CN104826359A - 一种用于动物尿液中“瘦肉精”残留检测前处理的杂质吸附型净化柱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于动物尿液中瘦肉精残留检测前处理的杂质吸附型净化柱及其制备方法。所述净化柱采用C18填料与N-丙基乙二胺以质量比1:1～2混合的混合物为填料。本发明还提供了一种采用该杂质吸附型净化柱对用于动物尿液药物残留检测的尿液样品进行前处理的方法。本发明的净化柱利用混合填料的吸附原理，对流过净化柱的待测尿液中的色素、有机酸等杂质进行选择性吸附，从而使杂质被吸附在净化柱上，经净化的流出液再经微孔滤膜过滤后，可直接用于液相色谱串联质谱仪进行上机测定。优点在于制作方便、操作简单、成本低廉、净化快速、益于环保、适用范围广等特点。

Description

一种用于动物尿液中“瘦肉精”残留检测前处理的杂质吸附型净化柱及其制备方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种用于动物尿液中“瘦肉精”残留检测前处理的杂质吸附型净化柱及其制备方法。

背景技术

“瘦肉精”等违禁药物是影响畜产品质量安全的一类重要危害因子。由于，大部分违禁药物在动物体内主要通过尿液排泄。因此，当前对养殖环节“瘦肉精”等违禁药物的监测方式主要是采集养殖动物的尿液并进行相关药物残留检测。目前，动物尿液中药物残留检测的前处理技术主要有液液萃取和固相萃取两种方式。液液萃取的方法是根据药物目标物溶解度的差异，先通过有机溶剂把目标物从尿液中提取出来，再对溶解了目标物的有机溶剂进行旋转蒸发等步骤对尿液基质进行净化处理。固相萃取的方法是根据药物目标物与吸附剂之间的保留特性，先调节尿液pH值，使尿液通过固相萃取柱，并将目标物保留在固相萃取柱上，再使用洗脱溶剂将目标物从固相萃取柱上洗脱下来，从而达到尿液中药物目标物提取和净化的目的。但是，上述两种净化方式都是基于选择性提取尿液中药物目标物的原理，虽然有净化效果较好，基质干扰较低等优点，但也存在着操作步骤多、时间长、费用高、需要专用配套设备和消耗大量有机溶剂等问题。针对动物尿液的净化，还可以采用吸附杂质从而使被测目标物保留在过滤液中的方式，这也被称为杂质吸附型净化方式。杂质吸附型净化方式具有简单、快速、低廉、环保的特点，但难点在于针对样品基质和被测目标物特性选择合适的吸附材料和配比，进而达到有效去除杂质，却不吸附被测目标物的目的。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种杂质吸附型净化柱。

本发明所提供的杂质吸附型净化柱由柱管和从上而下依次设于所述柱管内的上筛板、混合型填料和下筛板构成，其中，所述混合型填料由C18填料与N-丙基乙二胺(PSA)按照质量比1:1～2混合而成。

本发明所提供的杂质吸附型净化柱是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

a)将C18填料和N-丙基乙二胺(PSA)混合均匀，得到混合型填料；其中，C18填料与N-丙基乙二胺的质量比为1:1～2；

b)在柱管的出液口一端，安装一个筛板(下筛板)，然后向所述柱管内加入所述混合型填料，最后在所述柱管内所述混合型填料上方安装另一个筛板(上筛板)，将所述混合型填料压实，即得所述杂质吸附型净化柱。

上述方法步骤b)中，所述柱管的内径为10mm，长度为50～60mm。

所述混合型填料的填充量为300～400mg。

所述筛板的安装方式可为过盈配合。

所述筛板的材质具体可为聚乙烯。

所述筛板的孔径为5-10μm，具体可为10μm。

本发明的另一目的是提供上述杂质吸附型净化柱的应用。

本发明所提供的杂质吸附型净化柱的应用是其在对用于动物尿液“瘦肉精”残留检测的尿液样品的前处理中的应用。

本发明的再一个目的是提供一种利用所述杂质吸附型净化柱对用于动物尿液“瘦肉精”残留检测的尿液样品进行前处理的方法。

本发明所提供的对用于动物尿液“瘦肉精”残留检测的尿液样品进行前处理的方法，包括下述步骤：

在所述杂质吸附型净化柱的出口端连接微孔滤膜，将待处理动物尿液与高氯酸溶液混合，离心处理，收集上清液，将所述上清液移入所述杂质吸附型净化柱，使所述上清液依次通过所述杂质吸附型净化柱内的上筛板、混合型填料及下筛板，经所述微孔滤膜过滤后流出，得到纯化的尿液样品。

上述方法中，所述微孔滤膜的直径为13-17mm，孔径为0.22μm。

所述高氯酸溶液的质量浓度为30％-40％，具体可为30％。

所述待处理动物尿液与所述高氯酸溶液的体积比为1:0.02-0.03，具体可为1:0.02。

本发明的净化柱利用混合填料的吸附原理，对流过净化柱的液体待测样品中的色素、有机酸等杂质进行选择性吸附，从而使杂质被吸附在净化柱上，经净化的流出液再经微孔滤膜过滤后，可直接用于液相色谱串联质谱仪进行上机测定。本发明的杂质吸附型净化柱及其应用方法的优点在于制作方便、操作简单、成本低廉、净化快速、益于环保、适用范围广等特点。

附图说明

图1为本发明杂质吸附型净化柱的结构示意图。其中，1为管柱；2为上筛板；3为混合型填料；4为下筛板；5为出液管。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所采用的标准品：克伦特罗(Clenpenterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)、马布特罗(Mabuterol)、克仑普罗(Clenproperol)、妥布特罗(Tulobuterol)、氯丙那林(Clorprenaline)、溴布特罗(Brombuterol)、班布特罗(Bambuterol)均为Dr.Ethrenstorfer公司产品，纯度>98.5％。

下述实施例中所采用的柱管(内径10mm，长度50mm，货号：AZ003)、筛板(孔径10μm，货号：AS003-A)、C18(球形封端，货号：S180100)、N-丙基乙二胺(货号：PA0100)、微孔滤膜(直径13mm，孔径0.22μm，货号：AS021320-PT)均购自天津艾杰尔科技有限公司。

实施例1、杂质吸附型净化柱的制备

一、混合型填料的配制

1、准确称取C18填料100g；

2、准确称取N-丙基乙二胺100g；

3、将上述称量好的C18和N-丙基乙二胺置于混合器中充分混合均匀，形成混合型填料。

二、杂质吸附型净化柱的制备

1、取一内径为10mm的柱管；

2、通过过盈连接的方式置一高分子聚乙烯材质的筛板于柱管出液口一端；

3、向柱管中加入300mg上述混合型填料；

4、通过过盈连接的方式置一高分子聚乙烯材质的筛板于混合型填料上方，并将填料压实。

实施例2、杂质吸附型净化柱在猪尿液中“瘦肉精”多残留同步检测中的应用

一、方法性能考察

1、标准溶液制备

标准品：克伦特罗(Clenpenterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)、马布特罗(Mabuterol)、克仑普罗(Clenproperol)、妥布特罗(Tulobuterol)、氯丙那林(Clorprenaline)、溴布特罗(Brombuterol)和班布特罗(Bambuterol)；

准确称取上述标准品，用甲醇溶解并定容，配制成1000μg/mL的单标储备液；准确移取各标准储备液0.5mL，混合于100mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成5μg/mL的混合标准工作液。

2、样品前处理

取动物尿液1mL，向其中加入20μL 30％高氯酸溶液，涡旋震荡1min，3000g离心5min，移取上清液至净化柱内，净化柱出口端连接0.22μm微孔滤膜，通过柱塞杆施压使液体通过净化柱和微孔滤膜流出，控制流速10～15滴/min，使用进样瓶盛接过滤液，供高效液相色谱串联质谱仪测定。

3、仪器方法

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm、2.1×100mm)；柱温:40℃；样品室温度4℃；进样体积5.0μL；流动相A为0.1％(V/V)甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1，流速为0.30mL/min。

表1 流动相梯度条件

质谱采用电子喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式；毛细管电压为2.83kV；毛细管温度为350℃；实验所用脱溶剂气为高纯氮气，流速为800L/Hr，碰撞气为高纯氩气，流速为0.13mL/min。使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。8种“瘦肉精”保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等信息见表2。

表2 “瘦肉精”名称、保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量

*定量离子(Quantification ion)。

4、方法线性范围和检出限

适量移取混合标准工作液，用空白猪尿液配制成浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0ng/mL的混标尿液，按照上述样品前处理方法对混标尿液进行净化处理，液相色谱串联质谱仪测定。结果表明，各种化合物在0.5～50ng/mL浓度范围内的线性方程，线性系数R²均大于0.990，结果见表3。

表3 线性方程、相关系数R²、检出限、定量限

5、方法的精密度和加标回收试验

采用猪尿液基质加标回收实验，加标浓度分别为1.0、5.0、10.0ng/mL，平行6次，基质匹配标准溶液进行定量。不同浓度水平下，各待测物回收率均在70％～110％之间，相对标准偏差(RSD)均小于20％。结果见表4。

表4 不同添加浓度下回收率和相对标准偏差(n＝6)

二、实际样品检测结果比对

分别采用本方法和农业行业标准《动物尿液中11种β受体激动剂的检测液相色谱串联质谱法》(农业部1063号公告-3-2008)对4个克伦特罗阳性猪尿液实际样品进行了检测，每个样品重复测定5次。结果表明，应用两种方法测定结果之间无显著差异(见表5)。

表5 两种测定方法检测实际猪尿液中克伦特罗结果的比较

实施例3、两种净化材料(C18和PSA)组合比例筛选试验

动物尿液是“瘦肉精”类药物代谢排出体外的主要途径，尿液的成分主要包括水、尿素、尿酸、无机盐、色素，以及微量的糖类、蛋白质、酶、激素、抗体和种类繁多的机体代谢产物。通常情况下，由于含有挥发性物质和色素等干扰性杂质，未经净化处理的动物尿液不能直接用于LC-MS/MS检测。否则，一方面会对检测设备和色谱柱造成损害，另一方面由于杂质干扰带来的强烈基质效应会严重降低待测目标物的检测灵敏度。由于C18能够吸附动物尿液中的蛋白质、氨基酸、脂类等非极性物质，PAS能够吸附动物尿液中的金属离子、脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖类物质，而且我们前期的研究已经证实C18和PSA对动物尿液中的克伦特罗等主要几种“瘦肉精”类物质不产生吸附作用。因此，我们选取C18和PSA作为净化材料组合，并对此两种净化材料组合比例进行了进一步的试验筛选。具体方法如下：设定净化材料总量为300mg时6种不同的组合比例(C18:PSA分别为1:0,0:1,1:0.5,1:1,1:2,1:3)，按照上述方法制备成相应的净化柱；随机抽取20头生长猪的尿液，每头猪尿液按照实施例2中样品前处理方式调酸、震荡、离心后，分别取1ml经上述6种净化柱净化，考察过滤液的颜色、气味等感官效果；猪尿液中添加2ng/ml的克伦特罗和莱克多巴胺，按照实施例2描述的方法，分别对6种净化柱做样品添加回收试验，每种5个平行。试验结果见表6，从中可以看出，C18和PSA在总量300mg净化1ml尿液时，其比例在1:1～2时对于去除尿液中的颜色和气味均有明显作用，而且待测目标物回收率能够达到满意效果；在比例＜1:1或＞1:2时，对尿液中颜色或气味的感官净化效果减弱，但对待测目标物回收率影响不大。因此，综合考虑实际样品检测的效果和可操作性，我们选取C18和PSA为1:1～2的比例组合。

表6 两种净化材料(C18和PSA)组合比例筛选试验结果

我们针对动物尿液中瘦肉精检测物，前期试验了多种不同净化材料，如单独使用C18、PSA、或C18与PSA以本发明的1:1～2之外的质量比混合，发现尿液净化效果不理想，处理后的尿液样品不适用于样品直接进行LC-MS/MS仪器测定。

本发明筛选出C18与PSA以质量比为1:1～2的组合，处理后的动物尿液中的蛋白质、氨基酸、脂类等非极性物质以及金属离子、脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖类干扰性物质能够被有效吸附除去，且目标检测物瘦肉精的吸附损失很低，几乎全部保留在处理后的尿液样品中，且处理后的尿液样品基本无味且透明无色，能直接进行LC-MS/MS仪器测定，确保了动物尿液中瘦肉精残留的准确检测。

Claims (8)

1.一种杂质吸附型净化柱，其由柱管和从上而下依次设于所述柱管内的上筛板、混合型填料和下筛板构成，其中，所述混合型填料由C18填料与N-丙基乙二胺按照质量比1:1～2混合而成。

2.一种制备权利要求1所述杂质吸附型净化柱的方法，包括下述步骤：

a)将C18填料和N-丙基乙二胺混合均匀，得到混合型填料；其中，C18填料与N-丙基乙二胺的质量比为1:1～2；

b)在柱管的出液口一端，安装一个筛板，然后向所述柱管内加入所述混合型填料，最后在所述柱管内所述混合型填料上方安装另一个筛板，将所述混合型填料压实，即得所述杂质吸附型净化柱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b)中，所述柱管的内径为10mm，长度为50mm～60mm；

所述混合型填料的填充量为300～400mg。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述筛板的安装方式为过盈配合；

所述筛板的材质为聚乙烯；

所述筛板的孔径为5μm-10μm。

5.权利要求1所述杂质吸附型净化柱在对用于动物尿液药物残留检测的尿液样品的前处理中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述药物残留为瘦肉精残留。

7.一种利用权利要求1所述的杂质吸附型净化柱对用于动物尿液药物残留检测的尿液样品进行前处理的方法，包括下述步骤：

在所述杂质吸附型净化柱的出口端连接微孔滤膜，将待处理动物尿液与高氯酸溶液混合，离心处理，收集上清液，将所述上清液移入所述杂质吸附型净化柱，使所述上清液依次通过所述杂质吸附型净化柱内的上筛板、混合型填料及下筛板，经所述微孔滤膜过滤后流出，得到纯化的尿液样品，其中，所述药物残留为瘦肉精残留。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述微孔滤膜的直径为13-17mm，孔径为0.22μm；

所述高氯酸溶液的质量浓度为30％-40％；

所述待处理动物尿液与所述高氯酸溶液的体积比为1:0.02-0.03。