CN112858499A - 一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及液相质谱联用技术领域，公开了一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法，具体包括以下步骤：(1)尿样预处理制备得到待测样本；(2)待测混合标准溶液制备：称取修饰核苷标准品和肌酐标准品，溶解稀释得到不同浓度的标准溶液；称取同位素内标物，溶解稀释得到一定浓度的内标溶液；将上述标准品溶液与内标溶液进行混合得到待测混合标准溶液；(3)将待测样本和待测混合标准溶液进行液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；本发明提供的检测方法中，通过将尿样进行蛋白沉淀和稀释，能够有效的对尿液中的修饰核苷和肌酐进行同时的定性和定量分析。该方法无需复杂的前处理，大大简化了样品前处理的步骤，有效提高肌酐检测灵敏度，有效避免个体样本差异引起的测定误差，极大的提高了修饰核苷定量的准确性。

Description

一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法
技术领域
本发明涉及液相质谱联用技术领域，具体涉及一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法。
背景技术
近年，关于尿液修饰核苷在肿瘤标志物的研究中颇多，在正常细胞中修饰核苷比较稳定，它不像未修饰的核苷会经过再利用通道重新生成RNA或者被各种水解酶水解成尿酸，β-氨基丙酸，β-氨基异丁酸等，而是直接分泌到体外，因此正常成年人个体间核苷排放浓度差异较小，浓度分布在较窄的范围。而在肿瘤发生和发展的过程中，RNA修饰酶高度活跃，且tRNA代谢速率远高于正常细胞，修饰核苷大量排泄到体液中，恶性肿瘤中的tRNA明显区别于正常组织的tRNA,表现为其修饰的核苷种类较多。因此尿中修饰核苷的含量基本反映了tRNA的代谢速度，因而成为多种肿瘤诊断和监测的潜在信号，例如，乳腺癌，头颈癌，胃癌，食道癌，结直肠癌等。
目前，已有报道采用液质联用的方法在分析前需要对尿液中的修饰核苷进行固相萃取，再进行检测。除此之外，肌酐能够标准化各种排泄化合物的水平，肾脏功能损伤不严重时，尿液中肌酐的排泄较少受尿液稀释以及浓缩的影响，因此通常用尿液中肌酐含量作为尿中其他物质排泄的参照物，而已经报道过的文献是基于碱性苦味酸分光光度计法或者高效液相色谱法对尿液中的肌酐进行定量，需要分开检测修饰核苷和肌酐，过程过于繁琐，耗费时间，因此需要一种前处理操作简单、检测高效且同时分析尿液修饰核苷和肌酐的方法。该检测方法基于多反应监测MRM模式，通过内标法对尿液修饰核苷和肌酐定量，以尿液修饰核苷与肌酐的浓度比来作为尿样中修饰核苷的最终含量(nmol/μmol Cr)。
现有技术存在尿液中的修饰核苷需进行富集、肌酐检测灵敏度不高、人体样本差异导致测量误差较大等不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液中修饰核苷和肌酐同时检测新方法。本发明针对需要对尿液中的修饰核苷进行富集、肌酐检测灵敏度不高、人体样本差异导致测量误差较大等现有技术的不足，本发明提供了一种尿液中修饰核苷及肌酐的同时检测方法，具体包括如下步骤：尿液去除蛋白后稀释，采用液质联用技术，实现尿液样本中修饰核苷和肌酐的同时定性和定量检测。
本发明提供的尿液中修饰核苷及肌酐的同时检测方法，包括以下步骤：
(1)尿样预处理制备得到待测样本；
(2)待测混合标准溶液制备：称取修饰核苷标准品和肌酐标准品，溶解稀释得到不同浓度的标准溶液；称取同位素内标物，溶解稀释得到一定浓度的内标溶液；将上述标准品溶液与内标溶液进行混合得到待测混合标准溶液；
(3)将待测样本和待测混合标准溶液进行液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；
任选的，步骤(1)待测样本中还可以加入内标物。
其中，修饰核苷标准品包括但不限于腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞苷(m5C)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基尿苷(m5U)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鸟苷(m2 2G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、尿苷(U)、1-甲基鸟苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)、1-甲基次黄苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)和肌酐(Cr)等。
其中，同位素内标物为N15-2’脱氧腺苷和d3-肌酐。
其中，液质联用检测的液相条件为：流速为0.3mL/min；进样量2μL；极性嵌入键合固定相色谱柱；柱温40℃；使用的流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序为0-2min，A：99％～99％、B：1％～1％；2-7min，A：99～80％、B：1～20％；7-7.01min，A：80～5％、B：20-95％；7.01-10min，A：5％～5％、B：95％～95％；10-10.01min，A：5％～95％、B：95％～1％；10.01-13min，A：99％～99％、B：1％～1％；质谱条件为：采用的离子源为ESI，正离子多反应监测(MRM)扫描，气帘气(CUR)为30Psi，离子源温度(TEM)为550℃，离子源雾化气(GS1)为55Psi，辅助气(GS2)为55Psi，离子源喷雾电压(IS)为5500V。质谱正离子扫描的母离子或产物离子数据如下：
Figure BDA0002874991050000021
Figure BDA0002874991050000031
其中，极性嵌入键合固定相色谱柱，规格为3μm*150mm*2.1mm。
其中，尿样预处理包括沉淀蛋白并分离、稀释等步骤；优选的，尿样预处理包括将尿样离心取上清液，用冰乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡，离心弃去蛋白沉淀，取上清液并用初始流动相稀释尿样上清液，离心，用0.22μm的滤膜过滤上清液；更优选的，尿液前处理步骤具体包括：分析前将尿样放置室温下解冻，5000×g离心10min。取上清液，并用四倍体积的冰乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡，14000×g，4℃离心15min，弃去蛋白沉淀，加入N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)和d3-肌酐(d3-Cr)两种内标物，并用初始流动相稀释上清液至100倍，用0.22μm的滤膜过滤，上清液待用。
其中，步骤(2)具体包括：
(21)称取标准品，用甲醇溶解，并用初始流动相稀释得到不同浓度的标准品溶液；
(22)称取内标物，用甲醇溶解，并用初始流动相稀释得到不同浓度的内标溶液；
(23)将内标溶液加入到标准品溶液中，得到混合溶液，离心，上清液用于待测混合标准液；
本发明提供的检测方法中，采用内标法对尿液中的修饰核苷及肌酐的含量进行检测。在检测过程中，称取标准品用初始流动相使其完全溶解，得到不同浓度的标准液，向标准液中加入内标溶液后经处理得到待测混合标准液，用以进行液质联用检测，分别以各修饰核苷的峰面积与内标物峰面积之比对尿样中各修饰核苷和肌酐的浓度进行线性回归，得到各修饰核苷及肌酐的线性方程，用于对尿液中各修饰核苷和肌酐进行定量分析。
为了保证液质联用检测结果的准确性，本发明采用特定的液相条件和质谱条件，具体的，步骤(3)中，所述液质联用检测的液相条件为：流动相的流速为0.3mL/min；进样量2μL；极性嵌入键合固定相色谱柱；柱温40℃；A和B作为流动相，其中流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0002874991050000041
质谱条件为：采用的离子源为ESI，正离子多反应检测(MRM)扫描，气帘气(CUR)为30Psi，离子源温度(TEM)为550℃，离子源雾化气(GS1)为55Psi，辅助气(GS2)为55Psi，离子源喷雾电压(IS)为5500V。
通过上述液相色谱和质谱检测后，可同时对尿液中的13种修饰核苷和肌酐进行定性和定量分析。并且，分析速度较快，完成一次分析只需13分钟。
由于修饰核苷种类多，为了保证尽可能地将尿液中的修饰核苷分离，进一步优选地，所述液相条件中，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。基于同样的考虑，所述液相条件中，所述色谱柱为极性嵌入键合固定相色谱柱，规格为3μm*150mm*2.1mm。
在本发明提供的检测方法中，所用的标准品包含18种，可实现13种修饰核苷和肌酐的定性和定量分析。在本发明提供的检测方法中，选用N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)和d3-肌酐(d3-Cr)为内标物，稳定性比较好，能够用于对尿液中的修饰核苷及肌酐进行定量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)该方法无需对尿液中的修饰核苷进行固相萃取，有效节省样本前处理时间，简化了前处理步骤；此外，该方法能够实现尿液中修饰核苷和肌酐的同时检测，解决了测定肌酐灵敏度的问题以及分开检测两种化合物时效性等问题，并且有效避免个体样本差异引起的测定误差，极大的提高了修饰核苷定量的准确性
(2)本发明通过对尿样离心和稀释，能够充分还原检测样品的真实性。
(3)本发明通过对液质联用检测过程中的液相条件和质谱条件的优化，实现对尿液中修饰核苷和肌酐的定性和定量分析，灵敏度高，重现性好，分析速度快。
(4)本发明提供的检测方法中，采用N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)和d3-肌酐(d3-Cr)作为内标物，采用腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞苷(m5C)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基尿苷(m5U)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鸟苷(m22G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、尿苷(U)、1-甲基鸟苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)、1-甲基次黄苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)及肌酐(Cr)这18种化合物作为标准品，可对尿液中的13种修饰核苷和肌酐同时进行定性和定量分析，满足实际检测的需要。
本发明提供的检测方法中，通过将尿样进行蛋白沉淀和稀释，能够有效的对尿液中的修饰核苷和肌酐进行同时的定性和定量分析。由于该方法无需复杂的前处理，大大简化了样品前处理的步骤；有效提高肌酐检测灵敏度。采用核苷与肌酐的浓度比值来进行矫正，能够有效避免个体样本差异引起的测定误差，极大的提高了修饰核苷定量的准确性。
附图说明
图1为本发明检测的修饰核苷胞苷(C)的提取离子流色谱图(XIC)
图2为本发明检测的3-甲基胞苷(m3C)的提取离子流色谱图(XIC)
图3为本发明检测的1-甲基腺苷(m1A)的提取离子流色谱图(XIC)
图4为本发明检测的5-甲基胞苷(m5C)的提取离子流色谱图(XIC)
图5为本发明检测的假尿嘧啶核苷(Psu)的提取离子流色谱图(XIC)
图6为本发明检测的尿苷(U)的提取离子流色谱图(XIC)
图7为本发明检测的腺苷(A)的提取离子流色谱图(XIC)
图8为本发明检测的肌苷(I)的提取离子流色谱图(XIC)
图9为本发明检测的鸟苷(G)的提取离子流色谱图(XIC)
图10为本发明检测的5-甲基尿苷(m5U)的提取离子流色谱图(XIC)
图11为本发明检测的N6-甲基腺苷(m6A)的提取离子流色谱图(XIC)
图12为本发明检测的1-甲基鸟苷(m1G)的提取离子流色谱图(XIC)
图13为本发明检测的3-甲基尿苷(m3U)的提取离子流色谱图(XIC)
图14为本发明检测的1-甲基次黄苷(m1I)的提取离子流色谱图(XIC)
图15为本发明检测的N4-乙酰胞苷(ac4C)的提取离子流色谱图(XIC)
图16为本发明检测的N,N-二甲基鸟苷(m2 2G)的提取离子流色谱图(XIC)
图17为本发明检测的6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)的提取离子流色谱图(XIC)
图18为本发明检测的N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)的提取离子流色谱图(XIC)
图19为本发明检测肌酐(Cr)的提取离子流色谱图(XIC)
图20为本发明检测的d3-肌酐(d3-Cr)的提取离子流色谱图(XIC)
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
仪器和材料：
美国AB Sciex公司6500质谱仪，Shimadzu液相色谱仪，色谱柱为Thermo FisherScientific极性嵌入键合固定相色谱柱，规格为3μm*150mm*2.1mm
药品与试剂：
标准品：N,N-二甲基鸟苷(m2 2G)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基胞苷(m5C)、假尿嘧啶核苷(Psu)、1-甲基鸟苷(m1G)、5-甲基尿苷(m5U)、3-甲基尿苷(m3U)、1-甲基次黄苷(m1I)均购买自TRC公司，腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、尿苷(U)购买自MACKLIN公司，N6-甲基腺苷(m6A)购买自MCE公司，1-甲基腺苷(m1A)购买自J&K公司，肌酐(Cr)购买自Sigma Aldrich公司。
内标物：N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)和d3-肌酐(d3-Cr)购买自MTAR公司。
乙腈：色谱纯，Fisher公司。
甲醇：色谱纯，Fisher公司。
甲酸：色谱纯，Fisher公司。
milli-Q水：Millipore公司。
尿样：18例志愿者尿样。
准确称取上述14种标准品，分别用甲醇溶解，分别配制成1mg/mL的溶液，再用初始流动相将腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、N6-甲基腺苷(m6A)、3-甲基胞苷(m3C)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鸟苷(m22G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、1-甲基鸟苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、1-甲基次黄苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)及肌酐(Cr)配制浓度为800ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，400ng/mL，80ng/mL，800ng/mL，400ng/mL，800ng/mL，2400ng/mL，800ng/mL，1600ng/mL，1600ng/mL，800ng/mL，40000ng/mL的标准品混合储备液，再用初始流动相逐级稀释，配制一系列梯度的标准储备液。
准确称取一定量的内标物N15-2dA和d3-Cr，分别用甲醇溶解，分别配制成1mg/mL的溶液，并分别用初始流动相稀释为500ng/mL，10000ng/mL的储备液。
分别取一系列梯度的标准储备液100μL于1.5mL离心管中，并分别加入100μL内标液，用初始流动相定容至1mL，放入高速离心机中进行离心操作，转速设置为14000×g，时间设置为10min。离心结束后取上清液作为待测混合标准液。
取尿液500μl，5000×g，离心10min，取上清液100μl，并加入4倍体积的冰乙腈沉淀蛋白，14000×g，离心15min弃去蛋白沉淀，再分别加入100μl的N15-2dA和d3-Cr的内标液，并用初始流动相定容至1mL，充分混匀，14000×g离心15min，上清用0.22μm滤膜过滤。滤液作为待测样本。
将制得的待测样本和待测混合标准液进样至液质联用仪中进行检测。
所述液质联用检测的液相条件为：流动相的流速为0.3mL/min；进样量2μL；极性嵌入键合固定相色谱柱；柱温40℃；A和B作为流动相，其中流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序如下表所示：
Figure BDA0002874991050000071
质谱条件为：采用的离子源为ESI，正离子多反应检测(MRM)扫描，气帘气(CUR)为30Psi，离子源温度(TEM)为550℃，离子源雾化气(GS1)为55Psi，辅助气(GS2)为55Psi，离子源喷雾电压(IS)为5500V。
待测混合标准液检测结果如图1到20所示。其中，图中横坐标为保留时间，纵坐标为相对强度。图1到20分别为：胞苷(C)，3-甲基胞苷(m3C)，1-甲基腺苷(m1A)，5-甲基胞苷(m5C)，假尿嘧啶核苷(Psu)，尿苷(U)，腺苷(A)，肌苷(I)，鸟苷(G)，5-甲基尿苷(m5U)，N6-甲基腺苷(m6A)，1-甲基鸟苷(m1G)，3-甲基尿苷(m3U)，1-甲基次黄苷(m1I)，N4-乙酰胞苷(ac4C)，N,N-二甲基鸟苷(m2 2G)，6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)，N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)，肌酐(Cr)，d3-肌酐(d3-Cr)
从图1到20中可以看出，各组分出峰顺序为：胞苷(C)，3-甲基胞苷(m3C)，1-甲基腺苷(m1A)，5-甲基胞苷(m5C)，假尿嘧啶核苷(Psu)，尿苷(U)，腺苷(A)，肌苷(I)，鸟苷(G)，5-甲基尿苷(m5U)，N6-甲基腺苷(m6A)，1-甲基鸟苷(m1G)，3-甲基尿苷(m3U)，1-甲基次黄苷(m1I)，N4-乙酰胞苷(ac4C)，N,N-二甲基鸟苷(m2 2G)，6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)，N15-2’脱氧腺苷(N15-2dA)，肌酐(Cr)，d3-肌酐(d3-Cr)。
将待测混合标准液中检测到的各修饰核苷的峰面积与内标物的峰面积之比对工作标准液中各修饰核苷的浓度进行线性回归，得到各修饰核苷的标准曲线。其结果如下标表所示。
13种修饰核苷和肌酐的标准曲线及尿样中修饰核苷经肌酐校正后的含量
Figure BDA0002874991050000081
根据待测尿液各修饰核苷的峰面积与内标物峰面积之比，分别代入表中的标准曲线，得到尿液中各修饰核苷的含量，并经过肌酐值校正，得到校正后的含量。
本发明检测方法基质效应
取尿液500μl，5000×g，离心10min，取上清液100μl，并加入4倍体积的冰乙腈沉淀蛋白，14000×g，离心15min弃去蛋白沉淀，再分别加入100μl的N15-2dA和d3-Cr的内标液，加入100μl一系列梯度的标准储备液，并用初始流动相定容至1mL，充分混匀，14000×g,离心15min，上清用0.22μm滤膜过滤。滤液进行液质联用检测。液质联用检测的液相条件和质谱条件同实施例1。
将加入标准储备液的尿液中检测到的各修饰核苷的峰面积与内标物的峰面积之比对工作标准液中各修饰核苷的浓度进行线性回归，得到各修饰核苷的标准曲线，并将此次标准曲线的斜率与待测标准液的标准曲线中的斜率相比
基质效应在87.5％-111.1％，表明本发明检测方法的基质效应较小。
本发明检测方法精密度准确度分析(日内差日间差分析)
在同实施例1相同的液相色谱质谱条件下，取低中高浓度的混合标准品储备液进行检测，1天内连续进样3次，3天内每天进样三次，结果日内CV在0.13-6.99波动，日间CV在2.3-9.58波动，符合要求。
由上述内容可以看出，本发明提供的检测方法分析速度快，完成一次分析只需13分钟。利用本发明提供的检测方法，快速地对尿液中的13种修饰核苷和肌酐进行定性和定量分析。

Claims (8)

1.尿液中修饰核苷及肌酐的同时检测方法，包括以下步骤：
(1)尿样预处理制备得到待测样本；
(2)待测混合标准溶液制备：称取修饰核苷标准品和肌酐标准品，溶解稀释得到不同浓度的标准溶液；称取同位素内标物，溶解稀释得到一定浓度的内标溶液；将上述标准品溶液与内标溶液进行混合得到待测混合标准溶液；
(3)将待测样本和待测混合标准溶液进行液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；
任选的，步骤(1)待测样本中还可以加入内标物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，修饰核苷标准品含有腺苷、鸟苷、胞苷、肌苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基尿苷、3-甲基尿苷、N,N-二甲基鸟苷、假尿嘧啶核苷、尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基腺苷、6-O-甲基鸟苷、1-甲基次黄苷、N4-乙酰胞苷和肌酐。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，同位素内标物为N15-2’脱氧腺苷和d3-肌酐。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，尿样预处理包括沉淀蛋白并分离、稀释等步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液质联用检测条件为：采用极性嵌入键合固定相色谱柱，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，采用离子源为ESI，正离子多反应监测扫描。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，尿样预处理包括将尿样离心取上清液，用冰乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡，离心弃去蛋白沉淀，取上清液并用初始流动相稀释尿样上清液，离心，用0.22μm的滤膜过滤上清液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，液质联用检测条件中，梯度洗脱程序为0-2min，A：99％～99％、B：1％～1％；2-7min，A：99～80％、B：1～20％；7-7.01min，A：80～5％、B：20-95％；7.01-10min，A：5％～5％、B：95％～95％；10-10.01min，A：5％～95％、B：95％～1％；10.01-13min，A：99％～99％、B：1％～1％。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，极性嵌入键合固定相色谱柱规格为3μm*150mm*2.1mm。
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