CN102655919A - 用于色谱介质的容器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于色谱介质的容器或袋和使用此类容器填充色谱柱的方法。所述袋可用于储存和/或运输色谱介质，并且在准备好用于使用时可直接插入色谱柱的室内。

Description

用于色谱介质的容器
发明领域
本发明涉及通过柱色谱法分离化合物。具体地，本发明涉及用于色谱介质的容器或袋和使用所述容器填充色谱柱或制备色谱介质的固结的床的方法。
发明背景
在液体色谱法中使用的柱通常包含封入多孔色谱介质的填充床的管状或圆柱形主体，通过该色谱介质载体液体流动，其中通过在载体液体和多孔介质的固相之间分配而发生分离。圆柱形柱通常称为‘轴向’柱，色谱分离通常在沿着柱的长度向下的垂直方向发生，而管状柱通常称为‘径向’柱，随着载体液体流动至圆筒的中心，在径向方向发生分离。
在任何分离过程之前，床必须通过从待引入到柱中的粒状介质开始制备。目的是高效率分离的常规柱使用床形成的过程，其称为‘填充程序’。在高效率分离中，正确填充的床是影响含有填充床的柱的性能的关键因素。通常，填充床通过浆料填充而制备，即，固结离散的颗粒或纤维在液体中的悬浮液(称为浆料)，将其泵送、倒入或抽吸入柱中。一旦已将预定体积的浆料递送至柱中，需要将其进一步固结和压缩。
在轴向柱中或在轴向色谱法中，可通过将可移动的适配器(adapter)向下沿着柱的纵轴朝向柱的底部移动来压缩浆料，适配器通常以恒定的速度移动。在该程序期间过量的液体在柱出口排出，而介质颗粒借助过滤材料(所谓的‘床载体’或‘玻璃料(frit)’)被保留，过滤材料的孔太小而不能使介质颗粒通过。一旦填充床已压缩了最优压缩程度，则填充过程完成。
在轴向和径向柱两者中使用的用于柱浆料填充的另一种方法为流动填充方法，其中多孔结构的压缩主要通过在柱上施加高流速而实现，由此在出口床载体处开始形成多孔结构。在多孔结构中的颗粒上所得到的曳力最终引起压力下降和床的压缩。压缩的床最终通过将适配器放入就位而限制。目前，仅已知流动填充方法用于填充径向柱。
随后的色谱分离的效率强烈取决于：1) 在填充床的流体入口和出口处的液体分配和收集系统，2) 介质颗粒在填充床中特别的取向(也称为填充几何学)，和3) 填充床的压缩。如果填充床的压缩太低，则在该床上进行的色谱分离遭受“拖尾”，并且通常这种不充分压缩的床不稳定。如果填充床的压缩太高，则该床进行的色谱分离遭受“前伸(leading)”，并且这种过度压缩的床可影响生产量和结合容量，并且，一般而言，得到高得多的操作压力。如果压缩最优，则在使用期间形成的分离峰呈现小得多的前伸或拖尾，并且实质上是对称的。最优压缩程度对于实现多孔结构的良好的长期稳定性也是关键的，因此通过多个过程周期确保最优性能。对于每一种柱尺寸(宽度或直径)、床高度和介质类型，柱所需的最优压缩程度通过实验来确定。
用于轴向柱的备选的填充方法称为“干填充”，其中使用多孔介质的干颗粒填充柱，后来将液体引入柱中。这样的优点在于预填充的柱可干递送至消费者，而无需向填充液体中加入任何防腐剂，并且使在运输期间重量最小化。干填充通常用于目标为分离小分子的二氧化硅介质，例如由G Guiochon J Chromatogr A 704 (1995) 247-268所描述的，但是得到相当差的柱效率。然而，对于可溶胀的色谱介质，例如常用于分离生物分子的基于右旋糖酐或琼脂糖的介质，由于了解颗粒的溶胀可引起填充床的性能差，已避开了干填充。
对于适用于高效率色谱分离的填充床的制备的以上描述的背景，同样适用于目标为高效率地实现生物反应的填充床或固定床，所述生物反应例如酶转化、细胞的处理或粘附于填充床的细胞的生长和培育。
上述柱和填充床也可用于稳定物质，特别是生物分子，例如蛋白、抗体和细胞。例如，这种稳定可改进和促进分子的储存和运输。比起其它浓缩方法(例如过滤、沉淀或冷冻-干燥)可实现的，物质(特别是生物分子)与色谱介质的结合可保存物质的活性和稳定性。
技术问题
存在许多与制备和填充柱的现有方法相关的问题。介质通常在大的容器中载运至操作者，并且在准备填充程序时必须小心称重和转移至柱。由于许多介质不使用并且必须储存，它涉及经过培训的技术人员，这可能为耗时、浪费和昂贵的过程。当介质用于制备需要批准的产品(例如药物和食品)时，还必须满足规章要求。灭菌和清洁介质和/或柱以降低微生物载荷可证明对于使用者来说是困难的。此外，柱通常复杂并且具有大的‘占地面积(footprint)’以进行填充程序。
另一个问题在于，在现有技术中已知的柱由于高成本、复杂性和低灵活性而不适于稳定物质，用于储存和运输的目的。因此，需要提供一种简单的和成本有效的装置和方法，用于通过吸附于色谱介质和在进一步加工或使用之前解吸的过程来实现物质的稳定。
本发明的一个目的是减轻与填充柱和稳定物质用于储存和运输的现有技术方法相关的前述问题。
发明概述
在本发明的第一方面，提供了一种用于色谱介质的柔性袋，所述柔性袋包含与第一液体分配元件和第二液体分配元件连接的非多孔材料的外壁，由此限定用于其中的色谱介质的隔间；所述第一液体分配元件与所述第二液体分配元件相对置；和介质填充口；任选包含与所述外壁连接并且分别与第一和第二液体分配元件相邻的第一和第二尾端件，两个所述尾端件均包含开口，用于接收载体液体的入口或出口；其中第一液体分配元件和/或第二液体分配元件与所述壁熔接(weld)或模塑。
在一方面，袋具有管状结构并且另外包含内壁，其中第一液体分配元件与外壁熔接或模塑，而第二液体分配元件与所述内壁熔接或模塑。优选，袋用于径向色谱法。
在另一方面，袋具有圆柱形结构并且包含与外壁连接并且分别与第一和第二分配元件相邻的第一和第二尾端件，两个所述尾端件均包含开口，用于接收载体液体的入口或出口。
在又一方面，第一和第二尾端件与外壁熔接或模塑。优选，第一和第二尾端件由刚性或半刚性材料制成。合适的材料包括惰性金属或塑料。
在一方面，第一液体分配元件和第二液体分配元件选自过滤器、筛孔和网。优选，分配元件为编织物、筛孔、过滤器和烧结物。
在另一方面，第一液体分配元件和第一尾端件为集成单元，第二液体分配元件和第二尾端件为集成单元。集成单元可例如通过模塑或机械加工而形成。适宜地，第一尾端件部分是由聚丙烯制成的。
在又一方面，袋用于轴向色谱法。
在一方面，袋另外包含第二隔间，其具有入口，用于液压流体。
在另一方面，壁或膜由塑料聚合材料制成，特别是用于熔接或模塑的材料。基于聚乙烯的塑料聚合物特别合适。因此，合适的壁或膜包括，例如，American Renolit Infuflex Barrier 9101 (Solmed? BF 9101；American Ronolit Crop，La Porte，IN，USA)、American Renolit BF-1400 (Solmed? BF-1400 Film；American Renolit Corp，La Porte，IN，USA)、American Renolit 4301 (Solmed? Granuflex，American Renolit Crop，La Porte，IN，USA)、Mitos Durapure (Mitos Technologies，Phoenixville，PA，USA)和Millipore Pureflex Process Container Film (Millipore Corp，Billerica，MA，USA)。
在又一方面，袋另外包含围绕所述壁的半刚性或刚性外壳，以在轴向和/或径向方向提供刚性。
在一方面，袋另外含有湿或干的色谱介质。在一个优选的方面，湿或干的色谱介质为无菌的。袋可通过使用辐射、高压灭菌或化学消毒剂处理而被灭菌。γ辐射特别有效。较温和的处理也可用于减少微生物载荷，或存在于介质中的微生物(例如细菌和真菌)的总数。
在本发明的第二方面，提供了一种填充色谱柱的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 将上文描述的袋插入色谱柱的室中；
b. 关闭柱外壳；和
c. 形成或压缩色谱介质的填充床或固结的床或流化床。
固结的床在本文中定义为在不存在实质的机械压缩下，色谱介质的床的多孔结构。固结的床例如通过向填充色谱介质的悬浮液的轴向色谱柱施加向下的流体流而形成。因此，在柱的出口(在过滤器处)形成多孔的固结的床，直至所有的色谱介质已沉降。这种固结的床可用于实现化学物质(例如蛋白、肽、抗体、核酸或其它生物学分子)的结合。固结的床也可用于结合细胞。
顶部尾端件/过滤器可固定(间隙形成)或朝向或接近固结的床的表面移动，以分别减少截留(hold up)体积和间隙。
本发明的一方面提供一种用于固结的床的柔性容器，其中一个或多个柔性壁被刚性外壳机械支撑，用于当向容器的内部空间和固结的床施加流体压力时提供刚性。
本发明的另一方面提供一种含有色谱介质的柔性容器，并且其中柔性容器及其内含物可在使用化学品载荷于色谱介质之后冷冻。
本发明的另一方面提供一种填充有色谱介质的柔性容器，所述色谱介质可被冷冻、融化，并用于由色谱介质形成固结的床，以施用涉及向所述固结的床施用液体的进一步加工步骤。
在一方面，袋含有干的色谱介质，并且所述填充床的形成通过加入液体溶胀所述介质，以得到液体的溶胀体积Vs为柱室的约105-120%。本文使用的术语“溶胀体积(Vs)”是指在液体中悬浮和平衡的颗粒的等分试样的沉积体积。可如下测量沉积体积：悬浮颗粒的等分试样，平衡最多24小时，如果需要，再悬浮颗粒，让颗粒沉积，在带刻度的容器(例如量筒)中测量沉积体积。
在另一方面，袋含有湿介质，柱外壳为刚性的，并且填充床通过轴向压缩袋而形成或压缩。
在又一方面，柱包含液压室，并且填充床通过使用液压流体填充所述室而形成或压缩。液压室可为柔性袋。在一方面，袋可包含第二隔间，并且填充床通过使用液压流体填充所述第二隔间而形成或压缩。
任选地，柱包含可移动的活塞或适配器，并且填充床通过轴向移动所述活塞或适配器而形成或压缩。
在一方面，将含有湿介质的袋放置覆盖在柱室内的刚性芯之上，并且填充床通过径向压缩袋而形成或压缩。优选，填充床通过径向压缩柱外壳而形成或压缩。在一方面，径向压缩柱外壳通过紧固在外壳的外部上的径向带而实现。
在另一方面，湿介质的体积压缩为5-20%。优选体积压缩为7.0-15%。
在又一方面，所述方法另外包括使用辐射(例如γ辐射)使柱灭菌。类似的处理可用于减少微生物载荷。
在一方面，形成色谱介质的固结的床或流化床，所述方法另外包括以下步骤：d) 在所述固结的床或流化床上载荷化学品或细胞；和e) 从所述色谱柱的所述室移除所述袋，用于储存和/或运输。在一个优选的方面，化学品选自蛋白、抗体、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。
在另一方面，所述方法另外包括储存和/或运输袋的步骤。在-20℃至20℃的温度下储存和/或运输袋。
在其它方面，所述方法另外包括使袋返回色谱柱和从所述固结的床或流化床洗脱所述化学品或细胞的步骤。在一个优选的方面，化学品选自蛋白、抗体、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。
在本发明的第三方面，提供了根据本发明的第一方面的袋的用途，用于储存和/或运输在湿或干的色谱介质上载荷的化学品或细胞。在一方面，在-20℃至20℃温度下储存和/或运输袋。
在本发明的第四方面，提供了包含如上文所述的柔性袋的色谱柱。
根据本发明的第五方面，提供了如上文所述的色谱柱在分离或纯化或加工化学品或细胞中的用途。在一个优选的方面，化学品选自蛋白、抗体、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。优选。
附图简述
图1a和1b显示本发明的熔接的袋(10)的一个实施方案的示意性截面图，其具有可通过轴向压缩而填充的半脊状外壳。
图2a、b和c为含有本发明的袋的圆筒的示意性截面平面图，所述袋可通过径向压缩而填充。
图3a、b和c为说明含有本发明的袋的柱的组合部件的示意性图示，其可通过径向压缩而填充。图3d和e说明组合部件如何装配在一起和操作。
图4a、b和c显示低温储存实验的结果。
附图详述
图1a和1b显示放置在柱(20)中的本发明的熔接的袋(10)的一个实施方案的示意性截面图。袋(10)由与非多孔材料的壁(12)熔接的第一(13)和第二(14)液体分配元件组成。分配元件(13，14)为起过滤器作用的床载体或玻璃料或网或烧结物，具有孔，该孔太小而不能允许色谱介质通过，但是对于液体是多孔的。非多孔材料或膜由塑料聚合物制成，基于聚乙烯的那些特别适于熔接或模塑。例如，合适的膜包括American Renolit Infuflex Barrier 9101 (Solmed? BF 9101；American Ronolit Crop，La Porte，IN，USA)、American Renolit BF-1400 (Solmed? BF-1400 FILM；American Renolit Corp，La Porte，IN，USA)、American Renolit 4301 (Solmed? Granuflex，American Renolit Crop，La Porte，IN，USA)、Mitos Durapure (Mitos Technologies，Phoenixville，PA，USA)和Millipore Pureflex Process Container Film (Millipore Corp，Billerica，MA，USA)。
袋还包含色谱介质填充口(16)，通过该口将干或湿的介质或浆料加入到袋(10)中。在示于图1b的实施方案中，袋(10)具有一个隔间(11)，用于经由口(16)接收介质(未示出)。虽然未示于图1a或1b，袋(10)还包含与外壁(12)连接并且分别与各分配元件(13，14)相邻的第一和第二尾端件。尾端件由刚性或半刚性材料制成，其防止载体液体从袋(10)渗漏，并且具有开口，用于接收载体液体的入口(25)和出口(26)。在一个实施方案中，开口采用弹性膈膜(未示出)形式，其接收载体液体的入口(25)或出口(26)。用于生产尾端件的合适的材料包括惰性金属和塑料例如聚丙烯。优选尾端件与外壁(12)熔接或模塑。
在一个实施方案(未示出)中，尾端件和分配元件可集成为单一单元；合适的材料可包括半柔性塑料例如聚丙烯。该单元可通过机械加工或模塑制备。
在袋的组合部件中使用刚性或半刚性材料使得能形成或压缩填充床。优选，袋及其组合部件由生物学和化学惰性材料制造，这些材料要经过管理官方例如美国食品和药物管理局批准，用于制造药物。
袋(10)还可包含第二隔间(17)，其与袋(10)的第一隔间(11)相邻，充当液压室，以压缩第一隔间(11)，如以下所描述的。在其它实施方案中，第二隔间(17)可为与第一隔间(11)相邻的单独的袋，其充当液压室。
在图1a和1b中，袋(10)被柱(20)外壳(22)和盖(21)封闭，这些组件中至少一个为半刚性或刚性的。袋(10)通过口16填充色谱介质的干粉末或湿浆料。在使用前，在填充介质时柱(20)可通过γ辐照灭菌，或者袋可在装入介质时通过γ辐照或高压灭菌来灭菌，随后储存或载运至使用者。
为了制备介质床用于色谱分离，使用者将袋(10)插入色谱柱(20)的室，关闭柱外壳(22)和盖(21)，使得袋(10)的壁紧紧贴合在室内，在一个实施方案中，使用流动填充方法来压缩床(未示出)。在使用前，填充柱随后还可通过γ辐射灭菌。
在另一个实施方案中，第二隔间或液压室(17)可经由口(24)填充液压流体，以轴向压缩含有介质的袋(10)的第一隔间(11)，以保持床稳定性。
或者，第一隔间(11)可通过存在于柱室中的活塞或适配器机械压缩。
现在通过将含有化合物的载体液体流动进入袋10 (经由入口25)和通过色谱介质，在出口26处收集洗脱液，可发生化合物(例如蛋白)的分离。
或者，载体流动可反向，使得口26用作入口，在口25处收集洗脱液。
在另一个实施方案中，使用者将袋(10)插入轴向色谱柱(20)的室中，关闭柱外壳(22)和盖(21)，使得袋被刚性外壳限制和在垂直方向排列柱，以向袋施用液体，使得形成固结的床。当通过以向下的方向施加流动而形成固结的床时，可在固结的床之上形成间隙。
在另一个实施方案中，更换袋的壁，以减少在固结的床之上形成的所述间隙，以便减少柱的截留体积和/或机械稳定该固结的床。
在使用中，将含有化学品(例如蛋白、肽、抗体、核酸或它们的混合物)或细胞(或细胞混合物)的液体样品在固结的床上载荷，并平衡。随后将袋从柱移除，并且可于低温(例如，-20℃)下储存，使得由于化学、光化学或生物学不稳定性造成的化学品或细胞的损失或破坏最小化。或者，袋可在低温(例如，-20℃)下运输至另一个位置。在低温下储存和/或运输之后，袋可平衡至4℃或超过4℃的操作温度，放置在半刚性或刚性柱中，从色谱介质洗脱化学品或细胞。或者，在4℃或超过4℃的温度下，在平衡和更换刚性或半刚性柱中的袋之后，在色谱介质上载荷的化学品或细胞可经历加工，例如化学或生物学反应。然后加工步骤的产品可从柱中洗脱。
在一个实施方案中，图1的轴向柱设计为圆柱形。在另一个实施方案中，轴向柱设计为具有偏离在圆柱形中所见的圆的横截面形状，例如椭圆或长方形。相应改装限制柱的刚性外壳的形状。例如，可使柱采用在入口和出口侧装配合适的分配系统的2D枕头袋或3D长方形袋的形状。在又一个实施方案中，柱和袋的横截面可横跨尾端件之间的轴向位置而变化，例如，在尾端件处为长方形或椭圆，而在柱的中间为圆形或椭圆。
在另一个实施方案中，在柱和外壳侧面打开和关闭刚性外壳，而不是如图1所述具有可移除的盖。在又一个实施方案中，刚性外壳由在插入袋之后安装在一起的两个或更多个壁片段组成。
图2a、b和c为本发明的袋(210)的示意性截面平面图，其可通过径向压缩而填充。袋(210)实际上为具有中空芯或中心(230)的管状。在所示实施方案中，袋(210)的外壁(212)和内壁(219)已熔接相对的液体分配元件(213，214)，其允许载体液体从袋的外部流向内部(或者以相反的方向，这取决于流动方向)。在所示实施方案中，袋(210)具有半刚性壁(222)，其可对袋(210)的壁(212，219)施加径向压缩力。袋的外部或外壁(212)具有凹处(215)，其允许响应半刚性壁(222)的径向力温和压缩介质填充的袋(210)。袋(210)在这种温和压缩下是稳定的，并且可储存或运输至使用者(图2a)。
通过向袋(210)的壁(222)施加径向机械压缩，实现床填充，如图2b中的箭头所示。由图2c可见，在袋(210)上施加的径向力关闭凹处(215)，并且通过袋传输，压缩其中的介质。
在另一个实施方案中，使用上述流动填充方法实现床的温和压缩。
图3a、b和c显示使用本发明的袋310的径向柱的组合部件。图3a说明具有架台(342)和锁闭盖(344)的圆柱形刚性芯(340)。盖344具有孔或连接器，以容纳介质填充口(348)和用于洗脱液的出口(346)。
图3b描述外部圆柱形壳(350)，通常由半刚性塑料片材(351)组成，其可围绕径向流动袋310缠绕，如图3c所示，并用于径向压缩袋310。在所示实施方案中，片材(351)的长度大于袋310的外圆周，使得存在重叠354，以允许在压缩期间改变片材(351)的直径。其它功能设计(例如将片材打摺)也可用于实现该目的。壳(350)具有孔或连接器(352)，以容纳载体液体入口(325)。
图3c说明本发明的袋(310)。袋具有管状结构，具有中空芯330。第一液体分配元件(313)和第二液体分配元件(314)分别与袋(310)的外壁(312)和内壁(319)熔接。介质入口(316)用于使用介质(通常为浆料形式)填充袋，如图3c中的箭头所示。载体液体经由入口325进入袋，流动通过介质床(未示出)，并经由出口(326，参见箭头)离开。
如下制备径向流动柱(360)：插入袋(310)覆盖在刚性芯(340)之上，围绕袋的外壁缠绕圆柱形壳(350)，和将盖(344)锁闭就位(图3d)。经由入口316使袋填充介质浆料，在密封入口(316)之前，将过量的介质经由出口326或325移除。袋中的介质随后可用载体液体平衡，该载体液体经由入口325进入柱，并经由口326离开。在一个实施方案中，床通过上述流动填充方法压缩。
在另一个实施方案中，将外壳(350)径向压缩，以在袋中形成色谱介质的填充床。径向压缩可采用多种方式实现，例如拉拔重叠354，以倚靠着刚性芯(图3e)收缩和压缩袋。用于压缩的其它手段是可能的，例如夹紧或紧固径向带。一旦外壳350已被压缩，将其固定就位以稳定介质的填充床(例如，通过使用连接带370)。柱现在准备好用于色谱分离化学品，例如蛋白和/或肽。将含有待分离或纯化的化学品的样品溶解于载体液体中，并施用于柱。载体液体经由入口325和第一分配元件313进入袋，在介质床(未示出)之上分配，在介质床上发生分离，并通过第二元件314，以在出口326处离开柱。应理解的是，通过使流动方向反向，柱可反向运行。
低温储存实验
以下详述的实验充分描述于申请人2010年8月5日提交的题为“Stabilization and Storage Media and Method (稳定和储存介质和方法)”的共同待审的美国专利申请61/370878。在国家法律允许的情况下，其内容通过全文引用结合到本文中，就好像其被具体结合一样。
通常已知蛋白(例如，抗体)在溶液中的储存导致随着时间而聚集。通过在仔细设计的缓冲环境中以低且受控的冷冻速率冷冻蛋白溶液，可减少聚集，但是在储存后聚集体含量不可避免地较高。随后使用备选的储存方法进行实验，通过使用不同的凝胶介质以结合或包封靶蛋白。
具有低初始二聚体含量的人多克隆IgG在溶液中或在凝胶介质上的储存
首先使用VIVASPIN? 6超滤单元将人多克隆IgG(1%二聚体)的单体部分浓缩至121.5 AU(A280 nm)，并使用0.2 μm注射器过滤器过滤。将各种实验捕集储存水凝胶介质和对照(非捕集SEC)介质(参见以上材料)分配在96孔滤板(MULTITRAP?板)中。使用人多克隆IgG的浓缩的单体部分作为抗体样品，运行MULTITRAP?方案。并行地，将抗体样品与用于不同的“凝胶介质”的各种缓冲液混合，用于随后在-20℃的溶液中储存。将6.7μl抗体溶液分别与13.3 μl每一种缓冲液混合。
用于凝胶介质的平衡/洗涤和样品的缓冲液为对于不同的所用介质的典型的吸附性捕集缓冲液：
· “pH 5 IEX”=20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0
· “pH 9 IEX”=20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0
· “PBS”=10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14 M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4
· “pH 5 HIC”=25 mM Na-乙酸盐，0.5 mM EDTA，0.75 M (NH4)2SO4，pH 5.0
将各种色谱法凝胶介质储存于96-孔MULTITRAP?板中。将MULTITRAP?板储存于4-8℃的冷藏箱中4周(方案温育时间)，而将抗体样品的溶液于-20℃下储存4周，包括6个冷冻/融化周期。所有的样品一式三份实验，但三个阴离子交换凝胶介质CAPTO? Q、Q SEPHAROSE? FF和Q SEPHAROSE? XL除外，它们作为单一样品实验。温育或储存4周后，收集(凝胶过滤SEC介质SEPHADEX? G-50和SUPERDEX? 200)非结合抗体(流通)或收集结合抗体，随后洗脱抗体(除凝胶过滤介质以外的所有介质)。所用的洗脱和解吸(strip)缓冲液为：
· 洗脱缓冲液：“3.3×PBS”=30 mM Na-磷酸盐，8.1 mM KCl，0.42 M NaCl，pH 7.4(对于用于样品和凝胶介质的平衡/洗涤的缓冲液为“pH 5 IEX”和“pH 9 IEX”的那些样品)；
· 洗脱缓冲液：0.1 M Na-甘氨酸 pH 2.9(对于用于样品和凝胶介质的平衡/洗涤的缓冲液为“PBS”的那些样品)；
· 洗脱和解吸缓冲液：20 mM Tris-HCl pH 7.5(对于用于样品和凝胶介质的平衡/洗涤的缓冲液为“pH 5 HIC”的那些样品)；
· 解吸缓冲液：10 mM NaOH，1 M NaCl (对于用于样品和凝胶介质的平衡/洗涤的缓冲液为“pH 5 IEX”和“pH 5 HIC”的那些样品)；
· 解吸缓冲液：0.5M乙酸(对于用于样品和凝胶介质的平衡/洗涤的缓冲液为“PBS”和“pH 9 IEX”的那些样品)。
洗脱在两步中进行，首先使用洗脱缓冲液，其次使用解吸缓冲液。后者通常在生物加工中用于除去未被洗脱缓冲液洗脱的任何残余的蛋白，并且用于制备用于可能的另外的应用的柱。分别分析对于每一种样品的两个洗脱部分。通过SEC分析在溶液中、在SEC对照介质上或在结合介质上储存的所有的样品。结果示于表1A-1D。
表1A 在pH 5 “IEX”缓冲液(20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0)中，在4-8℃的凝胶介质上储存或在-20℃的溶液中冷冻4周，来自人多克隆IgG的洗脱部分的二聚体含量
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE002
与在-20℃的溶液中储存的样品相比，在这些凝胶介质上储存的所有的样品含有较少的抗体二聚体含量。起始材料含有1.0%二聚体，并且比起该初始二聚体含量水平，使用CAPTO? MMC作为储存凝胶介质的两个重复含有较少的二聚体。
表1B 在“PBS”缓冲液(10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02% Na-叠氮化物，pH 7.4)中，在4-8℃的凝胶介质上储存或在-20℃的溶液中冷冻4周，来自人多克隆IgG的洗脱部分的二聚体含量
与在-20℃的溶液中储存的样品相比，在亲和凝胶介质上储存的样品含有较少的抗体二聚体。然而，在非捕集SEC介质上储存导致较高水平的二聚体。起始材料含有1.0%二聚体，并且比起初始二聚体含量，使用nProtein A或MABSELECT?作为储存凝胶介质导致较少的二聚体含量。
表1C. 在“pH 5 HIC”缓冲液(25 mM Na-乙酸盐，0.5 mM EDTA，0.75 M (NH4)2SO4，pH 5.0)中，在4-8℃的凝胶介质上储存或在-20℃的溶液中冷冻4周，来自人多克隆IgG的洗脱部分的二聚体含量
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE006
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE008
来自HIC凝胶介质的总体回收率差，可能是由于在吸附缓冲液中使用太低传导率(盐浓度)而使得抗体的结合差。为了促进与HIC凝胶介质的结合，需要较高浓度的(NH4)2SO4。得到的结果显示，与在溶液中储存相比，与凝胶介质结合在储存期间得到较少的二聚体，并且对于CAPTO? Phenyl high substitution (高取代，较高配体浓度)介质，二聚体含量小于1.0%(在起始材料中的水平)。
表1D. 在“pH 9 IEX”缓冲液(20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0)中，在4-8℃的凝胶介质上储存或在-20℃的溶液中冷冻4周，来自人多克隆IgG的洗脱部分的二聚体含量
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE010
与在-20℃的溶液中储存样品相比，在CAPTO? Adhere凝胶介质上储存的样品含有较少的抗体二聚体含量。二聚体含量小于在起始材料中所见的1.0%。在其它凝胶介质上储存导致与在溶液中储存大致相同水平的二聚蛋白。
在溶液中或在凝胶介质上储存具有高初始二聚体含量的人多克隆IgG。
使用以下平衡/洗涤缓冲液，将多克隆人IgG (GAMMANORM? 165 mg/ml)稀释至30 mg/ml：
· 20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0
· 20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0
· 10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4
· 50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0
当抗体溶液与含有1.5M (NH4)2SO4的第四种缓冲溶液混合时，一些蛋白沉淀。测量这些起始材料的吸光度(基于澄清的溶液)：
样品缓冲液 A 280 cm-1
20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0 40.6
20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0 40.5
10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4 40.8
50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0 28.5
SPINTRAP?柱填充40 μl以下凝胶介质(即，200 μl 20%凝胶浆料)，并且根据SPINTRAP?方案平衡：
· CAPTO? MMC混合模式介质，20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0
· CAPTO? S阳离子交换介质，20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0
· CAPTO? Adhere混合模式介质，20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0
· CAPTO? Q 阴离子交换介质，20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0
· MABSELECT?，亲和介质，10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4
· SEPHADEX? G-50，对照 SEC介质，10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4
· CAPTO? Phe hs，含有苯基配体的HIC介质，50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0
· pH HIC 6%，基于pH响应的聚合物的HIC介质，50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0
· pH HIC 16%，基于pH响应的聚合物的HIC介质，50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0
平衡后，将40 μl样品加入到每个柱(匹配缓冲液)中。将含有结合的抗体的各凝胶介质的三个SPINTRAP?柱分别于室温(+20℃)、冷藏箱(+4-8℃)和冷冻器(-20℃)中储存。并行地，将在含有各种缓冲液的溶液中的抗体的等分试样也在与SPINTRAP?柱相同的温度下储存。
24-26天温育时间后，将60 μl匹配缓冲液加入到所有的SPINTRAP?柱中。收集流通(非结合部分)并测量吸光度(A280 nm)。
将各种凝胶介质洗涤，随后使用400 μl以下洗脱缓冲液洗脱：
· CAPTO? MMC，20 mM Na-磷酸盐，1 M NaCl，pH 7.0
· CAPTO? S，20 mM Na-磷酸盐，1 M NaCl，pH 7.0
· CAPTO? Adhere，0.5M乙酸
· CAPTO? Q，20 mM Na-磷酸盐，1M NaCl，pH 7.0
· MABSELECT?，0.5M乙酸
· SEPHADEX? G-50，未洗脱，收集流通部分
· CAPTO? Phe hs，20 mM Na-磷酸盐，1 M NaCl，pH 7.0
· pH HIC 6%，20 mM Na-磷酸盐，1 M NaCl，pH 7.0
· pH HIC 16%，20 mM Na-磷酸盐，1 M NaCl，pH 7.0
对洗脱部分测量吸光度(A280 nm)。通过SEC分析来自在溶液中储存的所有样品和来自各种凝胶介质的流通/洗脱部分。抗体回收率和二聚体含量汇总于表2A-4D。
表2A. 人多克隆IgG在凝胶介质上或在溶液中储存后，在洗脱部分中的抗体回收率和二聚体含量。用于储存的缓冲液：20 mM Na-乙酸盐，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 5.0。刚稀释后初始二聚体含量为16.9%。
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE012
在CAPTO? S上储存导致更加降低的二聚体含量，并且抗体回收率高。与在溶液中储存相比，在储存后，CAPTO? MMC得到稍微较低的二聚体含量，在较低温度下具有良好的回收率。
表2B. 人多克隆IgG在凝胶介质上或在溶液中储存后，在洗脱部分中的抗体回收率和二聚体含量。用于储存的缓冲液：20 mM Na-甘氨酸，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 9.0。刚稀释后初始二聚体含量为24.4%。
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE014
与在溶液中储存相比，在CAPTO? Adhere上储存得到更加改进的结果。回收率非常高，可能是二聚体转化为单体，由单体IgG高于100%回收率证明。与在溶液中储存相比，在CAPTO? Q上储存的结果显示较少的二聚体含量，但是回收率小于80%。
表2C. 在储存后，人多克隆IgG 在洗脱部分中的抗体回收率和二聚体含量。用于储存的缓冲液：10 mM Na-磷酸盐，2.7 mM KCl，0.14M NaCl，0.02%(w/v) Na-叠氮化物，pH 7.4。刚稀释后初始二聚体含量为24.6%。
Figure 2010800587650100002DEST_PATH_IMAGE016
与在溶液中储存相比，在MABSELECT?上储存得到更加改进的结果。回收率非常高，可能是二聚体转化为单体，由单体IgG高于100%回收率证明。与在溶液中储存相比，在SEPHADEX? G-50上储存的结果显示稍微较少的二聚体含量，但是在所有的凝胶介质中具有最高的蛋白回收率，可能是由于非结合性质。
表2D. 在储存后，人多克隆IgG 在洗脱部分中的抗体回收率和二聚体含量。用于储存的缓冲液：50 mM Na-乙酸盐，1 mM EDTA，1.5M (NH4)2SO4，pH 5.0。刚稀释后初始二聚体含量由于沉淀而未测量。
对于HIC凝胶介质，由于靶沉淀，无起始材料用于比较。起始材料的吸光度(A280 nm)为28.5 AU，与之相比，其它起始材料的吸光度(A280 nm)超过40 AU。对于pH HIC 6%和pH HIC 16%凝胶介质，净化后蛋白回收率良好。与其它凝胶介质相比，在储存后二聚体含量在低范围内，显示对于聚集稳定化或减少的正面影响。
对于所有的储存条件的结果作为曲线图示于图4A-C。
在CAPTO? Adhere上储存或在MABSELECT?上储存显示非常低水平的二聚体或聚集体，在储存后单体IgG的回收率高，反映在储存期间介质降低二聚体水平的明显能力。
在CAPTO? Adhere上储存或在MABSELECT?上储存显示非常低水平的二聚体或聚集体，在储存后单体IgG的回收率高，反映在储存期间介质降低二聚体水平的明显能力。
刚稀释GAMMANORM?(165 mg/ml)后初始二聚体含量为16.9 -24.6%，这取决于所用的缓冲液。在不同的温度下储存3.5周后，在各种溶液中二聚体含量稍微降低。
与蛋白浓度相比，缓冲液组成、pH、盐含量和类型似乎更快速和程度更高地影响平衡。与在pH 7.4或pH 9.0下储存相比，在pH 5.0下在低盐缓冲液中储存GAMMANORM?，在刚稀释后和储存3.5周后两者均导致低得多的二聚体含量。
温度的影响较不明显。
根据这些实验，对于GAMMANORM?在溶液中的最佳储存条件似乎是在+20℃下，在20 mM Na-乙酸盐，0.02% Na-叠氮化物 pH 5.0中储存。
然而，当在结合介质上储存抗体时，观察到对二聚体含量的最显著的影响。特别是在CAPTO? Adhere和MABSELECT?上，尽管在这些凝胶介质上的储存分别在pH 9.0和pH 7.4下进行。影响如此大，使得当计算单体IgG的回收率时，在CAPTO? Adhere和MABSELECT?上储存的样品的结果高于100%。但是总蛋白回收率从未高于98%(SEPHADEX? G-50，非结合介质)。
因此，在结合介质上储存可具有若干益处，包括：
1. 稳定IgG免于聚集(减慢动力学)
2. 除去IgG二聚体(精练)
3. 促进单体形成(逆转单体/二聚体平衡)。在凝胶介质上储存具有低初始二聚体含量的起始材料将受益于稳定和抛光。从高初始二聚体含量开始，也将受益于降低二聚体的量和提高单体的百分比。
由非结合介质得到的结果显示二聚体含量不降低或很少降低。在由低初始二聚体含量开始的第一实验中，与在溶液中储存相比，在非结合凝胶介质(SUPERDEX? 200和SEPHADEX? G-50)上储存导致稍微更多的二聚体。由高初始二聚体含量开始，与在溶液中储存相比，在SEPHADEX? G-50上储存导致稍微较少的二聚体。然而,与在任何捕集凝胶介质上储存相比，总体二聚体含量总是较高。
技术人员将理解本发明的柔性袋可用于制备分离或反应单元，所述单元，作为用于实现分离或反应过程的填充/膨胀、固结或流化床，依赖于将粒状材料引入柱室内和使材料与流体接触。
虽然已根据各个方面和优选的实施方案描述了本发明，应理解的是，本发明的范围不认为仅局限于此，并且申请人的意图是所有的变体和等价物也落入所附权利要求的范围内。

Claims (37)

1. 一种用于色谱介质的柔性袋，所述袋包含
与第一液体分配元件和第二液体分配元件连接的非多孔材料的外壁，由此限定用于其中的色谱介质的隔间；
所述第一液体分配元件与所述第二液体分配元件相对置；和
介质填充口；
任选包含与所述外壁连接并且分别与第一和第二液体分配元件相邻的第一和第二尾端件，两个所述尾端件均包含用于接收载体液体的入口或出口的开口；
其中第一液体分配元件和/或第二液体分配元件与所述壁熔接或模塑。
2. 权利要求1的袋，其中所述袋具有管状结构并且另外包含内壁，其中第一液体分配元件与所述外壁熔接或模塑，第二液体分配元件与所述内壁熔接或模塑。
3. 权利要求2的袋，所述袋用于径向色谱法。
4. 权利要求1的袋，其中所述袋具有圆柱形结构，并且包含与外壁连接并且分别与第一和第二分配元件相邻的第一和第二尾端件，两个所述尾端件均包含用于接收载体液体的入口或出口的开口。
5. 权利要求4的袋，其中第一和第二尾端件与外壁熔接或模塑。
6. 权利要求4或权利要求5的袋，其中第一和第二尾端件由刚性或半刚性材料制成。
7. 前述权利要求中任一项的袋，其中第一液体分配元件和第二液体分配元件选自过滤器、筛孔、网和烧结物。
8. 权利要求1和权利要求7的袋，其中第一液体分配元件和第一尾端件为集成单元，第二液体分配元件和第二尾端件为集成单元。
9. 权利要求4-8中任一项的袋，所述袋用于轴向色谱法。
10. 权利要求1和4-9中任一项的袋，其中所述袋另外包含具有用于液压流体的入口的第二隔间。
11. 前述权利要求中任一项的袋，其中所述壁由塑料聚合材料制成。
12. 权利要求4-11中任一项的袋，所述袋另外包含围绕壁的半刚性或刚性外壳，以在轴向和/或径向方向提供刚性。
13. 前述权利要求中任一项的袋，所述袋另外含有湿或干的色谱介质。
14. 权利要求13的袋，其中所述湿或干的色谱介质为无菌的。
15. 前述权利要求中任一项的袋，所述袋通过辐射和/或高压灭菌而灭菌。
16. 一种填充色谱柱的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 将权利要求1-15中任一项的袋插入色谱柱的室内；
b. 关闭柱外壳；
c. 形成或压缩色谱介质的填充床或固结的床或流化床。
17. 权利要求16的方法，其中所述袋含有干的色谱介质，并且填充床的形成通过加入液体溶胀所述介质，以得到液体的溶胀体积Vs为柱室的约105-120%。
18. 权利要求16的方法，其中所述袋含有湿介质，所述柱外壳为刚性的，并且所述填充床通过轴向压缩袋而形成或压缩。
19. 权利要求18的方法，其中所述柱包含液压室，并且填充床通过使用液压流体填充所述室而形成或压缩。
20. 权利要求19的方法，其中所述液压室为柔性袋。
21. 权利要求18的方法，其中所述袋包含第二隔间，并且填充床通过使用液压流体填充所述第二隔间而形成或压缩。
22. 权利要求18的方法，其中所述柱包含可移动的活塞或适配器，并且填充床通过轴向移动所述活塞或适配器而形成或压缩。
23. 权利要求16的方法，其中将含有湿介质的权利要求2的袋放置覆盖在柱室内的刚性芯之上，并且填充床通过径向压缩袋而形成或压缩。
24. 权利要求23的方法，其中通过径向压缩柱外壳而施加力。
25. 权利要求24的方法，其中径向压缩所述柱外壳通过紧固在外壳的外部上的径向带而实现。
26. 权利要求16和18-25中任一项的方法，其中所述湿介质的体积压缩为5-20%。
27. 权利要求16-26中任一项的方法，所述方法另外包括使用辐射使柱灭菌。
28. 权利要求16的方法，其中形成色谱介质的固结的床或流化床，所述方法另外包括以下步骤：
d. 在所述固结的床或流化床上载荷化学品或细胞；和
e. 从所述色谱柱的所述室移除所述袋，用于储存和/或运输。
29. 权利要求28的方法，所述方法另外包括储存和/或运输袋的步骤。
30. 权利要求29的方法，其中在-20℃至20℃的温度下储存或运输袋。
31. 权利要求28-30中任一项的方法，所述方法另外包括使袋返回色谱柱和从所述固结的床或流化床洗脱所述化学品或细胞的步骤。
32. 权利要求28-31中任一项的方法，其中所述化学品选自蛋白、抗体、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。
33. 权利要求13-15中任一项的袋的用途，其用于储存或运输在湿或干的色谱介质上载荷的化学品或细胞。
34. 权利要求33的袋的用途，其用于在-20℃至20℃的温度下储存或运输化学品或细胞。
35. 一种色谱柱，所述色谱柱包含权利要求1-15中任一项的柔性袋。
36. 权利要求35的色谱柱在用于分离、纯化或加工化学品或细胞中的用途。
37. 权利要求36的色谱柱的用途，其中所述化学品为蛋白。
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