产率;
2.分别采用DHB基质分析天然麦芽七糖;DHB-AP混合基质分析天然麦芽七糖;DHB基质分析经AP衍生后的麦芽七糖;
3.采用PNGaseF酶酶切核糖核酸酶B并纯化得到N-糖链,经AP衍生后进行质谱分析,以未衍生的N-糖链为对照;
4.采用胰蛋白酶酶解核糖核酸酶B,之后用PNGaseF酶酶切得到肽段与N-糖链的混合物,经AP衍生进行质谱分析,以未衍生的肽段与N-糖链的混合物为对照;
5.对AP衍生前后麦芽七糖进行MALDI-TOF/TOFMS分析;
6.采用PNGaseF酶酶切鸡卵清蛋白并纯化得到N-糖链,经AP衍生后进行质谱分析,以未衍生的N-糖链为对照;通过二级质谱结合GlycoWorkbench软件分析确认糖链组成。
更具体的,本发明的一种寡糖衍生化用于提高基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)离子化的方法,其特征是,选用2-氨基哌嗪(AP)作为寡糖衍生试剂及MALDI辅助基质,以提高寡糖在质谱中的检测灵敏度;
本发明方法中,反应溶剂体系为甲醇/乙酸(95/5,v/v);
本发明方法中,AP终浓度为2mg/mL。
本发明方法中,70℃下反应3小时。
本方法采用2-氨基哌嗪对寡糖进行衍生,同时作为辅助基质,提高了寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱的检测灵敏度。由于过量的2-氨基哌嗪衍生试剂在非还原胺化衍生反应后可作为辅助基质,故省去了样品纯化步骤。在最优反应条件下,寡糖的衍生产率达95%以上,其信噪比和信号强度提高了6倍。衍生化还可提高糖蛋白酶解肽段中糖链的检测。此外,衍生后的寡糖在二级质谱图中信号 强度的提高有利于糖链结构的解析。本方法具有操作简便、无需除盐的特点,可成功用于鸡卵清蛋白N-糖链的质谱分析。
本发明方法的优点有:
1.提高了寡糖质谱分析的信噪比与信号强度。
2.提高了寡糖质谱检测信号的重复性。
3.无需除盐步骤,减少了样品损失。
4.提高了寡糖二级质谱信噪比,改善了碎裂信息,有利于糖链结构解析。
附图说明
图1为寡糖AP衍生反应的原理图。
图2为本方法的示意图。
图3为AP衍生反应条件(A)反应温度(B)乙酸比例(C)溶剂类型(D)AP浓度对产率的影响。
图4为麦芽七糖衍生前经(A)DHB分析(B)DHB-AP分析及(C)麦芽七糖AP衍生后经DHB分析的质谱图。
图5为麦芽七糖衍生前(A)和衍生后(B)检测限的质谱图。
图6为核糖核酸酶B的N-糖链衍生前(A)和衍生后(B)的质谱图。
图7为核糖核酸酶B的N-糖链与其酶解肽段衍生前(A)和衍生后(B)的质谱图。
图8为麦芽七糖MS/MS质谱图(A)衍生前,母离子m/z1175.40(B)衍生后,母离子m/z1252.49(C)衍生后,母离子m/z1230.42。
图9为鸡卵清蛋白的N-糖链衍生前(A)和衍生后(B)的质谱图。
具体实施方式
本发明所依据原理为寡糖的非还原胺化衍生反应(图1),技术方案流程如图2所示,下面通过具体实施例作进一步说明。
实施例1
以麦芽七糖为模式寡糖,优化AP衍生寡糖的反应条件,包括反应温度(25 ℃,60℃,70℃,80℃)、乙酸含量(1%,5%,10%,15%)、溶剂类型(MeOH,ACN)、AP浓度(2mg/mL,4mg/mL,6mg/mL,8mg/mL,10mg/mL),并计算寡糖衍生的产率,结果如图3所示,最终选定最佳衍生条件为糖链在甲醇/乙酸(95/5,v/v)溶剂体系下加入AP衍生试剂(终浓度2mg/mL),70℃反应3小时;此时寡糖衍生的产率在95%以上。
实施例2
1.取100ng/μL麦芽七糖0.5μL与0.5μL10mg/mLDHB基质溶液(50%乙腈,0.1%三氟乙酸)混合,点靶进行MALDI-TOFMS分析,结果如图4A所示,取100ng/μL麦芽七糖0.5μL与0.5μLDHB-AP混合基质溶液(50%乙腈,0.1%三氟乙酸)混合,点靶进行MALDI-TOFMS分析,结果如图4B所示,取100ng/μL麦芽七糖10μL冻干,按照上述最佳条件进行AP衍生,衍生后取0.5μL样品与0.5μL10mg/mLDHB基质溶液(50%乙腈,0.1%三氟乙酸)混合,点靶进行MALDI-TOFMS分析,结果如图4C所示,对比图4A与图4B可以看出,麦芽七糖的信噪比与信号强度提高约2倍,这是由于AP辅助基质的效应促进了其离子化;根据图4C显示,AP衍生后,麦芽七糖完全衍生,且其信噪比与信号强度提高6倍,这一方面是由于AP作为衍生试剂增加了寡糖的疏水性,另一方面作为辅助基质促进了寡糖的离子化;
2.称取0.5mg核糖核酸酶B,溶解于50mM碳酸氢铵(pH8.0)中,沸水浴加热10分钟,冷却后加入0.5μLPNGaseF,37℃反应24小时,反应后溶液经3kDa膜超滤得到N-糖链,纯化的糖链经AP衍生后,点靶进行MALDI-TOFMS分析,同时以未衍生的糖链为对照直接点靶分析,结果如图6所示,从图中可以看出,AP衍生后,五条糖链完全衍生,且信噪比与信号强度都显著提高;
3.称取0.2mg核糖核酸酶B,溶解于25mM碳酸氢铵(pH8.0)中,沸水浴加热10分钟,冷却后加入胰蛋白酶(酶/蛋白=1∶40,w/w),37℃反应20小时,随后加入0.5μLPNGaseF,37℃反应24小时得到N-糖链与酶解肽段混合物,糖链经AP衍生后,点靶进行MALDI-TOFMS分析,同时以未衍生的糖链为对照直接点靶分析,结果如图7所示,从图中可以看出,在酶解肽段存在下,糖链经AP衍生后的离子化效率显著增强。
实施例3
取100ng/μL麦芽七糖0.5μL与0.5μL10mg/mLDHB基质溶液(50%乙腈,0.1%三氟乙酸)混合,点靶进行MALDI-TOFMS/MS分析,结果如图8A所示,按照上述最佳条件进行AP衍生后,点靶选取母离子m/z1252.49进行MALDI-TOF MS/MS分析,结果如图8B所示,选取母离子m/z1230.42进行MALDI-TOFMS/MS分析,结果如图8C所示,与天然寡糖直接碎裂相比,AP衍生寡糖的MS/MS图谱信噪比与信号强度显著增强,且不同的碎裂方式有利于糖链结构解析。
实施例4
称取0.5mg鸡卵清蛋白,溶解于50mM碳酸氢铵(pH8.0)中,沸水浴加热10分钟。冷却后加入0.5μLPNGaseF,37℃反应24小时,反应后溶液经3kDa膜超滤得到N-糖链,纯化的糖链经AP衍生后,点靶进行MALDI-TOFMS分析,同时以未衍生的糖链为对照直接点靶分析,结果如图9所示;通过MS/MS分析结合GlycoWorkbench软件确认糖链的组成,结果如表1所示。
表1为鸡卵清蛋白的N-糖链衍生前后质荷比及组成。
表1
Claims (5)
1.一种提高寡糖基质辅助激光解吸飞行时间质谱离子化的方法,其特征在于,其包括:
(1)以麦芽七糖为模式寡糖,优化2-氨基哌嗪(AP)衍生寡糖的反应条件,包括反应温度、乙酸浓度、溶剂类型与AP浓度,并计算产率;
(2)分别采用DHB基质分析天然麦芽七糖;DHB-AP混合基质分析天然麦芽七糖;DHB基质分析经AP衍生后的麦芽七糖;
(3)采用PNGaseF酶酶切核糖核酸酶B并纯化得到N-糖链,经AP衍生后进行质谱分析,以未衍生的N-糖链为对照;
(4)采用胰蛋白酶酶解核糖核酸酶B,之后用PNGaseF酶酶切得到肽段与N-糖链的混合物,经AP衍生进行质谱分析,以未衍生的肽段与N-糖链的混合物为对照;
(5)对AP衍生前后麦芽七糖进行MALDI-TOF/TOFMS分析;
(6)采用PNGaseF酶酶切鸡卵清蛋白并纯化得到N-糖链,经AP衍生后进行质谱分析,以未衍生的N-糖链为对照;通过二级质谱结合GlycoWorkbench软件分析确认糖链组成。
2.按权利要求1所述的方法,其特征在于,采用2-氨基哌嗪(AP)作为寡糖衍生试剂及MALDI辅助基质。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于,该方法中的反应溶剂体系为甲醇/乙酸(95/5,v/v)。
4.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述的2-氨基哌嗪(AP)终浓度为2mg/mL。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于,该方法的反应中,是70℃下反应3小时。
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