CN113574383A

CN113574383A - 分离生物分子的方法

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Publication number: CN113574383A
Application number: CN202080023921.3A
Authority: CN
Inventors: O·林德; N·诺尔曼; S·海格布拉德萨尔伯格; R·帕姆格伦
Original assignee: Cytiva Sweden AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2021-10-29
Also published as: US20220229052A1; KR20210143767A; JP7551642B2; JP2022526153A; EP3948283A1; WO2020193483A1; IL286640A; SG11202108951TA; AU2020246969A1

Abstract

本公开涉及用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法，包括以下步骤：(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；(b)使包含所述生物分子的细胞培养物或生物溶液与所述磁性颗粒接触，以获得包含所述结合的生物分子的磁性颗粒；(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；(e1)提供洗脱液的流通过所述磁性分离器，以从所述磁性颗粒洗脱所述结合的生物分子，同时用所述磁场将所述磁性颗粒保持在所述磁性分离器中；(f1)将从所述磁性分离器洗脱的所述生物分子运送到膜色谱法装置；(g1)通过膜色谱法将所述生物分子与杂质和/或污染物分离。

Description

分离生物分子的方法

技术领域

本公开涉及分离生物分子的领域，并且特别涉及在磁性分离器中用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法。

背景技术

通过使用磁性吸附珠分离生物分子是本领域已知的。例如，美国专利US7506765B2描述了用于从悬浮液中选择性分离磁性颗粒的高梯度磁性分离器，该悬浮液通过布置在磁场中的磁性材料的板状分离结构的基质进行。此外，美国专利US6602422 B1涉及用于在微量分离柱上纯化生物材料的分离和释放方法，其通过引用以其整体并入本文。该方法包括从磁性载体释放生物材料，并从微量分离柱洗脱，同时磁性载体仍被微量分离柱内部的铁磁性颗粒基质磁性地保持。专利公开WO2018122246描述了用于从细胞培养物分离生物分子的方法，包括将生物分子结合到磁性珠，通过使用磁性分离器将包括结合的生物分子的磁性珠与细胞培养物的其余部分分离，将包括结合的生物分子的磁性珠作为具有加入的缓冲液的浆料运送到单独的洗脱单元，并且在洗脱单元中从磁性珠洗脱生物分子。此外，专利公开WO2018122089涉及包含多孔基质和嵌入所述基质中的一个或多个磁性颗粒的磁性珠，并且进一步包含共价偶联到多孔基质的免疫球蛋白结合配体。

磁性珠加工是直接从粗进料单元储备中纯化目标生物分子的有效方式，并且该技术可以替代澄清工具，例如离心、过滤和捕获色谱法。磁性珠用对目标生物分子具有亲和力的配体官能化。加入磁性珠并与粗进料混合一定时间以特异性结合进料中的所有目标生物分子。结合后，磁性珠被磁体捕获，同时将细胞和杂质倾析掉。将洗涤缓冲液加入到磁性珠中，并关闭磁体，并进行洗涤缓冲液与磁性珠的混合。混合后，打开磁体以捕获珠，并将洗涤缓冲液倾析掉。在几次洗涤后，以与洗涤缓冲液相同的方式将洗脱缓冲液加入磁性珠中，并使用几个分批洗脱步骤从磁性珠释放目标生物分子。所有洗涤步骤和洗脱步骤都以分批模式进行，并且由于需要进行几个分批洗脱步骤以获得高洗脱产率，与柱色谱法相比，使用该技术将更稀释目标物。此外，使用分批洗脱更难以优化洗脱条件，因为洗脱缓冲液需要滴定洗涤缓冲液以达到正确的洗脱条件以从磁性珠释放目标生物分子，并且对于每个洗脱步骤需要不同或大体积的洗脱缓冲液。克服这一点的一种方式是将经洗涤的珠转移到色谱柱中用于洗脱步骤，以减少洗脱缓冲液的体积，并使用用一种优化的洗脱缓冲液分级来收集洗脱合并物。然而，这需要另外的设备和柱填料，这是耗时的。

因此，本领域需要用于分离生物分子的改进的方法，包括从粗进料有效捕获和纯化生物分子，同时实现减少的方法时间和更成本有效的方法。

发明内容

本公开实现了提供用于分离生物分子的改进的方法的上述目的，本公开涉及通过在磁性分离器中同时施加流动洗脱和搅动来分离生物分子的方法。如本文所示，从而可以通过使用小的洗脱体积以令人惊讶的高产率和纯度直接从磁性分离器中流动洗脱目标生物分子。该方法的精度等于柱色谱法的精度，同时需要显著更短的方法时间。

更具体地，本公开涉及用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(b)使包含所述生物分子的细胞培养物或生物溶液与所述磁性颗粒接触，以获得包含所述结合的生物分子的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

(e)在所述磁性分离器的至少一个平面中搅动所述磁性颗粒，以在所述磁性分离器中形成磁性颗粒的流化床；

(f)在基本上垂直于所述至少一个平面的方向上提供洗脱液的流，以从所述磁性颗粒洗脱所述结合的生物分子，同时用所述磁场将所述磁性颗粒保持在所述磁性分离器中。

本发明人实现的进一步的改进在于磁性分离可以随后是膜色谱法以进一步纯化生物分子。因此，本公开提供用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

(e1)提供洗脱液的流通过所述磁性分离器，以从所述磁性颗粒洗脱所述结合的生物分子，同时用所述磁场将所述磁性颗粒保持在所述磁性分离器中；

(f1)将从所述磁性分离器洗脱的所述生物分子运送到膜色谱法装置；

(g1)通过膜色谱法将所述生物分子与杂质和/或污染物分离。

本公开的优选的方面在以下详细描述和从属权利要求中描述。

附图说明

图1是根据本公开的用于分离生物分子的方法的流程图。

图2示意性地显示适用于本公开的方法的系统。

图3是适用于本公开的方法的磁性分离器的非限制性实施方案的示意图。

图4是显示来自下面实施例1中描述的多克隆IgG实验的洗脱曲线的图。

图5A、5B和5C是显示来自下面实施例2中描述的单克隆抗体(mAb)实验的洗脱曲线的图。

图6是根据本公开的用于分离生物分子的替代方法的流程图。

图7是根据本公开的可以根据用于分离生物分子的替代方法的一个实施方案使用的膜色谱法装置的横截面。

图8A、8B、8C和8D是显示来自下面实施例3中描述的单克隆抗体(mAb)实验的洗脱曲线的图。

具体实施方式

如在图1中说明的，通过提供用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法本公开解决或至少减轻了与用于分离生物分子的现有的方法相关的问题，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

本公开的方法的显著的优点在于，以令人惊讶的低总洗脱体积，更特别地最大10个床体积(例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个床体积，优选最大4个床体积，更优选最大3个床体积)的洗脱液洗脱所述生物分子。本文中，“床体积”应理解为沉降的磁性颗粒的体积，通常以毫升(ml或mL)或升(L)表示。洗脱生物分子所需的总洗脱体积越低，洗脱的生物分子样品越浓且分散越少。在任何随后的抛光步骤中，期望高浓度的生物分子，以避免处理大体积的样品。

如以上提及的，本公开的方法的进一步改进可以包括在磁性分离后通过膜色谱法另外纯化生物分子。因此，如在图6中说明的，本公开提供了用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

(g1)通过膜色谱法将所述生物分子与杂质和/或污染物分离。

在磁性分离之后加入膜色谱法导致非常简单和快速的方法，这导致高纯度的生物分子。

术语“生物分子”在生物加工领域具有其常规含义，其中生物分子由细胞培养物中的细胞产生(通常是重组产生)并通过任何分离和纯化方法从细胞培养物纯化。或者，生物分子存在于生物溶液中，其不一定源自细胞培养物。生物分子的非限制性实例是生物大分子，其是由连接在一起的单体组成的大的生物聚合物，例如肽和蛋白质(其可以是天然的或重组的)，包括但不限于酶、抗体和抗体片段，以及碳水化合物和核酸序列，例如DNA和RNA。生物分子的其它非限制性实例是质粒和病毒。生物分子或生物大分子可以是例如生物药物，即生物分子，包括但不限于生物大分子，其旨在用作药物化合物。本文中，通过本公开的方法待从细胞培养物或生物溶液的其余部分分离的生物分子可以或者称为“目标生物分子”或“目标”。应当理解，“生物分子”旨在是指一类生物分子，并且该术语的单数形式可以包括大量的单个生物分子。

本文中，术语“细胞培养物”是指正培养的细胞或细胞群的培养物，其中所述细胞可以是任何类型的细胞，例如细菌细胞、病毒细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。细胞培养物可以是未澄清的，即包含细胞，或者可以是细胞耗尽的，即不包含或包含很少细胞但包含在去除细胞之前从细胞释放的生物分子的培养物。此外，如在本公开的方法中使用的未澄清的细胞培养物可以包含完整的细胞、破裂的细胞、细胞匀浆和/或细胞裂解物。

术语“生物溶液”旨在是指生物来源的溶液，其包含生物分子或几种类型的生物分子的混合物。生物溶液的实例是源自人或动物的任何类型的体液，例如血浆、血液、痰、尿和乳。

术语“磁性颗粒”在本文中定义为能够被磁场吸引的颗粒。同时，用于本公开的方法的磁性颗粒在不存在磁场的情况下不应聚集。换句话说，磁性颗粒的行为应类似于超顺磁性颗粒。颗粒可以具有任何对称形状，例如球形或立方体，或任何不对称形状。球形磁性颗粒通常称为磁性珠。应当理解，术语“磁性颗粒(magnetic particle)”、“磁性珠(magnetic bead)”、“磁性颗粒(Mag particle)”、“磁性珠(Mag bead)”、“磁性颗粒(magparticle)”和“磁性珠(magbead)”在本文中可互换使用，而不将范围限制为具有球形形状的磁性颗粒。

适合用于本公开的方法的磁性颗粒已经在WO2018122089中描述了，其通过引用以其整体并入本文。特别地，磁性颗粒的体积加权中值直径(d50,v)可以在8-300 μm范围内，例如8、9、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、95、100、105、110、150、200、250或300 µm，优选在20-200 μm范围内，更优选在37-100 μm范围内。此外，适合用于本公开的方法的磁性颗粒的平均密度可以是1.05-1.20 g/ml沉降的磁性颗粒。

适用于本公开的方法的磁性颗粒可以包含多孔基质，优选多孔聚合物基质，和嵌入所述多孔基质中的一个或多个磁性颗粒。磁性颗粒可以适当地包含约5-15重量%的磁性颗粒。嵌入每个磁性颗粒的多孔基质中的磁性颗粒的体积加权中值直径(d50,v)可以是约1至约5 μm。此外，磁性颗粒可以适当地包含在磁性颗粒的中心区域中的磁性颗粒的浓度为在磁性颗粒的表面区域中的浓度的至少200%，其中中心区域定义为距磁性颗粒表面的距离>0.2个颗粒半径，并且表面区域定义为距磁性颗粒表面的距离<0.2个颗粒半径。

用于本公开的方法的磁性颗粒包含能够结合生物分子的配体。配体可以共价偶联到磁性颗粒的多孔基质。应当理解，配体的类型及其对生物分子的亲和力常数k_off/k_on基于待从细胞培养物或生物溶液分离的生物分子的类型来选择。此外，应当理解，每个磁性颗粒的一种或多种配体的浓度取决于或相关于例如细胞培养物或生物溶液中的生物分子的浓度、磁性颗粒的尺寸和/或加入到磁性分离器中的磁性颗粒的总体积。

在本公开的目前优选的实施方案中，用于分离生物分子的本公开的方法中使用的磁性颗粒是Mag Sepharose^TM PrismA (GE Healthcare Bio-Sciences AB, art. no.17550000)。

图2示意性地显示分离系统1的非限制性实例，其可以用于进行根据本公开的方法。系统1包含磁性分离器5。术语“磁性分离器”在分离方法领域中具有其常规含义，并且是指从流体分离磁性颗粒的设备。在本公开的目前优选的实施方案中，用于分离生物分子的方法中使用的磁性分离器为高梯度磁性分离器，或者称为高梯度磁性分离系统(HGMS)，如在US7506765 B2中所述的，其通过引用以其整体并入本文。在图2中所示的分离系统1的部件类似于在WO2018122246中描述的系统的部件，其通过引用以其整体并入本文。磁性分离器5包含入口5a，用于接收来自包含所述生物分子的细胞培养物3或生物溶液3的进料，并用于接收包含能够结合该生物分子的配体的磁性颗粒。磁性分离器5设置用于将具有所述结合的生物分子的所述磁性颗粒与进料的其余部分分离。磁性分离器5包含在磁性分离器内部的磁性或可磁化材料的部件，当施加磁场时，所述部件吸引磁性颗粒。

在图2中所示的分离系统1包含连接到磁性分离器5的入口5a的捕获单元9。在图2中所示的捕获单元9包含用于接收来自细胞培养物3的进料的细胞培养物/生物溶液入口9a和至少一个用于接收磁性颗粒的磁性颗粒入口9b。将捕获单元9设置用于将来自细胞培养物或生物溶液的进料与磁性颗粒混合，因此允许在将目标生物分子运送到磁性分离器5之前将其结合到磁性颗粒。然而，应当理解，捕获单元9是系统1的任选的组件。如果将磁性珠分别加入到细胞培养物3或生物溶液，随后将来自细胞培养物和磁性颗粒的混合物或来自包含结合的生物分子的生物溶液和磁性颗粒的混合物的进料分别提供到磁性分离器5，则细胞培养物3或生物溶液3可以同样良好地用作捕获单元。另一种替代方案是作为替代将磁性珠直接加入到磁性分离器5中。对于所有的实施方案，分别单独加入细胞培养物或生物溶液，以及将磁性珠直接加入到磁性分离器中是可能的。

因此，本公开的方法的步骤(b)可以包括：

(i)将磁性颗粒加入到磁性分离器中，随后将来自细胞培养物或生物溶液的进料提供到磁性分离器中，或者

(ii)将来自细胞培养物和磁性颗粒的混合物，或来自包含结合的生物分子的生物溶液和磁性颗粒的混合物的进料提供给磁性分离器。

应当理解，在步骤(b)之后，即，使包含生物分子的细胞培养物或生物溶液与磁性颗粒接触以将生物分子结合到磁性颗粒之后，在步骤(c)、(d)和(e)中提及的磁性颗粒包含结合的生物分子。

根据以上提及的步骤(d)，本公开的方法可以任选地包括用洗涤液洗涤磁性颗粒。为此，磁性分离器5优选连接到洗涤装置13，该洗涤装置设置用于从磁性分离器5中洗涤掉除了磁性地结合到磁性材料的部分的那些组件之外的其它组件。洗涤装置13包含至少一个洗涤缓冲液提供装置15，其可能经由捕获单元9连接到泵和连接到磁性分离器的入口5a，以及洗涤缓冲液收集装置17，其连接到磁性分离器5的出口5b。洗涤装置13设置用于使洗涤缓冲液流动通过磁性分离器5，用于洗出进料中除了结合到磁性部件的那些组件之外的其它组件。

根据本公开的方法，可以在磁性分离器中以分批模式洗涤磁性珠，所述磁性分离器设置用于当要以分批模式洗涤磁性颗粒时释放磁场。或者，并且有利地，上述方法包括以连续模式施加至少一个洗涤步骤，在这种情况下，上述方法的步骤(d)包括以下子步骤：

(d1)在至少一个平面中搅动磁性颗粒以形成磁性颗粒的流化床，和

(d2)在基本上垂直于所述至少一个平面的方向上提供洗涤液的流，以去除所述细胞培养物或生物溶液，同时将磁性颗粒保持在磁场中。

本文中，短语“基本上垂直于至少一个平面”应被解释为意指与至少一个平面成80-90°的角度。

此外，本公开的方法的步骤(d)可以包括以下子步骤：

(i)去除磁场；

(ii)重悬浮磁性颗粒；

(iii)使磁性颗粒与一部分洗涤液接触；

(iv)用磁场保持磁性颗粒；和

(v)从所述保持的磁性颗粒中去除洗涤液。

作为另外一种选择或除此之外，在进行到步骤(e)或者进行到步骤(e1)之前，本公开的方法的步骤(d)可以重复至少一次，例如1次、2次、3次或更多次。

如在图2中所示的系统1进一步包含用于收集洗脱液和废物的收集单元7。应当理解，在本公开的方法的步骤(f)中，通过允许洗脱液经由入口5a进入磁性分离器5并且通过允许洗脱液经由出口5b离开磁性分离器5，提供洗脱液的流通过磁性分离器5。经洗脱的生物分子与洗脱液一起离开磁性分离器5，并且可以收集在连接到磁性分离器5的出口5b的收集单元7中。

因此，本公开的方法可以任选地在步骤(f)之后进一步包括步骤(g)，所述步骤(g)包括将随洗脱液离开磁性分离器的经洗脱的生物分子收集在收集单元中，同时用磁场将磁性颗粒保持在磁性分离器中。收集单元连接到磁性分离器的出口。

根据替代实施方案，代替收集单元7，如在图2中所示的系统1包含用于生物分子的进一步纯化(也称为抛光)的膜色谱法装置101。在该实施方案中，在本公开的方法的步骤(e1)中，通过允许洗脱液经由入口5a进入磁性分离器5并且通过允许洗脱液经由出口5b离开磁性分离器5，提供洗脱液的流通过磁性分离器5。经洗脱的生物分子与洗脱液一起离开磁性分离器5，并且可以在连接到磁性分离器5的出口5b的膜色谱法装置101中通过与杂质和/或污染物分离而进一步纯化。

应当理解，在图2中所示的系统1中，细胞培养物3或生物溶液3、磁性分离器5和收集单元7(或者备选地膜色谱法装置101)可以通过预灭菌的柔性管和无菌连接器连接。此外，收集单元7(或者备选地膜色谱法装置101)可以预灭菌和一次性使用。由此可以提供一种用于单次使用的封闭的且无菌的分离系统。

用于进行本公开的方法的磁性分离器进一步包含搅动装置(在图2中未显示；一个非限制性实例在图3中所示，如下面进一步描述的)。搅动装置设置成向磁性颗粒施加搅动运动，以使磁性颗粒围绕垂直于通过磁性分离器的流动方向的平面移动。搅动装置可以包含至少一个组件，例如多个组件，其设置用于改变磁场的量级，例如通过施加振荡磁场，即以规则的方式围绕中心点或平面改变量级。因此，本公开的方法的步骤(e) (或者备选地步骤(e1))可以包括通过在磁性分离器的至少一个平面中改变磁场的量级(例如通过在磁性分离器的至少一个平面中施加振荡磁场)来搅动磁性颗粒。或者，搅动装置可以包含至少一个搅动器，例如多个搅动器，在这种情况下，本公开的方法的步骤(e) (或者备选地步骤(e1))包括通过施加或开启一个或多个搅动器来搅动磁性颗粒。本文中，术语“搅动器”是指能够在磁性分离器中搅动(例如旋转或搅拌)磁性颗粒的任何类型的装置或物质/材料。合适的搅动器的非限制性实例是例如可旋转的分离结构的装置，例如可旋转的盘或可旋转的叶片，其附着于磁性分离器的至少一个固定结构，例如安装在形成转子的中心可旋转的承载轴上。分离结构可以例如由金属丝网、穿孔的金属箔或穿孔的金属片组成。

有利地，搅动器可以包含可磁化材料，在这种情况下，搅动器可以用作磁性分离器内部的磁性材料的部件，当施加磁场时，所述部件吸引磁性颗粒。

图3示意性地显示可以用于进行根据本公开的方法的磁性分离器5的非限制性实例的截面图。图3中的箭头说明液体(例如，洗脱液)的流动，其可以在入口5a处进入磁性分离器5，并在出口5b处离开磁性分离器5。磁性分离器5包含外壳6，并且进一步包含中空的圆柱形电磁体11，所述电磁体设置成当电磁体打开时在磁性分离器中产生磁场。磁性分离器进一步包含搅动装置13，所述搅动装置包含转子15，在该转子上安装有多个可旋转的盘17。搅动装置13设置用于根据本公开的方法的步骤(e) (或者备选地步骤(e1))在磁性分离器5的至少一个平面中搅动磁性颗粒21，以在磁性分离器中形成磁性颗粒的流化床。在图3中，磁性分离器5进一步包含多个安装在外壳6上的固定盘19。可旋转的盘17和固定盘19交替地布置在外壳6中。可旋转的盘17和/或固定盘19可以包含可磁化材料。此外，可旋转的盘17和/或固定盘19可以是穿孔的，以允许磁性颗粒和细胞培养物/生物溶液通过盘。应当理解，可旋转的盘的构造和/或固定盘的构造可以与在图3中所示的构造不同。例如，固定盘19可以例如通过密封材料连接到转子15。此外，可旋转的盘可以连接到外壳6的壁或可以不连接到外壳6的壁。进一步应当理解，搅动装置可以包含除图3中所示的组件之外的其它组件。例如，代替或除了具有附着于磁性分离器的固定结构的可磁化材料的部件之外，预期在磁性分离器内部包括磁性或可磁化材料的部件，其不附着于磁性分离器的任何固定结构，例如钢丝绒(steel wool)或钢丝绒(wire wool)的填料或绒絮，并且其在施加磁场时吸引磁性颗粒，并且其具有将磁性颗粒保持在磁性分离器中的磁场中的能力。

本公开的方法的步骤(e) (或者备选地步骤(e1a))可以包括在磁性分离器的至少一个平面中(例如在多个平行的或基本上平行的平面中)搅动磁性颗粒以形成磁性颗粒的多个流化床。本文中，“基本上平行的平面”应被解释为相对于彼此以0-10°的角度布置的平面。在多个平行的或基本上平行的平面的情况下，步骤(f) (或者备选地步骤(e1b))包括在垂直于或基本垂直于多个平面的方向上提供洗脱液的流。不希望受理论的约束，据信如果搅动装置包含多个可旋转组件形式的搅动器，所述多个搅动器平行地布置在磁性分离器内，并且设置成在多个平行的平面中搅动磁性颗粒；可以在每对搅动器之间形成流化床。

在本公开的方法中，在步骤(e) (或者备选地步骤(e1))中的一个或多个搅动器的速度可以在15-1500 rpm范围内，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500，优选在50-300 rpm范围内。

根据替代实施方案，步骤(e)之后的上述步骤(f)和(g)由步骤(e1)之后的步骤(f1)和(g1)代替，包括：

(f1)就从磁性分离器洗脱的生物分子运送到膜色谱法装置；

(g1)通过膜色谱法将所述生物分子与杂质和/或污染物分离。

上文已经描述了根据图2的系统1中的膜色谱法装置101的位置。步骤(g1)可以或者称为生物分子的抛光。

术语“膜色谱法”在生物加工领域具有其常规含义。在膜色谱法中，流体的组分(例如单个分子、缔合物或颗粒)结合到与流体接触的固相的表面。固相的活性表面通过对流运输可接近分子。膜吸附器优于填充色谱柱的优点是它们适于以高得多的流速运行。这也称为基于对流的色谱法。基于对流的色谱法基质包括任何基质，其中在基质的流入和流出之间施加液压差迫使基质灌注，实现一种或多种物质基本上对流输送进入基质或离开基质，这在高流速下非常迅速地实现。基于对流的色谱法和膜吸附器例如描述于US20140296464A1、US20160288089A1、WO2018011600A1、WO2018037244A1、WO2013068741A1、WO2015052465A1、US7867784B2中，由此通过引用以其整体并入本文。

在本公开的方法中，膜色谱法装置可以包含色谱法材料，所述色谱法材料包含一种或多种电纺聚合物纳米纤维，所述电纺聚合物纳米纤维在使用中形成包含多个孔的固定相，流动相能够通过所述孔渗透。固定相可以是膜的形式。

或者，膜色谱法装置可以包含至少一个吸附膜。吸附膜可以包含聚合物纳米纤维。任选地，膜(例如吸附膜)可以包含聚合物纳米纤维的非织造网。

聚合物纳米纤维的平均直径可以是10nm至1000nm。对于一些应用，平均直径为200nm至800nm的聚合物纳米纤维是合适的。平均直径为200nm至400nm的聚合物纳米纤维可能适用于某些应用。

色谱法材料或膜(例如吸附膜)可以包含选自聚砜、聚酰胺、尼龙、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯和聚环氧乙烷及其混合物的聚合物。作为另外一种选择或除此之外，聚合物可以是纤维素聚合物，例如选自纤维素和纤维素的部分衍生物，特别是纤维素酯，例如乙酸纤维素、交联纤维素、接枝纤维素或配体偶联的纤维素。

在本公开的方法中，膜色谱法装置可以包含用以下官能化的色谱法材料：(i)带正电荷的基团，例如季氨基、季铵或胺基，或者(ii)带负电荷的基团，例如磺酸根或羧酸根基团。作为另外一种选择或除此之外，膜色谱法装置可以包含用多模式配体官能化的色谱法材料，所述多模式配体选自多模式阴离子交换配体和多模式阳离子交换配体。多模式阴离子交换配体可以是偶联到载体的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体，其中所述载体通过连接基连接到配体的氮原子。作为另外一种选择或除此之外，膜色谱法装置可以包含用以下官能化的色谱法材料：(i)离子交换剂基团，(ii)亲和力肽/蛋白质基配体，(iii)疏水相互作用配体，(iv) IMAC配体，或者(v) DNA基配体(例如寡聚dT)。

为了增加基于对流的膜吸附剂的表面积和容量，可以减小对流基质的对流孔的尺寸，例如通过使用如以上提及的纳米纤维。然而，结果是，流动阻力将增加。因此，通过包含高容量对流基质的色谱法装置的高流速将需要能够承受高操作压力的色谱法装置和设计。

在本公开的涉及膜色谱法的方法的实施方案中，人们可以使用如在前面提交的专利申请IN 201911019289中详细描述的膜色谱法装置，内部参考号502800-IN-1，其通过引用以其整体并入本文。

如在图7中说明的，薄膜色谱法装置101包含在盒105内提供的色谱法材料单元103。膜色谱法装置101进一步包含流体分配系统107，其设置成将流体分配到至少一个色谱法材料单元103中和从至少一个色谱法材料单元分配出来。色谱法材料单元103夹在如上所述的流体分配系统107的分配装置109a与收集装置109b之间。分配装置109a和收集装置109b在图7中所示的实施方案中是相同的；然而，这不是必需的。在图7中所示的实施方案中，盒105包含色谱法材料单元103和分配装置109a和收集装置109b形式的流体分配系统107。在另一个实施方案中，所述流体分配系统107可以与盒105分开提供，例如作为单独的单元或集成到色谱法装置101的外壳113中。

膜色谱法装置101进一步包含外壳113，在其中提供至少一个色谱法材料单元3和盒105。外壳包含顶板125和底板127。在顶板125中提供用于接收流体进料的入口115，并且在底板127中提供用于从色谱法装置转移流体流出的出口119。顶板125和底板127彼此连接，使得入口流体通道117经由流体分配系统107将入口115与色谱法材料单元103连接，并且出口流体通道121经由流体分配系统107将出口119与色谱法材料单元103连接。

流体分配系统107的分配装置109a可以包含邻接色谱法材料单元103的入口表面153a提供的板(未显示)，其中所述板包含用于将从色谱法装置101的入口115提供的流体进料分配到色谱法材料单元103的多个开口，其中板中的所述开口的总面积小于板的其余面积或小于板的其余面积的20%或小于10%，其中所述开口经由在分配装置109a中提供的一个或多个流体导管(未显示)连接到分配装置入口157a。

此外，流体分配系统107的收集装置9b可以包含邻接色谱法材料单元103的出口表面153b提供的板(未显示)，其中所述板包含用于从色谱法材料单元103收集流体的多个开口，其中板中的所述开口的总面积小于板的其余面积或小于板的其余面积的20%或小于10%，其中所述开口经由在收集装置109b中提供的一个或多个流体导管(未显示)连接到收集装置出口157b。

至少一个色谱法材料单元103可以包含至少一个吸附膜，和/或本文别处描述的色谱法材料中的任何一种或几种。至少一个色谱法材料单元可以包含夹在至少一个顶部间隔层(未显示)和至少一个底部间隔层(未显示)之间的至少一个吸附膜，或者可以包含彼此堆叠在上方并且被间隔层(未显示)间隔开并且夹在至少一个顶部间隔层和至少一个底部间隔层之间的至少两个吸附膜。

所述色谱法装置101的至少一些部件可以密封在一起，至少使入口115和出口119打开。在一些实施方案中，所述色谱法装置101的至少一些部件可以通过塑料或弹性体密封在一起。作为另外一种选择或除此之外，所述色谱法装置101的至少一些部件可以被包覆模制并密封在一起。此外，盒105和/或外壳113可以被包覆模制。包覆模制是用于产生密封和用于为装置提供稳定性的方法，从而提供坚固的膜色谱法装置101。在包覆模制之后，色谱法装置101可以承受至少10巴或至少15巴的操作压力。

在本公开的方法的步骤(f) (或者备选地步骤(e1b))中，在基本上垂直于至少一个平面(或者备选地基本上垂直于多个平面)的方向上的线性流速在10-3000 cm/h范围内，优选在50-600 cm/h范围内。在本公开的方法的其它步骤中相关的情况下，可以施用类似的流速，即在10-3000 cm/h范围内，优选在50-600 cm/h范围内的流速，例如但不限于步骤(d)、步骤(e) (或者备选地步骤(e1))和/或步骤(g) (或者备选地步骤(f1)和/或步骤(g1))。

在本公开的方法的步骤(g1)中，生物分子在膜色谱法装置中的停留时间可以在约0.5秒至约6分钟，优选约1秒至约30秒范围内。这等于生物分子在膜或色谱法材料中的停留时间可以在约0.5秒至约6分钟，优选约1秒至约30秒范围内。

因此，通过膜色谱法装置的洗脱液的流速可以在对应于步骤(g1)中在膜色谱法装置中的停留时间的范围内，所述停留时间在约0.5秒至约6分钟，优选约1秒至约30秒范围内。

通过膜或色谱法材料的洗脱液的流可以是法向流或切向流。

此外，步骤(g1)中的膜色谱法可以是流通膜色谱法。

本公开的方法可以进一步包括在步骤(e1)和步骤(f1)之间进行洗脱液的pH调节、洗脱液的稀释或洗脱液的电导率调节。在本公开的方法中，至少步骤(c)-(f) (或者备选地步骤(c)-(e1)) (例如步骤(b)-(f) (或者备选地步骤(b)-(e1)))可以在磁性分离器中进行。

或者，步骤(b)-(f)或步骤(b)-(e1)分别可以在系统中进行，所述系统包含流体连接到接触器的生物反应器容器和流体连接到磁性分离器的接触器。在开始从细胞培养物/生物溶液分离生物分子之前，生物反应器容器包含细胞培养物/生物溶液。磁性颗粒与细胞培养物/生物溶液的接触可以在接触器中进行，所述接触器可以是细胞培养物/生物溶液和磁性颗粒被输送(例如，泵送、被液体流夹带或通过重力进料)到其中的容器，并且可以将其搅动一定程度以提供快速质量运输到磁性颗粒中。生物反应器容器或接触器可以是例如柔性袋，例如具有一个或多个入口和出口端口的柔性塑料袋。

用于本公开的方法的分离系统可以进一步包含加压布置，例如蠕动泵，其设置成产生通过磁性分离器的流动。或者，通过磁性分离器的流可以仅由重力产生。通常，在系统中施加的使本公开的方法起作用的压力可以比在高压液相色谱法(HPLC)系统中施加的压力低得多。与此相关的优点包括更简单的结构和更低的成本。施加到分离系统的压力的合适范围的非限制性实例是0-0.5巴，例如0.01-0.5巴。

在本公开的方法中，磁性分离器可以连接到色谱法系统(即，替换色谱法系统中的色谱柱)，例如ÄKTA^TM Pilot系统(GE Healthcare)。尽管不需要色谱法系统的泵压性能，但是使用缓冲液控制特征可能是方便的，包括用于梯度产生的双泵、阀和色谱法系统的检测器。

在本公开的方法中使用的系统和/或其中的磁性分离器和/或膜色谱法装置可以设置用于自动、半自动或手动操作。其可以用于中试和制造规模的方法，其中磁性颗粒的量至少在0.1 L至10 L的区间内。其特别适用于从非澄清的进料(例如细胞培养物、生物溶液或细胞裂解物)中捕获生物药物。

“包含”一个或多个所叙述的元件的装置还可以包括未具体叙述的其它元件。术语“包含”包括“基本上由……组成” 作为子集，这意味着该装置具有所列出的组件，而不存在其它特征或组件。同样，“包括一个或多个所列举的步骤”的方法还可以包括未具体列举的其它步骤。

单数“一”和“一个”应当被解释为也包括复数。

在以下实施例中使用的磁性分离器为高梯度磁性分离系统(HGMS)，更特别是MES100 RS (Andritz KMPT GmbH)。然而，应当理解，如上文详细描述的设置的任何类型的磁性分离器可以用于进行本公开的方法。

同样，应当理解，具有能够承受如以上提及的高操作压力的设计的任何类型的膜色谱法装置可以用于进行本公开的方法，因此不限于纤维素纤维色谱法(称为纤维(Fibro)色谱法)盒/单元，如在下面的一些实施例中所使用的。纤维色谱法(GE Healthcare LifeSciences)是用于短方法时间和高生产率的超快色谱法纯化，其利用纤维素纤维的高流速和高容量(https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/products-and-solutions/downstream-bioprocessing/fibro-chromatography)。

另外，用于膜色谱法装置的膜色谱法材料不限于如在下面的一些实施例中所使用的所谓纤维粘附(Fibro adhere)材料。纤维粘附(GE Healthcare Life Sciences)是包含纤维素纳米纤维的材料，其可以用强离子交换多模式配体衍生。合适的膜色谱法材料的另一个非限制性实例是Capto^TM粘附(GE Healthcare Life Sciences)，其基于允许使用高流体速度的刚性琼脂糖基质。用多模式阴离子交换配体N-苄基-N-甲基乙醇胺衍生琼脂糖基质。

实施例1

目的

本研究的目的是使用Mag Sepharose^TM PrismA和高梯度磁性分离器(HGMS)系统MES 100 RS (Andritz KMPT GmbH)结合和洗脱IgG。目的是观察是否可能使用流动洗脱从HGMS系统洗脱IgG。

材料

多克隆IgG (Gammanorm^TM)，Octapharma

NaH₂PO₄ H₂O，pa，Merck

Na₂HPO₄ 2H₂O，pa，Merck

三水合乙酸钠，pa，Merck

乙酸，pa，Merck

Tween^TM 20，Merck

Tris碱，pa，Merck

Mag Sepharose^TM PrismA，GE Healthcare

设备

HGMS设备，MES 100 RS，Andritz KMPT GmbH

25 L塑料缓冲液托盘

混合转子，RW20，Janke & Kunkel

125 mL无菌塑料瓶，Nalgene

分光光度计，GENESYS^TM 10S UV-Vis，Thermo Scientific

玻璃过滤器，G3，~700 mL，Scott Duran

离心机，5810R，Eppendorff

缓冲液

20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl (pH 7.4)

在25 L缓冲液容器中用25 L dH₂O稀释11.35 g Na NaH₂PO₄·H₂O、74.3 g Na₂HPO₄和219.2 g NaCl并混合。

100 mM NaOAc (pH 3.2)

在25 L缓冲液容器中用25 L dH₂O稀释140 mL乙酸和7.4 g NaOAc·3H₂O并混合。

1 M NaOH

用1000 mL milliQ水稀释40 g NaOH并混合。

PBS，具有0.05% Tween

将两片来自Medicago的PBS与2000 mL MilliQ水混合。移液1 mL Tween 20并与溶液混合。

100 mM NaOAc (pH 2.9)

将5.7 mL乙酸和0.02 g NaOAc 3H₂O与1000 mL milli-Q水混合。

方案

Mag Sepharose PrismA的制备

在使用前，在玻璃过滤器(G3孔径)上用5 cv PBS洗涤200 mL Mag SepharosePrismA。

IgG的制备，2mg/ml在6 L中

将12 g (73 ml的165mg/ml) Human IgG (Gammanorm)在6L的20 mM磷酸钠+0.15M NaCl (pH 7.4)中稀释。总体积为6080 ml，并且用UV280分析IgG浓度为1.9 mg/ml。

用IgG孵育Mag Sepharose PrismA 37-100

将400 mL经洗涤的珠转移到装有6 L具有IgG的溶液的桶中，并混合1小时。

HGMS方法

在MES 100 RS系统中打开冷却水、空气压力和蒸馏水。首先用水校准系统的蠕动泵，以在室温下填充1L容量瓶，以洗涤管并从系统去除空气，然后用制备的缓冲液进行校准。

表1：蠕动泵的校准

%泵的速度	流速(L/min)
		5	0.14
10	0.29
		20	0.58
30	0.87
		40	1.16
50	1.45
		60	1.73
70	2.02
		80	2.31
90	2.6
		100	2.89

孵育后，在磁性分离器上使用以下程序：

2 GE-IgG-纯化：

主步骤1：负载磁性颗粒(MP)

子步骤1：负载：在启动前全部停止，步进时间250秒，磁体打开，泵设定值+50%，打开阀XV01和XV14。

使用PBS缓冲液手动泵送剩余的进料以洗涤管。

主步骤2：再循环

子步骤1：再循环：步进时间30秒，磁体打开，泵设定值+30 %，打开阀XV08和XV13。

主步骤3：洗涤缓冲液

子步骤1：进料缓冲液1：步进时间60秒，磁体打开，泵设定值+70 %，打开阀XV02和XV14。

子步骤2：混合缓冲液：在启动前全部停止，步进时间20秒，混合器设定值60%

子步骤3：捕获：步进时间10秒，磁体打开，

子步骤4：再捕获：步进时间60秒，磁体打开，泵设定值+30 %，打开阀XV08和XV13。

子步骤5：过渡：步进时间1秒，磁体打开，打开阀XV02、XV08以及XV13和XV14。

主步骤4：洗涤H2O

子步骤1：进料缓冲液 2：步进时间60秒，磁体打开，泵设定值+70 %，打开阀XV03和XV14。

子步骤2：混合缓冲液 2：在启动前全部停止，步进时间20秒，混合器设定值60%

子步骤3：捕获：步进时间10秒，磁体打开，

主步骤5：洗脱

子步骤1：捕获：步进时间10秒，磁体打开

子步骤2：再捕获：步进时间60秒，磁体打开，泵设定值+30 %，打开阀XV08和XV13。

子步骤3：过渡：步进时间1秒，磁体打开，打开阀XV07、XV08以及XV13和XV16。

子步骤4：进料洗脱液：步进时间4200秒，磁体打开，混合器设定值10%，泵设定值+5%，打开阀XV07和XV16。

在预先称重的125 ml塑料瓶中将洗脱液手工收集到约100 ml级分中。洗脱后，称重每个瓶，并且通过用空瓶体积(51.5 mg)减去总体积来确定每个瓶中的实际洗脱体积。

分析

用2M tris碱中和洗脱液至pH 5。使用分光光度计(得自ThermoFisher的GENESYS)，通过UV280确定所有级分的滴度。

结果、分析和结论

通过用1cm比色皿中的UV280值除以消光系数1.36来计算浓度，以获得IgG的浓度，以mg/ml计。如果UV280值高于1，则稀释样品。将浓度和累积产率针对洗脱的累积体积作图。

在图4中的图显示使用2.7×CV (总磁性珠体积为0.4 L)的产率为98%的明显的洗脱峰。

结论

设定混合和流速，使得在洗脱期间没有磁性珠从磁性室出来。在同时接通磁体的同时进行混合将引起磁性珠悬浮在磁性室中，允许连续洗脱而不是分批洗脱IgG。

该实验显示，在磁性室中与Mag Sepharose Prisma 37-100 µm混合的同时，可以以连续模式洗脱IgG，导致在2.7体积的Mag Sepharose珠中的产率为98%。

实施例2

目的

本研究的目的是使用Mag Sepharose PrismA (37-100 µm)和高梯度磁性分离器(HGMS)系统MES 100 RS (Andritz KMPT GmbH)，使用IgG1单克隆抗体澄清和纯化CHO细胞培养物。目的是观察是否可能使用流动洗脱从HGMS系统洗脱mAb而不损失任何MagSepharose。

材料

CHO细胞培养物，GE Healthcare

NaH₂PO₄ H₂O，pa，Merck

Na₂HPO₄ 2H₂O，pa，Merck

三水合乙酸钠，pa，Merck

乙酸，pa，Merck

Tween 20，Merck

Tris碱，pa，Merck

Mag Sepharose PrismA，37-100 µm，GE Healthcare

mAb标准物，8.82 mg/mL，GE Healthcare

设备

HGMS设备，MES 100 RS，Andritz KMPT GmbH

25 L塑料缓冲液托盘

混合转子，RW20，Janke & Kunkel

125 mL无菌塑料瓶，Nalgene

HPLC，1260 Infinity，Agilent Technologies

玻璃过滤器，G3孔径，~700 mL，Scott Duran

离心机，5810R，Eppendorff

pH计，913 pH计，Metrohm

MabSelect SuRe HiTrap，29-0491-04，GE Healthcare

Superdex 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare

0.2 µm注射器过滤器，Sterivex HV，Millipore

10-100 µL移液管，Mettler Toledo

100-1000 µL移液管，Eppendorff

Cellbag^TM10 L，BC11，Basic，GE Healthcare

条件和观察

溶液的制备：

20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl (pH 7.4)

100 mM NaOAc (pH 3.2)

在25 L缓冲液容器中用25 L dH₂O稀释140 mL 乙酸和7.4 g NaOAc·3H₂O并混合。

1 M NaOH

用1000 mL milliQ水稀释40 g NaOH并混合。

PBS，具有0.05% Tween

100 mM NaOAc (pH 2.9)

将5.7 mL乙酸和0.02 g NaOAc 3H₂O与1000 mL milli-Q水混合。

mAb进料的制备

使用约7 L量的含有mAb的CHO细胞。细胞密度为23.81 MVC/mL，存活率：66.4%，并且mAb滴度为2.7 mg/mL。将细胞泵送到10 L细胞袋(碱性)中。

滴度分析方法，MabSelect SuRe HiTrap结合和洗脱的准备

将MabSelect SuRe HiTrap^TM柱偶联到HPLC系统上。根据下表在250 µL塑料HPLC小瓶中制备mAb (mAb滴度为8.82 mg/mL)的标准曲线。

表2：标准曲线mAb的制备

STD浓度(mg/mL)	STD体积(µL)	PBS体积(µL)
			1	22.7	177.3
2	45.4	154.6
			3	68.0	132.0
4	90.7	109.3
			5	113.3	86.7

描述，MabSelect SuRe HiTrap方法(使用HPLC的滴度)：

注射体积：50 µL

流速：1 mL/min

检测：280 nm

A-缓冲液：PBS+0.05% Tween (pH 7.4)

B-缓冲液：100 mM NaOAc (pH 2.9)

表3：HPLC方法的时间方案

时间(分钟)	%A-缓冲液
		0	100
3	100
		13	30
14	30
		16	0
16.01	100
		18	100
23	100

细胞培养物的滴度确定

将约10 mL细胞悬浮液在3000 rpm下离心5分钟，并且通过监测细胞悬浮液的总体积和固体的总体积确定细胞碎片(固体)的体积为5%。将上清液通过0.2μm过滤器过滤到1mL HPLC小瓶中。根据上述滴度方法确定上清液的滴度。

表4：标准曲线mAb

STD mAb (mg/mL)	响应(mAU)
		0	0
1	3993
		2	8545
3	13293
		4	17301
5	22187

滴度mAb细胞上清液：

响应=11924 mAU

滴度=11924/4383.7=2.72 mg/mL

Mag Sepharose PrismA的制备

在使用前，在玻璃过滤器(G3孔径)上用5 cv PBS洗涤400 mL Mag SepharosePrismA。

用细胞培养物孵育Mag Sepharose PrismA

将400 mL经洗涤的珠转移到装有6250 g CHO细胞悬浮液的瓶中。将磁性珠与CHO细胞悬浮液混合1小时。将1mL样品离心并使用mAbSelect SuRe HiTrap方法(参见以上)分析以研究进料中剩余的mAb (未结合到Mag Sepharose PrismA)。

HGMS方法

在MES 100 RS系统中打开冷却水、空气压力和蒸馏水。用水校准系统的蠕动泵，以在室温下填充1 L容量瓶。

用dH2O灌注待用的入口管和阀XV01、XV02、XV 03、XV 07。通过灌注系统并同时以50%打开混合器直到所有空气被去除来去除磁性分离器中的气泡。循环阀XV08和XV013之间的软管被填充，直到在系统中使用回流不存在空气为止。

在水灌注后，用实际的运行缓冲液灌注系统。

XV01=磁性珠混合物负载(用20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl (pH 7.4)灌注)

XV02=20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl (pH 7.4)

XV03=dH₂O

XV 07=100 mM乙酸钠(pH 3.2)

孵育后，在磁性分离器上使用以下程序。

步骤1：负载磁性颗粒和进料的混合物

将泵送时间设定为250秒以泵入6 L进料混合物。使用PBS缓冲液手动泵送剩余的进料，以洗涤混合物的入口管。

将系统设定为再循环以捕获分离单元中的可磁化盘上的所有磁性珠。

步骤2：用20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl洗涤，重复4个周期

子步骤1. 使用70%泵速度进料缓冲液60秒(2 L缓冲液)。

子步骤2. 将缓冲液和珠混合20秒，并且60%转子速度，将磁体和阀关闭。

子步骤3. 通过打开磁体来捕获珠。

子步骤4. 再捕获。再循环，以使用30%的泵速率捕获所有珠。

子步骤5. 过渡。短时(1秒)打开阀，以避免背压。

步骤3：用水洗涤，1个周期

使用与使用20 mM磷酸钠+0.15 M NaCl洗涤的水洗涤处相同的子步骤，不同之处在于水从阀XV03泵送。

步骤4：洗脱

在该步骤中，我们使用混合器打开和磁体打开来流动洗脱mAb。

子步骤1. 捕获。打开磁体。

子步骤2. 再捕获。使用30%泵速度再循环60秒。

子步骤3. 过渡。短时(1秒)打开阀，以避免背压。

子步骤4. 进料洗脱液：用100 mM NaOAc (pH 3.2)洗脱，阀XV07。磁体打开，泵速度为5% (140 mL/min)，混合器设定在10%。洗脱进行4286 s。

在预先称重的150 ml塑料瓶中将洗脱的材料手工收集到约100 ml级分中。

洗脱后，称重每个瓶，并且通过用空瓶体积减去总体积来确定每个瓶中的实际洗脱体积。参见下表5。

表5：洗脱级分的体积

级分	体积(g，mL)
		4	115.51
5	111.22
		6	89.7
7	102.61
		8	97.7
9	92.7
		10	99.25
11	107.55
		12	115.19
13	109.14
		14	112.26
15	109.22
		16	125.24
17	114.47
		18	121.98
19	113.73
		20	112.8
21	115.34
		22	121.87
23	121.87
		24	111.03
25	162.53

洗脱液级分是浅黄色的和澄清的。

用2M tris碱中和洗脱液至pH 5，然后将它们经过0.2 µm过滤。2 M Tris碱的实际体积包括在上述洗脱液的重量中。通过MagSelect SuRe HiTrap结合和洗脱测定在所有级分中确定滴度，见上文。

最后，合并级分7-18，并且1 mL该合并物用200 mM磷酸钠(pH 6.8)在1.5 mL HPLC小瓶中稀释20倍，并在HPLC系统上用分析尺寸排阻色谱法(SEC)分析，并与mAb标准物(用相同的缓冲液稀释8倍)比较。

释放分离器中的Mag Sepharose并泵送回容器中。在G3玻璃过滤器上用2 cv 1 MNaOH洗涤树脂30分钟，用5 cv PBS平衡，并最后用2 cv 20%乙醇作为保存溶液洗涤，并且将树脂转移回具有20% EtOH的塑料瓶中储存。

通过SEC方法的纯度

注射体积：10 µL

流速：0.8 mL/min

柱：Superdex 200 Incresae 10/300 GL

停止时间：26分钟

在214 nm下检测。

HCP分析

在起始和合并物洗脱液样品中，在宿主细胞蛋白质(HCP)分析之前，将50µL保存溶液加入到450 µL样品中。

使用第3代 CHO-HCP ELISA试剂盒(Cygnus)在Gyrolab工作站(Gyros ProteinTechnologies)上用软件包5.3.0进行分析。

结果、分析和结论

图5A显示mAb从磁性分离器中的洗脱曲线。合并的级分(级分7-18，相应于1.2 L洗脱液)显示使用3个床体积(1个床体积=400 mL)的洗脱缓冲液可以获得87%的mAb产率。合并的洗脱液的浓度为10.7 mg/mL，为4x浓度。孵育步骤中的结合产率为94%，并且总洗脱产率为91%。

通过SEC和HCP测定来分析合并的样品，并且与纯mAb标准物比较。结果在图5B (较小规模)和图5C (较大规模；基于峰值放大)中显示。实线是合并的mAb洗脱液，而虚线是纯mAb标准物。色谱图被标准化。将聚集峰、主峰和主峰后的峰积分，并确定纯度为98.5%。

实施例3

目的

本研究的目的是研究哪种混合速度(转子速度)和流速可以用于使用磁性流化的珠从Mag Sepharose PrismA流动洗脱IgG，而没有珠的迁移。还研究了IgG洗脱曲线如何受到不同混合速度、珠体积和珠尺寸的影响。

设备

HGMS分离器，MES100RS系列编号400213239，Andritz Gmbh

孵育时的混合器，IL82274-3，Janke-Kunkel

UV读取器，SpectraMax^TM plus，Molecular Devices

UV读取板，96孔，3635 lot 33918007，Corning

天平，PG 5002 DeltaRange，Mettler

塑料瓶130 mL

25 L塑料缓冲液瓶

Mag Sepharose prismA 0-37 µm Lot LS-033447，GE Healthcare

Mag Sepharose PrismA 37-100 µm LS-32871，GE Healthcare

材料

Human IgG，Gammanorm165 mg/mL，Octapharma

NaH₂PO₄·H₂O，pa，Merck

Na₂HPO₄·2H₂O pa，Merck

NaCl，pa，Merck

乙酸，pa，Merck

乙酸钠·3H₂O，pa，Merck

条件和观察

溶液的制备：

A-缓冲液，20 mM PO₄+0.15 M NaCl (pH 7.5)

缓冲液盐量(g)	组分	Mw (g/mol)
			11.356	Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> (×1 H<sub>2</sub>O)	137.99
74.347	Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> (×2 H<sub>2</sub>O)	177.99
			219.15	NaCl	58.44
25升	含有水的最终体积

B-缓冲液，0.1 M乙酸钠(pH 3.2)

缓冲液盐量(g)	组分	Mw (g/mol)
			139.853 ml	乙酸	60.05
7.431	乙酸钠(×3 H<sub>2</sub>O)	136.08

25升	含有水的最终体积

IgG 2 mg/mL

将73 mL的IgG (Gammanorm)稀释到6 L A-缓冲液中，以获得IgG浓度为约2.0 mg/mL。

测试转子速度和流速以研究珠损失

在打开磁体的情况下，将100 mL、300 mL或400 mL (湿沉降的树脂) MagSepharose Prisma 37-100 µm或0-37 µm泵入HGMS系统中。转子以不同的速度打开，并且还改变具有A-缓冲液的流量泵，以研究磁性珠开始从HGMS室迁移(视觉上)的转子速度和流速。

结果示于下表6-10中。

负载100 mL Mag Sepharose 0-37 µm：用150 rpm的转子速度，最高2100 mL/min，捕获珠。在225 rpm转子速度下珠开始迁移出HGMS。

负载300 mL Mag Sepharose 0-37 µm：用75 rpm的转子速度，最高560 mL/min，捕获珠。

负载100 mL Mag Sepharose 37-100 µm：用150 rpm的转子速度，最高2100 mL/min，捕获珠。

负载300 mL Mag Sepharose 37-100 µm：用150 rpm的转子速度，最高560 mL/min，捕获珠。以140 mL/min，在300 rpm转子速度下，珠还仍被捕获。

负载400 mL Mag Sepharose 37-100 µm：用75 rpm的转子速度，最高1400 mL/min，捕获珠。

对于所有负载，比起珠开始迁移出HGMS系统的转子速度，可能在较低转子速度下运行更高的流速。参见各表。

表6：对100 mL Mag Sepharose 0-37 µm的磁性珠迁移研究。

表7：对300 mL Mag Sepharose 0-37 µm的磁性珠迁移研究。

表8：对100 mL Mag Sepharose 37-100 µm的磁性珠迁移研究。

表9：对300 mL Mag Sepharose 37-100 µm的磁性珠迁移研究。

表10：对400 mL Mag Sepharose 37-100 µm的磁性珠迁移研究。

流动洗脱IgG研究

将400 mL的每种树脂原型与6 L的IgG 2 mg/mL样品一起孵育>1小时。

将100 mL或400 mL (1.6 L或6.4 L IgG树脂混合物)吸附IgG的Mag SepharosePrismA泵入系统中，并通过磁体捕获磁性珠，并且用1 L A-缓冲液洗涤磁性珠三次。

以140 mL/min的不同转子速度进行洗脱，以研究珠体积和转子速度如何影响洗脱性能。

洗脱时，收集约100-2100 mL级分，并且使用UV板读取器确定每个级分的吸光度，并且还使用称重确定每个级分的精确体积。将每个级分的UV针对累积洗脱体积作图。参见图1-4。

通常，0%转子旋转显示IgG的洗脱不足，因为在若干柱体积的洗脱缓冲液(>4000mL)之后，在洗脱液中仍然存在高浓度的IgG，并且洗脱曲线显示没有浓度下降的趋势。

对于<37μm的珠，较小体积的珠导致转子速度的较小依赖性。对于100 mL的珠，对于75 rpm和150 rpm转子速度的洗脱峰的形状相似(图8A)。对于400 mL的珠，洗脱峰的形状在转子速度之间更显著不同，其中使用150 rpm的IgG洗脱最有效(图8C)。

对于37-100 μm的珠，较小体积的珠导致转子速度的较小依赖性。对于100 mL的珠，对于75 rpm转子速度和150 rpm转子速度的洗脱峰相似(图8B)。对于400 mL的珠，在150rpm旋转和0 rpm旋转之间洗脱峰的形状显著不同。在150 rpm旋转下，IgG在对称的洗脱峰中被洗脱，而在0 rpm旋转下，在6500 mL洗脱缓冲液后IgG仍然被洗脱(图8D)。

比较0-37 μm的珠与37-100 μm的珠，使用100 mL珠时洗脱峰形相似(分别参见图8A和图8B)。在400 mL珠和150 rpm旋转下，较大的珠(37-100 μm)显示出比400 mL <37μm的珠的洗脱峰尖锐得多的洗脱峰。使用较大的珠，在2000 mL洗脱缓冲液之前似乎洗脱了大部分IgG，而对于<37 μm的珠，洗脱峰没有达到低至4000 mL的稳定基线(分别参见图8C和图8D)。

实施例4

目的

本研究的目的是评价在磁性分离后加入用于抛光生物分子的膜色谱法步骤的作用。更特别地，该研究包括在使用Mag Sepharose PrismA通过使用高梯度磁性分离器系统纯化后，通过具有纤维粘附单元原型的膜色谱法抛光IgG1单克隆抗体(mAb)。

材料

起始样品：来自在CHO细胞中XDR-10培养的IgG1单克隆抗体，存活率66.4%，浓度2.7 g/L

Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare

MagSepharose PrismA 37-100 µm，400 ml，GE Healthcare

纤维粘附单元原型，0.4 ml：

·纤维粘附1：在加入烯丙基缩水甘油醚(AGE)后用二乙烯基砜(DVS)交联该材料，其中粘附反应浓度为167g/L。滴定563 umol/g。

·纤维粘附2：在加入AGE之前用DVS交联该材料，其中粘附反应浓度为167g/L。滴定212 umol/g。

·纤维粘附3：在加入AGE之前用DVS交联该材料，其中粘附反应浓度为500g/L。滴定478 umol/g。

设备

ÄKTA^TM Pure 25，GE Healthcare

HPLC Infinity 1200，Agilent technologies

缓冲液

25 mM磷酸钠+0.15 M NaCl (pH 6.3)

用2 L dH₂O稀释4.88 g Na NaH₂PO₄·H₂O、2.6 g Na₂HPO₄和17.5 g NaCl并混合

25 mM磷酸钠(pH 7)

用1 L dH₂O稀释1.16 g Na NaH₂PO₄·H₂O和2.367 g Na₂HPO₄并混合

25 mM磷酸钠+1M NaCl (pH 7)

用1 L dH₂O稀释0.464 g Na NaH₂PO₄·H₂O、3.851 g Na₂HPO₄和58.44 g NaCl并混合

25 mM磷酸钠(pH 7.5)

用1 L dH₂O稀释0.73 g Na NaH₂PO₄·H₂O和3.508 g Na₂HPO₄稀释并混合

100 mM乙酸(pH 3.0)

用1 L dH₂O稀释6 ml冰醋酸并混合

条件和观察

使用如在实施例2中所述的高梯度磁性分离器系统，来自MagSepharose PrismA的洗脱液用于通过具有纤维粘附单元原型的膜色谱法进一步抛光。

将纤维粘附单元原型连接到ÄKTA Pure 25系统，并且评价三种不同的25 mM磷酸钠缓冲液条件(pH和电导率)，参见表11。在以16 ml/min的流速施加4 ml的mAb样品之前，以16 ml/min的流速进行平衡50个单位体积(20 ml)，并收集流通。用20个单位体积(8 ml)洗涤将纤维粘附单元，并用100 mM乙酸(pH 3.0)以16 ml/min的流速洗涤25个单位体积(10ml)，然后再平衡50单位体积(20 ml)。始终在280 nm处监测UV。

表11：用纤维粘附mAb抛光的缓冲液条件

缓冲液	pH	电导率
			1	6.3	18 mS/cm
2	7.0	10 mS/cm
			3	7.5	3.5 mS/cm

结果、分析和结论

在所有三种缓冲液条件下，在样品施加期间，在不同的缓冲液条件下用纤维粘附的mAb抛光得到的色谱图显示高的UV值。收集在样品施加期间的流通，并进一步分析，参见表12。对于每个样品，用0.2 M磷酸钠缓冲液，以0.8 ml/min的流速，通过SEC-HPLC(Superdex 200 Increase 10/300 GL)分析mAb的浓度和聚集百分比达26分钟。用Cygnus第3代CHO HCP ELISA试剂盒分析流通级分中的宿主细胞蛋白水平。

表12：在不同的缓冲条件下以流通模式用纤维粘附原型评价mAb抛光的结果。起始材料是从MagSepharose PrismA纯化的mAb，其中滴度为约3 mg/ml并且HCP为160 ppm。

总之，mAb的抛光导致高产率(93-100%)，并且导致宿主细胞蛋白(HCP)的大量减少。最高的HCP降低是在pH 7.5和3.5 mS/cm的电导率下，这导致93-99%的产率，并且使用具有最高配体密度的纤维粘附原型的HCP降低最高。

应当理解，本公开不限于其上述例证的实施方案，并且在所附权利要求范围内，本公开的若干可想到的修改是可能的。

Claims

1.用于从细胞培养物分离生物分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(b)使包含所述生物分子的细胞培养物与所述磁性颗粒接触，以获得包含所述结合的生物分子的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过改变所述磁场的量级，例如通过施加振荡磁场，来搅动所述磁性颗粒。

3.用于从细胞培养物或从生物溶液分离生物分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供包含能够结合所述生物分子的配体的磁性颗粒；

(c)用磁场将所述磁性颗粒保持在磁性分离器中；

(d)任选地用洗涤液洗涤所述磁性颗粒；

(g1)通过膜色谱法将所述生物分子与杂质和/或污染物分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(e1)包括：

(e1a)在所述磁性分离器的至少一个平面中搅动所述磁性颗粒，以在所述磁性分离器中形成磁性颗粒的流化床；

(e1b)在基本上垂直于所述至少一个平面的方向上提供洗脱液的流，以从所述磁性颗粒洗脱所述结合的生物分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(e1a)包括通过改变所述磁场的量级，例如通过施加振荡磁场，来搅动所述磁性颗粒。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中在步骤(g1)中所述生物分子在所述膜色谱法装置中的停留时间在0.5秒至约6分钟范围内，优选约1秒至约30秒。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述磁性分离器通过所述膜色谱法装置连接到色谱法系统，所述色谱法系统提供洗脱液的流和任选的洗涤液的流。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置包含色谱法材料，所述色谱法材料包含一种或多种电纺聚合物纳米纤维，所述电纺聚合物纳米纤维在使用中形成固定相，所述固定相包含多个孔，流动相能够通过所述孔渗透。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述固定相为膜的形式。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置包含至少一个吸附膜。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述吸附膜包含聚合物纳米纤维。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述膜包含聚合物纳米纤维的非织造网。

13.根据权利要求8-9和11-12中任一项所述的方法，其中所述聚合物选自聚砜、聚酰胺、尼龙、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯和聚环氧乙烷，及其混合物。

14.根据权利要求8-9和11-12中任一项所述的方法，其中所述聚合物为纤维素聚合物，例如选自纤维素和纤维素的部分衍生物，特别是纤维素酯、交联的纤维素、接枝纤维素或配体偶联的纤维素。

15.根据权利要求3-14中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置包含用以下官能化的色谱法材料：(i)带正电荷的基团，例如季氨基、季铵或胺基，或(ii)带负电荷的基团，例如磺酸根或羧酸根基团。

16.根据权利要求3-15中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置包含用多模式配体官能化的色谱法材料，所述多模式配体选自多模式阴离子交换配体和多模式阳离子交换配体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多模式阴离子交换配体为偶联到载体的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体，其中所述载体通过连接基连接到所述配体的氮原子。

18.根据权利要求3-14中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置包含用以下官能化的色谱法材料：(i)离子交换剂基团、(ii)亲和力肽/蛋白质基配体、(iii)疏水相互作用配体、(iv) IMAC配体或(v) DNA基配体例如寡聚dT。

19.根据权利要求3-18中任一项所述的方法，其中在步骤(g1)中所述膜色谱法为流通膜色谱法。

20.根据权利要求8-19中任一项所述的方法，其中通过所述膜或色谱法材料的所述洗脱液的流为法向流或切向流。

21.根据权利要求3-20中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(e1)和步骤(f1)之间进行所述洗脱液的pH调节、所述洗脱液的稀释或所述洗脱液的电导率调节。

22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，其中所述膜色谱法装置(101)包含：

-至少一个色谱法材料单元(103)，其中所述色谱法材料单元包含基于对流的色谱法材料；

-至少一个流体分配系统(107)，其设置成将流体分配到所述至少一个色谱法材料单元(103)中和从所述至少一个色谱法材料单元分配流体；

-入口(115)；

-至少一个入口流体通道(117)，其经由所述流体分配系统(107)将所述入口与所述至少一个色谱法材料单元(103)连接；

-出口(119)；和

-至少一个出口流体通道(121)，其经由所述流体分配系统(107)将所述出口(119)与所述至少一个色谱法材料单元(103)连接；

其中所述膜色谱法装置(101)的至少一些部件被密封在一起，至少使所述入口(115)和所述出口(119)打开。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)或(c)包括将所述磁性颗粒加入到包含至少一个搅动器，例如多个搅动器的磁性分离器中，并且步骤(e)或(e1a)包括通过开启所述一个或多个搅动器来搅动所述磁性颗粒。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以下子步骤：

(d1)在至少一个平面中搅动所述磁性颗粒以形成磁性颗粒的流化床，和

(d2)在基本上垂直于所述至少一个平面的方向上提供洗涤液的流，以去除所述细胞培养物，同时将所述磁性颗粒保持在所述磁场中。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)或(e1a)包括在所述磁性分离器的多个基本上平行的平面中搅动所述磁性颗粒以形成磁性颗粒的多个流化床，并且其中步骤(f)或(e1b)包括在基本垂直于所述多个平面的方向上提供所述洗脱液的流。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用最大10个床体积，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个床体积，优选最大4个床体积，更优选最大3个床体积的洗脱液洗脱所述生物分子。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少步骤(c)-(f)或(c)-(e1)，例如步骤(b)-(f)或(b)-(e1)，在所述磁性分离器中进行，优选其中所述磁性分离器为高梯度磁性分离系统。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：

(i)将所述磁性颗粒加入到磁性分离器中，随后从所述细胞培养物中向所述磁性分离器提供进料，或者

(ii)向磁性分离器提供来自所述细胞培养物和包含所述结合的生物分子的所述磁性颗粒的混合物的进料。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)-(f)或(b)-(e1)在组合的生物反应器容器/接触器和磁性分离器中进行。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以下子步骤：

(i)去除所述磁场；

(ii)重悬浮所述磁性颗粒；

(iii)使所述磁性颗粒与一部分洗涤液接触；

(iv)用磁场保持所述磁性颗粒；和

(v)从所述保持的磁性颗粒中去除所述洗涤液。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在进行到步骤(e)或(e1)之前，重复步骤(d)至少一次。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(f)或(e1)中所述洗脱液的线性流速在步骤(f)中在10-3000 cm/h范围内，优选在50-600 cm/h范围内。

33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中在步骤(e)或(e1a)中所述一个或多个搅动器的速度在15-1500 rpm范围内，优选在50-300 rpm范围内。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁性分离器连接到色谱法系统。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒的体积加权中值直径(d50,v)在8-300μm范围内，优选在37-100μm范围内。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒的平均密度为1.05-1.20 g/ml沉降的颗粒。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒中的每一个包含多孔聚合物基质和嵌入所述多孔聚合物基质中的一个或多个磁性颗粒。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述磁性颗粒中的每一个包含5-15重量%的所述磁性颗粒。

39.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒的体积加权中值直径(d50,v)为1-5μm。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒中的每一个在所述颗粒的中心区域中包含的磁性颗粒浓度为在所述颗粒的表面区域中的浓度的至少200%，其中所述中心区域定义为距所述颗粒表面的距离>0.2个颗粒半径，并且所述表面区域定义为距所述颗粒表面的距离<0.2个颗粒半径。