CN109884215B - 一种动物产品中葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物产品中葡萄糖醛酸苷‑莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法，通过对动物样品进行提取和净化等前处理，去除动物样品中无机盐、生物大分子、内源性代谢物等杂质，选择葡萄糖醛酸苷‑莱克多巴胺轭合物质谱裂解的特征离子对作为LC‑MS/MS的监测离子，通过特征离子对峰信号响应情况进行结果判定。本发明具有操作简单、耗时短、效率高、成本低，检测灵敏度高、稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种动物产品中葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法。
背景技术
莱克多巴胺是我国明令禁止在畜牧生产中使用的一种“瘦肉精”类药物，农业农村部和各级畜牧管理部门已将莱克多巴胺列入了畜产品生产质量安全监测计划，每年都会投入大量资金和人力物力对养殖环节非法使用莱克多巴胺的行为进行抽样检测，检测靶标为尿液或肝脏等组织样品。莱克多巴胺在动物体内代谢迅速，主要代谢途径是药物与葡萄糖醛酸苷结合形成“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”。动物产品中莱克多巴胺检测方法主要有两大类：一类是基于抗原抗体反应的速测产品，如酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条，具有前处理简单、成本低、速度快的优点，但是检测结果可靠性差，准确度低，对于检测结果阳性的样品必须通过仪器法进行确证；另一类是基于仪器分析的确证检测方法，主流仪器是液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)，定性定量结果准确，是普遍认可的仲裁方法。但是，由于动物产品中莱克多巴胺主要以“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”的形式存在(王文珺等,中国畜牧兽医,2015,42(1):140-146；王瑞国等,中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会会议论文集.2017.)，目前应用LC-MS/MS检测时首先需要将“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”用β-葡萄糖醛苷酸酶水解成游离态莱克多巴胺(梁晓维等,甘肃农业大学学报,2016(3):8-14；王凤美等,食品安全质量检测学报,2015(12):5023-5028.)，再经过样品前处理净化，供LC-MS/MS检测。这种检测方式存在一定的缺点：①酶解过程中添加缓冲液和β-葡萄糖醛苷酸酶，相当于对样品进行了稀释，并引入大量无机盐离子和蛋白质等杂质，容易污染仪器，并降低检测灵敏度；②酶解过程时间很长，一般需要16小时以上，大约占整个检测时间的80～90％以上，严重影响了检测速度。③β-葡萄糖醛苷酸酶价格高，约占动物样品中莱克多巴胺LC-MS/MS检测总成本的70％左右。目前公开报道的用于直接检测“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”的方法，是采用高分辨质谱(如飞行时间质谱)借助专业代谢物分析软件进行检测，确证的依据是“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”的分子离子精确质量数(Domínguez-Romero,et al.Journal of Chromatography B,2013,923-924:128-135.)。但是，高分辨质谱检测的是“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”分子离子峰，灵敏度较低，只能用于莱克多巴胺高剂量给药水平下对动物体内代谢进行分析，无法满足实际情况下动物样品中莱克多巴胺低浓度残留水平下检测需要。LC-MS/MS采用串联质谱技术，能够选择性监测目标物的前体离子和产物离子，从而大幅提升检测灵敏度和准确度。因此，开发基于LC-MS/MS技术，不需要酶解而直接动物产品中“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”的方法，对于简化检测流程，提高检测速度，降低检测成本具有十分重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物产品中葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法，所述的快速筛查方法可以在不对动物产品进行β-葡萄糖醛苷酸酶解处理的前提下，实现应用LC-MS/MS直接检测葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物，从而大幅提高检测速度、降低检测成本。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种动物产品中葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法，包括以下步骤：
(1)动物样品不经β-葡萄糖醛苷酸酶解，直接进行提取、净化常规前处理；
(2)液相色谱串联质谱(ESI-LC-MS/MS)进行检测，葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物多反应监测离子对为：m/z 478>460、478>284、478.21>164；
(3)检测结果出现明显的总离子流色谱峰，且3个监测离子对m/z 478>460、478>284、478.21>164色谱峰的信噪比(S/N)均大于3，则判定为阳性。
本发明采用上述技术方案所获得的积极效果为：
(1)本发明在探明葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物色谱保留特性和质谱裂解规律的基础上，采用了对葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物直接进行LC-MS/MS检测的方法，无须对动物产品进行β-葡萄糖醛苷酸酶解处理，能够在2h以内完成样品检测，与传统的酶解处理方法相比，极大地缩短了检测时间，简化了检测流程，降低了检测成本，提高了检测效率。
(2)本发明避免了样品在前处理中因β-葡萄糖醛苷酸酶解过程而被稀释和引入新杂质，减轻样品基质对仪器的污染，提高了样品检测的灵敏度和稳定性。
因此，本发明具有操作简单、耗时短、效率高、成本低，检测灵敏度高、稳定性好的优点。
附图说明
图1为本发明技术原理示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。
莱克多巴胺经动物代谢生成“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”，通过动物血液循环系统分布在动物组织中，并且通过动物尿液排出体外。动物组织或尿液中“葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物”在电喷雾离子源—四级杆串联质谱(MS/MS)中发生裂解，首先脱去碳链上的羟基，生成离子碎片m/z 478>460；m/z 478>460进而脱去葡糖糖醛酸苷，生成离子碎片m/z478>284；m/z478>284进一步通过N-C键和C-C键断裂形成m/z478>164、m/z478>136、m/z 478>121和m/z 478>107。其中，碎片离子m/z 478>460、478>284、478.21>164所需碰撞能量较低，质谱峰信号响应最高。
本发明涉及一种动物产品中葡萄糖醛酸苷—莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法，所述葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物是违禁药物莱克多巴胺在动物体内残留的主要形态，所述快速筛查方法是通过对动物样品(尿液和组织样品)进行提取和净化等前处理，去除动物样品中无机盐、生物大分子、内源性代谢物等杂质，选择葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物质谱裂解的特征离子对作为LC-MS/MS的监测离子，通过特征离子对峰信号响应情况进行结果判定。
本发明通过对动物样品进行前处理，达到把“葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物”从样品中提取到溶液中，并且去除动物样品中无机盐、生物大分子、内源性代谢物等杂质的目的，从而降低LC-MS/MS检测过程中的杂质污染和背景干扰，提高检测灵敏度和稳定性。
动物样品前处理方法具体实施中有很多种选择，本发明具体实施例采用的方法是：
(1)对于动物尿液样品，首先向样品中添加高氯酸，以沉淀样品中的蛋白和使样品酸化；离心，取上清液用混合型阳离子交换柱(MCX)进行净化，包括MCX柱活化、平衡、上样、清洗和洗脱；收集洗脱液于离心管中，50℃温度下用氮气吹干；0.1％甲酸-水溶液溶解残渣，过0.22μm尼龙微孔滤膜，供LC-MS/MS检测。
具体的，1mL动物尿液中加入0.1～0.3mL 0.1mol/L的高氯酸；
具体的，离心条件为5000～10000转/min离心5～10min；
具体的，上清液用混合型阳离子交换柱(MCX)进行净化方法为，将MCX柱(离子交换容量1meq/g)置于固相萃取装置上，用3～5mL甲醇活化，再用3～5mL 0.1％甲酸水溶液平衡，将样品离心所得的全部上清液上样过柱，再依次用3～5mL 0.1％甲酸水和3～5mL甲醇淋洗，真空抽干后，用3mL 5％氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃氮气吹干，0.5～1mL0.1％甲酸水溶液复溶，0.22μm微孔滤膜过滤，上机测定。
(2)对于动物肉、肝脏等动物组织样品，首先将动物组织样品切碎，置于离心管中，加入适量0.1％甲酸水溶液，匀浆，加入高氯酸，以沉淀样品中的蛋白和使样品酸化；离心，取上清液用混合型阳离子交换柱(MCX)进行净化，包括MCX柱活化、平衡、上样、清洗和洗脱；收集洗脱液于离心管中，50℃氮气吹干；0.1％甲酸-水溶液溶解残渣，过0.22μm尼龙微孔滤膜，供LC-MS/MS检测。
具体的，2g动物组织样品中添加4～6mL 0.1％甲酸水溶液，置于50mL离心管中，加入0.5～2mL 0.1mol/L的高氯酸；
具体的，离心条件为5000～10000转/min离心5～10min；
具体的，上清液用混合型阳离子交换柱(MCX)进行净化方法为，将MCX柱(离子交换容量1meq/g)置于固相萃取装置上，用3～5mL甲醇活化，再用3～5mL 0.1％甲酸水溶液平衡，将样品离心所得的全部上清液上样过柱，再依次用3～5mL 0.1％甲酸水和3～5mL甲醇淋洗，真空抽干后，用3mL 5％氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃氮气吹干，0.5～1mL0.1％甲酸水溶液复溶，0.22μm微孔滤膜过滤，上机测定。
(3)LC-MS/MS检测
a.所用试剂：甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，高氯酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为MilliQ超纯水。
b.液相条件：ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国Waters公司)，柱温40℃，流速为0.3mL/min，进样体积5μL。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，流动相梯度为0～3min，98％A；3～10min，30％A；10～13min，3％A；13～15min，98％A。
c.质谱条件：四级杆串联质谱(型号TQS，美国Waters公司)，电子喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式，监测离子对为478>460(锥孔电压24V，碰撞能量16eV)，478>284(锥孔电压30V，碰撞能量24eV)，478>164(锥孔电压28V，碰撞能量20eV)；毛细管电压为2.0kV；毛细管温度为450℃；脱溶剂气为高纯氮气，流速为1000L/Hr，碰撞气为高纯氩气，流速为0.13mL/min。
(4)结果分析：对于阳性样品在保留时间(RT)6.4～6.6之间出现明显色谱峰，同时检测到478.21>460.20，478.21>284.15和478.21>164.11等3个离子对信息，动物尿液检出限为0.02ng/mL(以莱克多巴胺计)，动物肝脏检出限为0.15ng/g(以莱克多巴胺计)，动物肌肉检出限为0.10ng/g(以莱克多巴胺计)；对于阴性动物样品，色谱图只有背景基线，无明显色谱峰，相同保留时间范围内的质谱图中未发现478.21>460.20，478.21>284.15和478.21>164.11等3个离子对信息。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种动物产品中葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物的快速筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)动物样品不经β-葡萄糖醛苷酸酶解，直接进行提取、净化常规前处理；包括将动物组织样品切碎，置于离心管中，加入适量0.1％甲酸水溶液，匀浆或者直接向动物尿液样品中添加高氯酸，以沉淀样品中的蛋白和使样品酸化；离心，取上清液用混合型阳离子交换柱进行净化，包括MCX柱活化、平衡、上样、清洗和洗脱；收集洗脱液于离心管中，50℃温度下用氮气吹干；0.1％甲酸-水溶液溶解残渣，过0.22μm尼龙微孔滤膜；
(2)液相色谱串联质谱进行检测，葡萄糖醛酸苷-莱克多巴胺轭合物多反应监测离子对为：m/z478>460、478>284、478.21>164，其中，液相色谱为T3色谱柱，规格为：2.1mm×100mm，粒径1.7μm，柱温40℃，流速为0.3mL/min，进样体积5μL，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，流动相梯度为0～3min，98％A；3～10min，30％A；10～13min，3％A；13～15min，98％A，质谱检测为四级杆串联质谱，采用电子喷雾离子源，正离子扫描方式，多反应监测模式，监测离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量分别为478>460，锥孔电压为24V，碰撞能量为16eV；478>284，锥孔电压为30V，碰撞能量为24eV；478>164，锥孔电压为28V，碰撞能量为20eV；毛细管电压为2.0kV；毛细管温度为450℃；脱溶剂气为高纯氮气，流速为1000L/Hr，碰撞气为高纯氩气，流速为0.13mL/min；
(3)检测结果出现明显的总离子流色谱峰，且3个监测离子对m/z478>460、478>284、478.21>164色谱峰的信噪比均大于3，则判定为阳性。
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