KR20210143767A - 생체분자의 분리 방법 - Google Patents

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KR20210143767A
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올라 린드
닐스 노르만
살베리 사라 헤그블라드
로니 팜그렌
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씨티바 스웨덴 에이비
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Abstract

본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법에 관한 것이다: (a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계; (b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계; (c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계; (d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계; (e1) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 자성 분리기를 통하여 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계; (f1) 자성 분리기로부터 용리되는 생체분자를 멤브레인 크로마토그래피 장치로 전달하는 단계; (g1) 멤브레인 크로마토그래피에 의해 불순물 및/또는 오염물로부터 생체분자를 분리하는 단계.

Description

생체분자의 분리 방법
본 개시내용은 생체분자의 분리 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 자성 분리기(magnetic separator)에서의 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법에 관한 것이다.
자성 흡착제 비드의 사용에 의한 생체분자의 분리가 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 US7506765 B2호는 자기장에 배치된 자성 재료의 플레이트(plate)-형 분리 구조를 가지는 매트릭스를 통하여 수행되는, 현탁액으로부터의 자성 입자의 선택적 분리를 위한 고도-구배 자성 분리기에 대해 기술하고 있다. 또한, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 US6602422 B1호는 마이크로 분리 컬럼상에서 생물학적 재료를 정제하기 위한 분리 및 방출 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 마이크로 분리 컬럼 내부의 강자성 입자 매트릭스에 의해 자성 캐리어가 아직 자성에 의해 잔류되는 동안의 자성 캐리어로부터의 생물학적 재료의 방출 및 마이크로 분리 컬럼으로부터의 용리를 포함한다. 특허 공개 WO2018122246호는 생체분자를 자성 비드에 결합시키는 것, 자성 분리기를 사용하여 세포 배양물의 나머지로부터 결합된 생체분자를 포함하는 자성 비드를 분리하는 것, 완충제가 첨가된 슬러리로서의 결합된 생체분자를 포함하는 자성 비드를 별도의 용리 셀(elution cell)로 전달하는 것, 및 용리 셀에서 자성 비드로부터 생체분자를 용리하는 것을 포함하는, 세포 배양물로부터의 생체분자의 분리 방법에 대해 기술하고 있다. 또한, 특허 공개 WO2018122089호는 다공성 매트릭스 및 매트릭스에 매립된 1종 이상의 자성 입자를 포함하며, 추가적으로 다공성 매트릭스에 공유 커플링된 이뮤노글로불린-결합 리간드를 포함하는 자성 비드에 관한 것이다.
자성 비드 처리는 조질 공급물 세포 모액으로부터 바로 표적 생체분자를 정제하기 위한 효과적인 방법이며, 이와 같은 기술은 원심분리, 여과 및 포획 크로마토그래피와 같은 정화 도구들을 대체할 수 있다. 자성 비드는 표적 생체분자에 대하여 친화성을 가지는 리간드에 의해 관능화된다. 자성 비드는 첨가된 후, 공급물 중의 모든 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 특정 시간 동안 조질 공급물과 혼합된다. 결합 후, 자성 비드는 세포 및 불순물이 경사 분리되는 동안 자석에 의해 포획된다. 세척 완충제가 자성 비드에 첨가되고, 자석이 작동중지된 후, 세척 완충제와 자성 비드를 사용한 혼합이 이루어진다. 혼합 후, 자석이 작동개시되어 비드를 포획하고, 세척 완충제가 경사 분리된다. 수회 세척 후, 세척 완충제에 대한 것과 동일한 방식으로 용리 완충제가 자성 비드에 첨가되고, 수회의 배치 용리 단계를 사용하여 자성 비드로부터 표적 생체분자가 방출된다. 모든 세척 단계 및 용리 단계들은 배치 양식으로 이루어지는데, 높은 용리 수율을 수득하기 위해서는 수회의 배치 용리 단계를 수행할 필요가 있기 때문에, 이와 같은 기술을 사용하면 컬럼 크로마토그래피에 비해 표적이 더 희석되게 된다. 또한, 배치 용리를 사용하는 것은 용리 조건을 최적화하기가 더 어려운데, 자성 비드로부터 표적 생체분자를 방출하는 올바른 용리 조건에 도달하기 위해서는 용리 완충제가 세척 완충제를 적정할 필요가 있으며, 그것은 각 용리 단계에 상이하거나 대용량인 용리 완충제를 요구하기 때문이다. 이를 극복하기 위한 한 가지 방법은 세척된 비드를 용리 단계용 크로마토그래피 컬럼으로 전달하여 용리 완충제의 부피를 감소시키고, 최적화된 한 가지 용리 완충제를 사용하는 분별을 사용하여 용리 혼합수집물을 수집하는 것이다. 그러나, 이는 추가적인 장비 및 컬럼 충진을 필요로 하며, 이는 시간을 소요한다.
이에 따라, 감소된 공정 시간 및 더 비용-효율적인 공정을 달성하면서 조질 공급물로부터의 생체분자의 효율적인 포획 및 정제를 포함하는 개선된 생체분자 분리 방법에 대한 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.
[발명의 개요]
생체분자의 개선된 분리 방법을 제공하는 상기 목적은 자성 분리기에서 유동 용리와 교반(agitation)을 동시에 적용하는 것에 의한 생체분자의 분리 방법에 관한 본 개시내용에 의해 달성된다. 본원에서 나타내는 바와 같이, 이에 의해 적은 용리 부피를 사용하여 놀랄 만큼 높은 수율 및 순도로 자성 분리기로부터 바로 표적 생체분자를 유동-용리하는 것이 가능하다. 실질적으로 더 짧은 공정 시간을 요하면서도, 방법의 정밀도는 컬럼 크로마토그래피의 정밀도와 동일하다.
더 구체적으로, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법에 관한 것이다:
(a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
(b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
(c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
(d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
(e) 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 분리기에서 자성 입자의 유동화된 상(fluidised bed)을 형성시키는 단계;
(f) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 상기 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계.
본 발명자들에 의해 실현된 추가적인 개선은 자성 분리 후 생체분자를 추가적으로 정제하기 위하여 멤브레인 크로마토그래피가 후속할 수 있다는 것이다. 이에 따라, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법을 제공한다:
(a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
(b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
(c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
(d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
(e1) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 자성 분리기를 통하여 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계;
(f1) 자성 분리기로부터 용리되는 생체분자를 멤브레인 크로마토그래피 장치로 전달하는 단계;
(g1) 멤브레인 크로마토그래피에 의해 불순물 및/또는 오염물로부터 생체분자를 분리하는 단계.
본 개시내용의 바람직한 측면들은 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 기술된다.
도 1은 본 개시내용에 따른 생체분자 분리 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 시스템을 개략적으로 나타낸다.
도 3은 본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 자성 분리기의 비-제한적인 실시양태의 개략도이다.
도 4는 하기 실시예 1에서 기술되는 다클론 IgG 실험에서의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 5a, 5b 및 5c는 하기 실시예 2에서 기술되는 단일클론 항체 (mAb) 실험에서의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 개시내용에 따른 대안적인 생체분자 분리 방법의 흐름도이다.
도 7은 본 개시내용에 따른 대안적인 생체분자 분리 방법의 일 실시양태에 따라 사용될 수 있는 멤브레인 크로마토그래피 장치의 단편도이다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 하기 실시예 3에서 기술되는 단일클론 항체 (mAb) 실험에서의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는 도 1에 도시된 바와 같은 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법을 제공하는 것에 의해, 기존의 생체분자 분리 방법과 연관되어 있는 문제점들을 해결하거나 적어도 완화한다:
(a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
(b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
(c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
(d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
(e) 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 분리기에서 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 단계;
(f) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 상기 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계.
본 개시내용의 방법의 중요한 장점은 놀랄 만큼 적은 총 용리 부피, 더 구체적으로는 최대 10 상 부피(bed volume)의 용리액, 예컨대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 상 부피; 바람직하게는 최대 4 상 부피, 더욱 바람직하게는 최대 3 상 부피인 용리 부피를 사용하여 생체분자가 용리된다는 것이다. 본원에서, "상 부피"는 보통 밀리리터 (ml 또는 mL) 또는 리터 (L)로 표현되는 침강되는 자성 입자의 부피로 이해되어야 한다. 생체분자를 용리하는 데에 필요한 총 용리 부피가 더 적을수록, 용리되는 생체분자의 샘플은 더 많이 농축되고 더 적게 분산된다. 큰 부피의 샘플을 취급하는 것을 방지하기 위해서는, 차후의 모든 폴리싱(polishing) 단계에서 고농도의 생체분자가 바람직하다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 방법의 추가적인 개선은 자성 분리 후의 멤브레인 크로마토그래피에 의한 생체분자의 추가적인 정제를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, 도 6에 도시된 바와 같은 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법을 제공한다:
(a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
(b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
(c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
(d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
(e1) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 자성 분리기를 통하여 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계;
(f1) 자성 분리기로부터 용리되는 생체분자를 멤브레인 크로마토그래피 장치로 전달하는 단계;
(g1) 멤브레인 크로마토그래피에 의해 불순물 및/또는 오염물로부터 생체분자를 분리하는 단계.
자성 분리 후의 멤브레인 크로마토그래피의 추가는 고순도의 생체분자로 이어지는 현저하게 단순하고 빠른 공정을 초래한다.
"생체분자"라는 용어는 세포 배양에서 세포에 의해 생체분자가 생성되고 (종종 재조합에 의함) 임의의 분리 및 정제 수단에 의해 세포 배양물로부터 정제되는 생체처리(bioprocessing) 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가진다. 대안적으로, 생체분자는 반드시 세포 배양물로부터 기원할 필요는 없는 생물학적 용액 중에 존재한다. 생체분자의 비-제한적인 예로는 서로 연결된 단량체들로 구성되는 대형 생물학적 중합체인 생체거대분자, 예컨대 펩티드 및 단백질 (천연 또는 재조합일 수 있음)이 있으며, 효소, 항체 및 항체 단편은 물론 탄수화물, 및 핵산 서열 예컨대 DNA 및 RNA가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생체분자의 기타 비-제한적인 예로는 플라스미드 및 바이러스가 있다. 생체분자 또는 생체거대분자는 예를 들면 생물약제, 즉 비제한적으로 제약 화합물로서 사용하기 위한 목적의 생물학적 거대분자를 포함한 생물학적 분자일 수 있다. 본원에서, 본 개시내용의 방법에 의해 세포 배양물 또는 생물학적 용액의 나머지로부터 분리되어야 할 생체분자는 대안적으로는 "표적 생체분자" 또는 "표적"으로 지칭될 수 있다. "생체분자"는 한 가지 유형의 생체분자를 의미하고자 하는 것이며 단수 형태의 용어가 많은 수의 개별 분자들을 포괄할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에서, "세포 배양물"이라는 용어는 배양되는 세포 또는 세포 군의 배양물을 지칭하며, 여기서 세포는 임의 유형의 세포, 예컨대 박테리아 세포, 바이러스 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 세포 배양물은 정화되지 않은 것, 즉 세포를 포함하는 것일 수 있거나, 또는 세포-고갈된 것, 즉 세포는 포함하지 않거나 거의 포함하지 않지만 세포를 제거하기 전에 세포로부터 방출된 생체분자는 포함하는 배양물일 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에서 사용될 때의 정화되지 않은 세포 배양물은 무손상 세포, 파열된 세포, 세포 균질물 및/또는 세포 용해물을 포함할 수 있다.
"생물학적 용액"이라는 용어는 생체분자 또는 몇 가지 유형 생체분자들의 혼합물을 포함하는 생물학적 기원의 용액을 의미하고자 하는 것이다. 생물학적 용액의 예로는 인간 또는 동물로부터 기원하는 임의 유형의 체액, 예컨대 혈장, 혈액, 객담, 소변 및 우유가 있다.
"자성 입자"라는 용어는 본원에서 자기장에 의해 견인될 수 있는 입자로 정의된다. 동시에, 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 자성 입자는 자기장의 부재하에서는 응집되지 않아야 한다. 다른 말로 하면, 자성 입자는 초상자성 입자처럼 거동해야 한다. 입자는 구체 또는 정육면체와 같은 임의의 대칭 형상, 또는 임의의 비대칭 형상을 가질 수 있다. 구형 자성 입자는 종종 자성 비드로 지칭된다. 본원에서 "자성 입자", "자성 비드", "Mag 입자", "Mag 비드", "자립자(magparticle)" 또는 "자비드(magbead)"라는 용어들은 구형 형상을 가지는 자성 입자로 영역을 제한하지 않으면서 호환가능하게 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 자성 입자에 대해서는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2018122089호에 기술되어 있다. 구체적으로, 자성 입자는 8 내지 300 ㎛ 범위, 예컨대 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 105, 110, 150, 200, 250 또는 300 ㎛, 바람직하게는 20 내지 200 ㎛ 범위, 더욱 바람직하게는 37 내지 100 ㎛ 범위의 부피-가중 직경 중간값(volume-weighted median diameter) (d50,v)을 가질 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 자성 입자는 1.05-1.20 g/ml 침강 자성 입자의 평균 밀도를 가질 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 자성 입자는 다공성 매트릭스, 바람직하게는 다공성 중합체 매트릭스, 및 다공성 매트릭스 중에 매립된 1종 이상의 자성 과립을 포함할 수 있다. 자성 입자는 적합하게는 약 5-15 중량%의 자성 과립을 포함할 수 있다. 각 자성 입자의 다공성 매트릭스 중에 매립된 자성 과립은 약 1 내지 약 5 ㎛의 부피-가중 직경 중간값 (d50,v)을 가질 수 있다. 또한, 자성 입자는 적합하게는 자성 입자 표면 영역에서의 농도의 적어도 200 %인 자성 입자 중심 영역에서의 자성 과립 농도를 포함할 수 있는데, 여기서 중심 영역은 자성 입자 표면으로부터 > 0.2 입자 반경의 거리를 가지는 것으로 정의되며, 표면 영역은 자성 입자 표면으로부터 < 0.2 입자 반경의 거리를 가지는 것으로 정의된다.
본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 자성 입자는 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 상기 리간드는 자성 입자의 다공성 매트릭스에 공유 커플링될 수 있다. 리간드의 유형 및 생체분자에 대한 그의 친화성 상수 koff/kon은 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터 분리되어야 할 생체분자의 유형을 기준으로 선택된다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 자성 입자 당 리간드(들)의 농도는 예를 들면 세포 배양물 또는 생물학적 용액 중 생체분자의 농도, 자성 입자의 치수, 및/또는 자성 분리기에 첨가되는 자성 입자의 총 부피에 따라 달라지거나 그와 상관된다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시내용의 일반적으로 바람직한 실시양태에서, 생체분자를 분리하기 위하여 본 개시내용의 방법에 사용되는 자성 입자는 Mag 세파로스(Sepharose)™ 프리즘(Prism)A (GE 헬스케어 바이오-사이언시즈(Healthcare Bio-Sciences) AB 사, art. no. 17550000)이다.
도 2는 본 개시내용에 따른 방법을 수행하는 데에 사용될 수 있는 분리 시스템 (1)의 비-제한적인 예를 개략적으로 보여준다. 시스템 (1)은 자성 분리기 (5)를 포함한다. "자성 분리기"라는 용어는 분리 공정 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지며, 유체로부터 자성 입자를 분리하는 장치를 지칭한다. 본 개시내용의 일반적으로 바람직한 실시양태에서, 생체분자를 분리하기 위한 방법에서 사용되는 자성 분리기는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US7506765 B2호에 기술되어 있는 바와 같은, 대안적으로는 고도 구배 자성 분리 시스템 (HGMS)으로 지칭되는 고도 구배 자성 분리기이다. 도 2에 나타낸 분리 시스템 (1)의 부품들은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2018122246호에 기술되어 있는 시스템의 부품들과 유사하다. 자성 분리기 (5)는 상기 생체분자를 포함하는 세포 배양물 (3) 또는 생물학적 용액 (3)으로부터의 공급물을 제공받고 그와 같은 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공받기 위한 유입구 (5a)를 포함한다. 자성 분리기 (5)는 공급물의 나머지로부터 상기 결합된 생체분자를 동반하는 상기 자성 입자를 분리하도록 구성된다. 자성 분리기 (5)는 자성 분리기 내부에 자성이거나 자성화가능한 재료의 부품을 포함하며, 상기 부품은 자기장이 인가되는 경우 자성 입자를 견인한다.
도 2에 나타낸 분리 시스템 (1)은 자성 분리기 (5)의 유입구 (5a)에 연결되는 포획 셀(capturing cell) (9)을 포함한다. 도 2에 나타낸 포획 셀 (9)은 세포 배양물 (3)로부터의 공급물을 제공받기 위한 세포 배양물/생물학적 용액 유입구 (9a) 및 자성 입자를 제공받기 위한 적어도 하나의 자성 입자 유입구 (9b)를 포함한다. 포획 셀 (9)은 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 공급물과 자성 입자를 혼합함으로써 그것을 자성 분리기 (5)로 전달하기 전에 표적 생체분자가 자성 입자에 결합하는 것을 가능하게 하도록 구성된다. 그러나, 포획 셀 (9)은 시스템 (1)의 임의적인 구성요소라는 것이 이해되어야 한다. 세포 배양물 (3) 또는 생물학적 용액에 각각 자성 비드가 첨가된 후 이어서 각각 결합된 생체분자를 포함하는 세포 배양물과 자성 입자의 혼합물로부터, 또는 생물학적 용액과 자성 입자의 혼합물로부터 자성 분리기 (5)에 공급물을 제공한다 할지라도, 세포 배양물 (3) 또는 생물학적 용액 (3)은 동일하게 우수하게 포획 셀처럼 기능할 수 있었다. 대신하는 또 다른 대안은 자성 분리기 (5)에 바로 자성 비드를 첨가하는 것이 될 수 있다. 모든 실시양태에 있어서, 세포 배양물 또는 생물학적 용액 각각과 자성 비드의 자성 분리기에의 직접적인 별도 첨가가 가능하다.
이에 따라, 본 개시내용의 방법의 단계 (b)는 하기를 포함할 수 있다:
(i) 자성 입자를 자성 분리기에 첨가한 후, 이어서 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 공급물을 자성 분리기에 제공하는 것, 또는
(ii) 결합된 생체분자를 포함하는 세포 배양물과 자성 입자의 혼합물 또는 생물학적 용액과 자성 입자의 혼합물로부터의 공급물을 자성 분리기에 제공하는 것.
단계 (b), 즉 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써 생체분자를 자성 입자에 결합시킨 후, 단계 (c), (d) 및 (e)에서 언급되는 자성 입자는 결합된 생체분자를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
상기에서 언급된 단계 (d)에 따라, 본 개시내용의 방법은 임의적으로 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같은 목적으로, 자성 분리기 (5)는 바람직하게는 자성에 의해 자성 재료의 부품에 결합된 것들이 아닌 다른 자성 분리기 (5)로부터의 성분들을 세척 제거하도록 구성되는 세척 설비 (13)에 연결된다. 세척 설비 (13)는 펌프에, 그리고 가능할 경우 포획 셀 (9)을 통하여 자성 분리기의 유입구 (5a)에 연결되는 적어도 하나의 세척 완충제 제공 설비 (15), 및 자성 분리기 (5)의 유출구 (5b)에 연결되는 세척 완충제 수집 설비 (17)를 포함한다. 세척 설비 (13)는 자성 분리기 (5)를 통하여 세척 완충제를 유동시킴으로써 자성 부품에 결합된 것들이 아닌 다른 공급물 중 성분들을 세척 제거하도록 구성된다.
본 개시내용의 방법에 따라, 자성 비드는 자성 입자가 배치 양식으로 세척되어야 하는 경우 자기장을 해제하도록 구성되는 자성 분리기에서 배치 양식으로 세척될 수 있다. 대안적으로, 그리고 유리하게는, 상기 방법은 연속 양식으로 적어도 하나의 세척 단계를 적용하는 것을 포함하며, 이와 같은 경우 상기 방법의 단계 (d)는 하기의 하위단계들을 포함한다:
(d1) 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 단계; 및
(d2) 자기장에서 자성 입자를 잔류시키면서, 상기 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 세척액의 유동을 제공함으로써, 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 제거하는 단계.
본원에서, "적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인"이라는 구는 적어도 하나의 평면에 대한 80-90°의 각도를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본 개시내용의 방법의 단계 (d)는 하기의 하위단계들을 포함할 수 있다:
(i) 자기장을 제거하는 단계;
(ii) 자성 입자를 재현탁하는 단계;
(iii) 자성 입자를 세척액의 일부와 접촉시키는 단계;
(iv) 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계; 및
(v) 잔류되는 자성 입자로부터 세척액을 제거하는 단계.
대안적으로 또는 더하여, 본 개시내용의 방법의 단계 (d)는 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1)로 진행하기 전에 적어도 1회, 예컨대 1, 2, 3 또는 그 이상의 횟수로 반복될 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같은 시스템 (1)은 추가적으로 용출액 및 폐기물을 수집하기 위한 수집 셀 (7)을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 단계 (f)에서 용리액의 유동은 유입구 (5a)를 통해 용리액이 자성 분리기 (5)에 진입하는 것을 가능하게 하는 것, 그리고 유출구 (5b)를 통해 용리액이 자성 분리기 (5)로부터 유출되는 것을 가능하게 하는 것에 의해, 자성 분리기 (5)를 통하여 제공된다는 것이 이해되어야 한다. 용리되는 생체분자는 용리액과 함께 자성 분리기 (5)로부터 유출되어, 자성 분리기 (5)의 유출구 (5b)에 연결되는 수집 셀 (7)에 수집될 수 있다.
결론적으로, 본 개시내용의 방법은 임의적으로 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서 용리액과 함께 자성 분리기로부터 유출되는 용리 생체분자를 수집 셀에 수집하는 것을 포함하는 단계 (g)를 단계 (f) 후에 추가적으로 포함할 수 있다. 수집 셀은 자성 분리기의 유출구에 연결된다.
대안적인 실시양태에 따르면, 수집 셀 (7) 대신, 도 2에 나타낸 바와 같은 시스템 (1)은 폴리싱으로도 지칭되는 생체분자의 추가적인 정제를 위한 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)를 포함한다. 이와 같은 실시양태에서는, 본 개시내용의 방법의 단계 (e1)에서, 유입구 (5a)를 통해 용리액이 자성 분리기 (5)에 진입하는 것을 가능하게 하는 것, 그리고 유출구 (5b)를 통해 용리액이 자성 분리기 (5)로부터 유출되는 것을 가능하게 하는 것에 의해, 자성 분리기 (5)를 통하여 용리액의 유동이 제공된다. 용리되는 생체분자는 용리액과 함께 자성 분리기 (5)로부터 유출되어, 자성 분리기 (5)의 유출구 (5b)에 연결된 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)에서 불순물 및/또는 오염물로부터의 분리에 의해 추가적으로 정제될 수 있다.
도 2에 나타낸 시스템 (1)에서, 세포 배양물 (3) 또는 생물학적 용액 (3), 자성 분리기 (5), 및 수집 셀 (7) 또는 대안적으로는 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)는 사전-멸균된 유연성 배관 및 무균 커넥터(connector)에 의해 연결될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 수집 셀 (7) 또는 대안적으로는 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)는 사전-멸균될 수 있으며, 일회용일 수 있다. 이에 따라, 단일 사용을 위한 폐쇄 및 멸균된 분리 시스템이 제공될 수 있다.
본 개시내용의 방법을 수행하는 데에 사용되는 자성 분리기는 추가적으로 교반 설비 (도 2에는 미도시; 하기에서 추가 기술되는 바와 같이, 도 3에 한 가지 비-제한적인 예를 나타냄)를 포함한다. 상기 교반 설비는 자성 입자에 교반 동작을 적용함으로써, 자성 분리기를 통한 유동의 방향에 대하여 수직인 평면으로 자성 입자가 움직이게 하도록 구성된다. 교반 설비는 예컨대 진동 자기장을 적용하는 것에 의해 자기장의 크기를 변동시키도록, 즉 중심점 또는 평면 부근에서 규칙적인 방식으로 크기를 변동시키도록 구성되는 적어도 하나의 구성요소 예컨대 복수의 구성요소를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 개시내용의 방법의 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1)은 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 자기장의 크기를 변동시키는 것에 의해, 예컨대 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 진동 자기장을 적용하는 것에 의해, 자성 입자를 교반하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 교반 설비는 적어도 하나의 교반기 예컨대 복수의 교반기를 포함할 수 있으며, 이 경우 본 개시내용의 방법의 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1)은 교반기(들)을 적용하거나 그것을 작동개시하는 것에 의해 자성 입자를 교반하는 것을 포함한다. 본원에서, "교반기"라는 용어는 자성 분리기에서 자성 입자를 교반할 수 있는, 예컨대 회전시키거나 휘저을 수 있는 임의 유형의 장치 또는 물질/재료를 지칭한다. 적합한 교반기의 비-제한적인 예는 자성 분리기의 적어도 하나의 고정된 구조에 결합되는, 예컨대 중심의 회전가능한 캐리어 샤프트 형성 로터에 탑재되는 회전가능한 분리 구조, 예컨대 회전가능한 디스크 또는 회전가능한 블레이드(blade)와 같은 장치이다. 상기 분리 구조는 예를 들면 와이어 메시(wire mesh), 천공된 금속 호일 또는 천공된 금속 시트로 구성될 수 있다.
유리하게는, 교반기는 자성화가능한 재료를 포함할 수 있는데, 이 경우 교반기는 자성 분리기 내부에서 자성 재료의 부품으로 작용할 수 있으며, 상기 부품은 자기장이 인가되는 경우 자성 입자를 견인한다.
도 3은 본 개시내용에 따른 방법을 수행하는 데에 사용될 수 있는 자성 분리기 (5)의 비-제한적인 예의 단면도를 개략적으로 나타낸다. 도 3의 화살표들은 유입구 (5a)에서 자성 분리기 (5)에 진입하고 유출구 (5b)에서 자성 분리기 (5)로부터 유출될 수 있는 액체 (예컨대 용리액)의 유동을 도시한다. 자성 분리기 (5)는 하우징 (6)을 포함하며, 또한 전기 자석이 작동개시될 때 자성 분리기에 자기장을 생성시키도록 구성되는 중공 원통형 전기 자석 (11)을 포함한다. 자성 분리기는 또한 복수의 회전가능한 디스크들 (17)이 거기에 탑재되어 있는 로터 (15)를 포함하는 교반 설비 (13)를 포함한다. 상기 교반 설비 (13)는 본 개시내용의 방법의 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1)에 따라 자성 분리기 (5)의 적어도 하나의 평면으로 자성 입자 (21)를 교반함으로써 자성 분리기에서 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키도록 구성된다. 도 3에서, 자성 분리기 (5)는 추가적으로 하우징 (6)에 탑재된 복수의 고정 디스크 (19)를 포함한다. 회전가능한 디스크 (17) 및 고정 디스크 (19)는 하우징 (6)에 교호로 배열된다. 회전가능한 디스크 (17) 및/또는 고정 디스크 (19)는 자성화가능한 재료를 포함할 수 있다. 또한, 회전가능한 디스크 (17) 및/또는 고정 디스크 (19)는 자성 입자 및 세포 배양물/생물학적 용액이 디스크를 통과하는 것을 가능하게 하기 위하여 천공될 수 있다. 회전가능한 디스크의 구성 및/또는 고정 디스크의 구성이 도 3에 나타낸 구성과 상이할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 고정 디스크 (19)는 예컨대 밀봉 재료에 의해 로터 (15)에 연결될 수 있다. 또한, 회전가능한 디스크는 하우징 (6)의 벽에 연결될 수 있거나, 연결되지 않을 수 있다. 교반 설비가 도 3에 나타낸 것들이 아닌 다른 구성요소를 포함할 수 있다는 것 또한 이해되어야 한다. 예를 들면, 자성 분리기의 고정된 구조에 결합되는 자성화가능한 재료의 부품을 포함하는 것 대신, 또는 그에 더하여, 강철 울(wool) 또는 와이어 울의 다발 또는 모음과 같은 자성 분리기의 어떠한 고정된 구조에도 결합되지 않으며 자기장이 인가되는 경우 자성 입자를 견인하고 자성 분리기에서 자기장에 자성 입자를 잔류시키는 능력을 가지는 자성 또는 자성화가능한 재료의 부품을 자성 분리기 내부에 포함하는 것이 고려된다.
본 개시내용의 방법의 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1a)는 자성 분리기의 적어도 하나의 평면, 예컨대 복수의 본질적으로 평행하거나 평행한 평면에서 자성 입자를 교반함으로써 복수의 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에서, "본질적으로 평행한 평면들"은 서로와 관련하여 0-10°의 각도로 배열되는 평면들로 해석되어야 한다. 복수의 본질적으로 평행하거나 평행한 평면들의 경우, 단계 (f) 또는 대안적으로는 단계 (e1b)는 상기 복수의 평면들에 본질적으로 수직이거나 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공하는 것을 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 교반 설비가 자성 분리기 내에 평행하게 배열되며 복수의 평행한 평면에서 자성 입자를 교반하도록 구성되는 회전가능한 구성요소 형태의 복수의 교반기를 포함하는 경우, 모든 교반기 쌍들 사이에 유동화된 상을 형성시키는 것이 가능한 것으로 여겨진다.
본 개시내용의 방법에서, 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1)에서의 교반기(들)의 속도는 15 내지 1500 rpm의 범위, 예컨대 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500, 바람직하게는 50 내지 300 rpm의 범위일 수 있다.
대안적인 실시양태에 따르면, 단계 (e) 후의 상기 단계 (f) 및 (g)는 단계 (e1) 후의 단계 (f1) 및 (g1)로 대체되며, 하기를 포함한다:
(f1) 자성 분리기로부터 용리되는 생체분자를 멤브레인 크로마토그래피 장치로 전달하는 단계;
(g1) 멤브레인 크로마토그래피에 의해 불순물 및/또는 오염물로부터 생체분자를 분리하는 단계.
도 2에 따른 시스템 (1)에서의 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)의 위치에 대해서는 상기되어 있다. 단계 (g1)은 대안적으로는 생체분자의 폴리싱으로 지칭될 수 있다.
"멤브레인 크로마토그래피"라는 용어는 생체처리 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가진다. 멤브레인 크로마토그래피에서는, 유체와 접촉되는 고체 상의 표면에 대한 유체 중 성분, 예를 들면 개별 분자, 결합물 또는 입자의 결합이 존재한다. 고체 상의 활성 표면은 대류 수송에 의해 분자가 접근가능하다. 충진형 크로마토그래피 컬럼에 대비한 멤브레인 흡착기의 장점은 훨씬 더 큰 유량을 사용하여 전개되는 데에 있어서의 그의 적합성이다. 이는 대류-기반 크로마토그래피로도 지칭된다. 대류-기반 크로마토그래피 매트릭스에는 매트릭스의 유입과 유출 사이에서의 수력학적 압력 차이의 적용이 매트릭스의 관류를 추진함으로써 매트릭스로의, 또는 매트릭스로부터의 물질(들)의 실질적으로 대류성인 수송을 달성하며 고도의 유량으로 그것이 매우 빠르게 달성되는 임의의 매트릭스가 포함된다. 대류-기반 크로마토그래피 및 멤브레인 흡착기에 대해서는 예를 들면 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US20140296464A1호, US20160288089A1호, WO2018011600A1호, WO2018037244A1호, WO2013068741A1호, WO2015052465A1호, US7867784B2호에 기술되어 있다.
본 개시내용의 방법에서, 멤브레인 크로마토그래피 장치는 사용시 이동상이 그를 통하여 투과될 수 있는 복수의 세공을 포함하는 고정 상을 형성하는 1종 이상의 전기방적 중합체 나노섬유를 포함하는 크로마토그래피 재료를 포함할 수 있다. 상기 고정 상은 멤브레인의 형태일 수 있다.
대안적으로, 멤브레인 크로마토그래피 장치는 적어도 하나의 흡착 멤브레인을 포함할 수 있다. 상기 흡착 멤브레인은 중합체 나노섬유를 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 멤브레인, 예컨대 흡착 멤브레인은 중합체 나노섬유의 부직 웹을 포함할 수 있다.
상기 중합체 나노섬유는 10 nm 내지 1000 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 적용분야의 경우에는, 200 nm 내지 800 nm의 평균 직경을 가지는 중합체 나노섬유가 적절하다. 어떤 적용분야에서는, 200 nm 내지 400 nm의 평균 직경을 가지는 중합체 나노섬유가 적절할 수 있다.
크로마토그래피 재료 또는 멤브레인, 예컨대 흡착 멤브레인은 폴리술폰, 폴리아미드, 나일론, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌 옥시드, 그리고 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 중합체를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 중합체는 셀룰로스계 중합체, 예컨대 셀룰로스 및 셀룰로스의 부분적 유도체, 특히 셀룰로스 에스테르, 예컨대 셀룰로스 아세테이트, 가교된 셀룰로스, 그래프팅된 셀룰로스 또는 리간드-커플링된 셀룰로스로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 개시내용의 방법에서, 멤브레인 크로마토그래피 장치는 (i) 양으로 하전된 기, 예컨대 사차 아미노, 사차 암모늄 또는 아민 기 또는 (ii) 음으로 하전된 기, 예컨대 술포네이트 또는 카르복실레이트 기에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 멤브레인 크로마토그래피 장치는 다중모드(multimodal) 음이온 교환 리간드 및 다중모드 양이온 교환 리간드로 이루어진 군에서 선택되는 다중모드 리간드에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함할 수 있다. 상기 다중모드 음이온 교환 리간드는 지지체에 커플링된 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 리간드일 수 있으며, 여기서 상기 지지체는 링커를 통하여 리간드의 질소 원자에 연결된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 멤브레인 크로마토그래피 장치는 (i) 이온 교환 기, (ii) 친화성 펩티드/단백질 기재 리간드, (iii) 소수성 상호작용 리간드, (iv) IMAC 리간드 또는 (v) DNA 기재 리간드 예컨대 올리고 dT에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함할 수 있다.
대류 기반 멤브레인 흡착기의 표면적 및 용량을 증가시키기 위하여, 대류성 매트릭스의 대류성 세공의 크기는 예컨대 상기에서 언급된 바와 같은 나노섬유의 사용에 의해 감소될 수 있다. 그러나, 그 결과, 유동에 대한 내성이 증가하게 된다. 이에 따라, 고도 용량의 대류성 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 장치를 통한 고도의 유량은 높은 작동 압력을 견딜 수 있는 크로마토그래피 장치 및 설계를 필요로 하게 된다.
멤브레인 크로마토그래피를 포함하는 본 개시내용의 방법의 일 실시양태에서는, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 내부 참조 no. 502800-IN-1의 이전에 출원된 특허 출원 IN 201911019289호에 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 멤브레인 크로마토그래피 장치를 사용할 수 있다.
도 7에 도시되어 있는 바와 같이, 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)는 카세트 (105) 내에 제공되는 크로마토그래피 재료 유닛 (103)을 포함한다. 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)는 추가적으로 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103)으로, 그리고 그로부터 유체를 분배하도록 구성되는 유체 분배 시스템 (107)을 포함한다. 크로마토그래피 재료 유닛 (103)은 상기한 바와 같은 유체 분배 시스템 (107)의 분배 장치 (109a)와 수집 장치 (109b) 사이에 샌드위칭된다. 분배 장치 (109a) 및 수집 장치 (109b)는 도 7에 나타낸 실시양태에서는 동일하지만; 그것이 필수적인 것은 아니다. 도 7에 나타낸 실시양태에서, 카세트 (105)는 크로마토그래피 재료 유닛 (103), 그리고 분배 장치 (109a) 및 수집 장치 (109b) 형태의 유체 분배 시스템 (107)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 유체 분배 시스템 (107)은 예를 들면 별도의 유닛으로서 카세트 (105)와 별도로 제공되거나, 또는 크로마토그래피 장치 (101)의 하우징 (113)에 통합될 수 있다.
멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)는 추가적으로 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (3) 및 카세트 (105)가 제공되는 하우징 (113)을 포함한다. 상기 하우징은 상부 플레이트 (125) 및 저부 플레이트 (127)를 포함한다. 유체 공급물을 제공받기 위한 유입구 (115)는 상부 플레이트 (125)에 제공되며, 크로마토그래피 장치로부터의 유체 유출물을 전달하기 위한 유출구 (119)는 저부 플레이트 (127)에 제공된다. 상부 플레이트 (125)와 저부 플레이트 (127)는 서로 연결됨으로써, 유입구 유체 채널 (117)은 유체 분배 시스템 (107)을 통하여 유입구 (115)를 크로마토그래피 재료 유닛 (103)과 연결시키고 있으며, 유출구 유체 채널 (121)은 유체 분배 시스템 (107)을 통하여 유출구 (119)를 크로마토그래피 재료 유닛 (103)과 연결시키고 있다.
유체 분배 시스템 (107)의 분배 장치 (109a)는 크로마토그래피 재료 유닛 (103)의 유입구 표면 (153a)에 인접하여 제공되는 플레이트 (미도시)를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 플레이트는 크로마토그래피 장치 (101)의 유입구 (115)로부터 제공되는 유체 공급물을 크로마토그래피 재료 유닛 (103)으로 분배하기 위한 수많은 개구부들을 포함하며, 여기서 플레이트 중 상기 개구부들의 총 면적은 플레이트의 나머지 면적에 비해 더 작거나 플레이트의 나머지 면적의 20 % 미만 또는 10 % 미만이고, 상기 개구부는 분배 장치 (109a)에 제공되는 하나 이상의 유체 도관 (미도시)을 통하여 분배 장치 유입구 (157a)에 연결된다.
또한, 유체 분배 시스템 (107)의 수집 장치 (9b)는 크로마토그래피 재료 유닛 (103)의 유출구 표면 (153b)에 인접하여 제공되는 플레이트 (미도시)를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 플레이트는 크로마토그래피 재료 유닛 (103)으로부터의 유체를 수집하기 위한 수많은 개구부들을 포함하며, 여기서 플레이트 중 상기 개구부들의 총 면적은 플레이트의 나머지 면적에 비해 더 작거나 플레이트의 나머지 면적의 20 % 미만 또는 10 % 미만이고, 상기 개구부는 수집 장치 (109b)에 제공되는 하나 이상의 유체 도관 (미도시)을 통하여 수집 장치 유출구 (157b)에 연결된다.
적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103)은 적어도 하나의 흡착 멤브레인, 및/또는 본원의 어딘가에서 기술되는 크로마토그래피 재료들 중 어느 하나 또는 수개를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛은 적어도 하나의 상부 스페이서 층 (미도시)과 적어도 하나의 저부 스페이서 층 (미도시) 사이에 샌드위칭되는 적어도 하나의 흡착 멤브레인을 포함할 수 있거나, 또는 서로의 위에 적층되며 스페이서 층 (미도시)에 의해 이격되고 적어도 하나의 상부 스페이서 층과 적어도 하나의 저부 스페이서 층 사이에 샌드위칭되는 적어도 2개의 흡착 멤브레인을 포함할 수 있다.
상기 크로마토그래피 장치 (101)의 적어도 일부 부품들은 적어도 유입구 (115) 및 유출구 (119)를 개방된 채로 유지하면서 함께 밀봉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 장치 (101)의 적어도 일부 부품들은 플라스틱 또는 엘라스토머(elastomer)에 의해 함께 밀봉될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 크로마토그래피 장치 (101)의 적어도 일부 부품들은 함께 오버몰딩 및 밀봉될 수 있다. 또한, 카세트 (105) 및/또는 하우징 (113)은 오버몰딩될 수 있다. 오버몰딩은 장치에 밀봉을 생성시키고 안정성을 제공함으로써 견고한 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)를 제공하기 위한 공정이다. 오버몰딩 후, 크로마토그래피 장치 (101)는 적어도 10 bar 또는 적어도 15 bar의 작동 압력을 견딜 수 있다.
본 개시내용의 방법의 단계 (f) 또는 대안적으로는 단계 (e1b)에서, 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직이거나, 또는 대안적으로는 복수의 평면들에 대하여 본질적으로 수직인 방향의 선형 유속은 10 내지 3000 cm/시간의 범위, 바람직하게는 50 내지 600 cm/시간의 범위이다. 적절할 경우, 비제한적으로 단계 (d), 단계 (e) 또는 대안적으로는 단계 (e1), 및/또는 단계 (g) 또는 대안적으로는 단계 (f1) 및/또는 단계 (g1)과 같은 본 개시내용의 방법의 다른 단계에서도 유사한 유속, 즉 10 내지 3000 cm/시간 범위, 바람직하게는 50 내지 600 cm/시간 범위의 유속이 적용될 수 있다.
본 개시내용의 방법의 단계 (g1)에서, 멤브레인 크로마토그래피 장치에서의 생체분자의 체류 시간은 약 0.5초 내지 약 6분, 바람직하게는 약 1초 내지 약 30초의 범위일 수 있다. 이는 멤브레인 또는 크로마토그래피 재료에서의 생체분자의 체류 시간이 약 0.5초 내지 약 6분, 바람직하게는 약 1초 내지 약 30초의 범위일 수 있는 것에 상당한다.
결론적으로, 멤브레인 크로마토그래피 장치를 통한 용리액의 유속은 약 0.5초 내지 약 6분, 바람직하게는 약 1초 내지 약 30초 범위인 단계 (g1)에서의 멤브레인 크로마토그래피 장치에서의 체류 시간에 상당하는 범위일 수 있다.
멤브레인 또는 크로마토그래피 재료를 통한 용리액의 유동은 일반 유동 또는 접선 유동일 수 있다.
또한, 단계 (g1)에서의 멤브레인 크로마토그래피는 관통형(flow-through) 멤브레인 크로마토그래피일 수 있다.
본 개시내용의 방법은 추가적으로 단계 (e1)과 단계 (f1) 사이에 용리액의 pH 조정, 용리액의 희석 또는 용리액의 전도도 조정을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법에서, 적어도 단계 (c)-(f) 또는 대안적으로는 단계 (c)-(e1), 예컨대 단계 (b)-(f) 또는 대안적으로는 단계 (b)-(e1)은 자성 분리기에서 수행될 수 있다.
대안적으로, 단계 (b)-(f) 또는 단계 (b)-(e1)은 각각 접촉기(contactor)에 유동 연결되는 생물반응기 용기를 포함하는 시스템에서 수행될 수 있으며, 상기 접촉기는 자성 분리기에 유동 연결된다. 상기 생물반응기 용기는 세포 배양물/생물학적 용액으로부터 생체분자의 분리를 개시하기 전의 세포 배양물/생물학적 용액을 포함한다. 자성 입자의 세포 배양물/생물학적 용액과의 접촉은 세포 배양물/생물학적 용액 및 자성 입자가 전달되는 (예컨대 펌핑되거나, 액체 스트림에 의해 동반되거나 또는 중력에 의해 공급되는) 용기일 수 있으며 자성 입자에의 빠른 물질 수송을 제공하기 위하여 어느 정도까지 교반될 수 있는 접촉기에서 수행될 수 있다. 상기 생물반응기 용기 또는 접촉기는 예를 들면 유연성 백(bag), 예컨대 하나 이상의 유입구 및 유출구 포트가 구비된 유연성 플라스틱 백일 수 있다.
본 개시내용의 방법에 사용되는 분리 시스템은 추가적으로 자성 분리기를 통한 유동을 생성시키도록 구성되는 가압 설비, 예를 들면 연동 펌프를 포함할 수 있다. 대안적으로, 자성 분리기를 통한 유동은 전적으로 중력에 의해 생성될 수도 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 방법의 작업을 수행하기 위하여 시스템에 적용되는 압력은 고-압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템에서 적용되는 압력에 비해서는 훨씬 더 낮을 수 있다. 이와 연관되어 있는 장점으로는 더 단순한 구성 및 더 낮은 비용이 포함된다. 분리 시스템에 적용될 적합한 압력 범위의 비-제한적인 예는 0-0.5 bar, 예컨대 0.01-0.5 bar이다.
본 개시내용의 방법에서, 자성 분리기는 악타(AKTA)™ 파일럿(Pilot) 시스템 (GE 헬스케어(Healthcare) 사)과 같은 크로마토그래피 시스템에 연결될 수 있다 (즉 크로마토그래피 시스템의 크로마토그래피 컬럼을 대체함). 크로마토그래피 시스템의 펌프 압력 성능이 필요하지는 않지만, 구배 생성을 위한 이중 펌프, 밸브사용 및 크로마토그래피 시스템의 검출기를 포함한 완충제 조절 특징들을 사용하는 것이 편리할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 시스템, 및/또는 그 안의 자성 분리기 및/또는 멤브레인 크로마토그래피 장치는 자동, 반-자동 또는 수동 작동용으로 구성될 수 있다. 그것은 적어도 0.1 L 내지 10 L 간격의 자성 입자 양으로 파일럿 및 제조 규모 공정 모두에서 사용될 수 있다. 그것은 특히 세포 배양물, 생물학적 용액 또는 세포 용해물과 같은 비-정화 공급물로부터의 생물약제의 포획에 적용가능하다.
하나 이상의 언급되는 요소를 "포함하는" 장치는 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소도 포함할 수 있다. "포함하는"이라는 용어는 다른 특징 또는 구성요소가 존재하지 않으면서 장치가 열거된 구성요소들을 포함한다는 것을 의미하는 "본질적으로 ~로 구성되는"을 하위세트로서 포함한다. 마찬가지로, "하나 이상의 언급되는 단계를 포함하는" 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 단계도 포함할 수 있다.
단수인 "하나"는 복수도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
하기 실시예에서 사용된 자성 분리기는 고도 구배 자성 분리 시스템 (HGMS), 더 구체적으로는 MES 100 RS (안드리츠(Andritz) KMPT GmbH 사)이다. 그러나, 상기에서 상세하게 기술된 바와 같이 구성되는 어떠한 유형의 자성 분리기도 본 개시내용의 방법을 수행하는 데에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
마찬가지로, 상기에서 언급된 바와 같은 높은 작동 압력을 견딜 수 있는 설계를 가지는 임의 유형의 멤브레인 크로마토그래피 장치가 본 개시내용의 방법을 수행하는 데에 사용될 수 있으며, 그에 따라 하기 실시예들 중 일부에서 사용되는 바와 같은 셀룰로스 섬유 크로마토그래피 (피브로(Fibro) 크로마토그래피로 알려져 있음) 카세트/유닛으로 제한되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다. 피브로 크로마토그래피 (GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences) 사)는 짧은 공정 시간 및 높은 생산성을 위한 초속성 크로마토그래피 정제로서, 고도의 유량 및 고도의 셀룰로스 섬유 용량을 이용한다 (https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/products-and-solutions/downstream-bioprocessing/fibro-chromatography).
또한, 멤브레인 크로마토그래피 장치에서 사용될 멤브레인 크로마토그래피 재료가 하기 실시예들 중 일부에서 사용되는 바와 같은 소위 피브로 애드히어(Fibro adhere) 재료로 제한되는 것은 아니다. 피브로 애드히어 (GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사)는 강한 이온 교환 다중모드 리간드에 의해 유도체화될 수 있는 셀룰로스 나노섬유를 포함하는 재료이다. 적합한 멤브레인 크로마토그래피 재료의 또 다른 비-제한적인 예는 높은 유속이 사용되는 것을 가능하게 하는 경질 아가로스 매트릭스를 기재로 하는 캅토(Capto)™ 애드히어 (GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사)이다. 상기 아가로스 매트릭스는 다중모드 음이온 교환 리간드인 N-벤질-N-메틸에탄올아민에 의해 유도체화된다.
[ 실시예 ]
실시예 1
목적
본 연구의 목적은 Mag 세파로스™ 프리즘A 및 고도 구배 자성 분리기 (HGMS) 시스템인 MES 100 RS (안드리츠 KMPT GmbH 사)를 사용하여 IgG를 결합시키고 용리하는 것이었다. 목적은 유동 용리를 사용하여 HGMS 시스템으로부터 IgG를 용리하는 것이 가능한지를 확인하는 것이었다.
재료
다클론 IgG (감마놈(Gammanorm)™), 옥타파르마(Octapharma) 사
NaH2PO4 H2O, pa, 머크(Merck) 사
Na2HPO4 2 H2O, pa, 머크 사
Na-아세테이트 삼수화물, pa, 머크 사
아세트산, pa , 머크 사
트윈(Tween)™ 20, 머크 사
트리스(Tris) 염기, pa, 머크 사
Mag 세파로스™ 프리즘A, GE 헬스케어 사
장비
HGMS 장비, MES 100 RS, 안드리츠 KMPT GmbH 사
25 L 플라스틱 완충제 트레이
혼합 로터, RW20, 잔케 & 쿤켈(Janke & Kunkel) 사
125 mL 멸균 플라스틱 병, 날진(Nalgene) 사
분광광도계, 제네시스(GENESYS)™ 10S UV-Vis, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사
유리 필터, G3, ~700 mL, 스콧 듀란(Scott Duran) 사
원심분리기, 5810R, 에펜도르프(Eppendorff) 사
완충제
20 mM Na- 포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 7.4
25 L 완충제 용기에서 25 L의 dH2O를 사용하여 11.35 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O, 74.3 g의 Na2HPO4 및 219.2 g의 NaCl을 희석 및 혼합하였다.
100 mM NaOAc pH 3.2
25 L 완충제 용기에서 25 L의 dH2O를 사용하여 140 mL의 아세트산 및 7.4 g의 NaOAcㆍ3ㆍH2O를 희석 및 혼합하였다.
1 M NaOH
1000 mL의 밀리(milli)Q 워터(water)를 사용하여 40 g의 NaOH를 희석 및 혼합하였다.
0.05 % 트윈을 포함하는 PBS
메디카고(Medicago) 사의 PBS 2개 정제를 2000 mL의 밀리Q 워터와 혼합하였다. 1 mL의 트윈 20을 피펫팅하여 용액과 혼합하였다.
100 mM NaOAc pH 2.9
5.7 mL의 아세트산 및 0.02 g의 NaOAc 3H2O를 1000 mL의 밀리-Q 워터와 혼합하였다.
프로토콜
Mag 세파로스 프리즘A의 준비
사용 전에, 유리 필터 (G3 세공 크기)에서 5 cv의 PBS를 사용하여 200 mL의 Mag 세파로스 프리즘A를 세척하였다.
IgG의 준비, 6 L 중 2 mg /ml
12 g (165 mg/ml, 73 ml)의 인간 IgG 감마놈을 6 L의 20 mM Na-포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 7.4에 희석하였다. 총 부피는 6080 ml이었으며, IgG 농도는 UV280을 사용하여 1,9 mg/ml로 분석되었다.
IgG를 동반한 Mag 세파로스 프리즘A 37-100의 인큐베이션
400 mL의 세척된 비드를 IgG g를 포함하는 6 L의 용액과 함께 버킷(bucket)으로 옮기고, 1시간 동안 혼합하였다.
HGMS 공정
냉각수, 공기압 및 증류수로 MES 100 RS 시스템을 작동개시하였다. 튜브를 세척하고 시스템으로부터 공기를 제거하기 위하여 실온에서 1 L 부피측정 플라스크를 채운 물을 사용하여 시스템의 연동 펌프를 먼저 보정한 다음, 준비된 완충제를 사용하여 보정하였다.
Figure pct00001
인큐베이션 후, 자성 분리기에서 하기의 프로그램을 사용하였다:
2 GE- IgG -정제:
주요 단계 1: 자성 입자 (MP) 적재
하위단계 1: 적재: 개시 전에 모두 중지, 단계 시간 250초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +50 %, 밸브 XV01 및 XV14 개방. 나머지 공급물은 튜브를 세척하기 위한 PBS 완충제를 사용하여 수동으로 펌핑 투입하였음.
주요 단계 2: 재순환
하위단계 1: 재순환: 단계 시간 30초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +30 %, 밸브 XV08 및 XV13 개방.
주요 단계 3: 세척 완충제
하위단계 1: 공급물 완충제 1: 단계 시간 60초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +70 %, 밸브 XV02 및 XV14 개방.
하위단계 2: 혼합물 완충제: 개시 전에 모두 중지, 단계 시간 20초, 믹서 설정 값 60 %
하위단계 3: 포획: 단계 시간 10초, 자석 작동개시,
하위단계 4: 재포획: 단계 시간 60초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +30 %, 밸브 XV08 및 XV13 개방
하위단계 5: 전이: 단계 시간 1초, 자석 작동개시, 밸브 XV02, XV08 및 XV13 및 XV14 개방.
주요 단계 4: 세척 H2O
하위단계 1: 공급물 완충제 2: 단계 시간 60초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +70 %, 밸브 XV03 및 XV14 개방.
하위단계 2: 혼합물 완충제 2: 개시 전에 모두 중지, 단계 시간 20초, 믹서 설정 값 60 %
하위단계 3: 포획: 단계 시간 10초, 자석 작동개시,
하위단계 4: 재포획: 단계 시간 60초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +30 %, 밸브 XV08 및 XV13 개방.
하위단계 5: 전이: 단계 시간 1초, 자석 작동개시, 밸브 XV02, XV08 및 XV13 및 XV14 개방.
주요 단계 5: 용리
하위단계 1: 포획: 단계 시간 10초, 자석 작동개시
하위단계 2: 재포획: 단계 시간 60초, 자석 작동개시, 펌프 설정 값 +30 %, 밸브 XV08 및 XV13 개방.
하위단계 3: 전이: 단계 시간 1초, 자석 작동개시, 밸브 XV07, XV08 및 XV13 및 XV16 개방.
하위단계 4: 공급물 용출액: 단계 시간 4200초, 자석 작동개시, 믹서 설정 값 10 %, 펌프 설정 값 +5 %, 밸브 XV07 및 XV16 개방.
사전-칭량된 125 ml 플라스틱 병에 수동에 의해 ~100 ml 분획으로 용출액을 수집하였다. 용리 후, 각 병을 칭량하고, 빈 병의 용량 (51.5 mg)으로 총 부피를 차감하는 것에 의해, 각 병의 실제 용리 부피를 측정하였다.
분석
2 M 트리스 염기를 사용하여 용출액을 pH 5로 중화하였다. 분광광도계인 써모피셔 사의 제네시스를 사용하여 UV280에 의해 모든 분획에서 역가를 측정하였다.
결과, 분석 및 결론
1 cm 큐벳에서의 UV280 값을 소광 계수 1.36으로 나누어 IgG의 mg/ml로 농도를 수득하는 것에 의해 농도를 계산하였다. UV280 값이 1을 상회하는 경우, 샘플을 희석하였다. 농도 및 누적 수율을 누적 용리 부피에 대하여 플로팅하였다.
도 4의 그래프는 2.7×CV로 98 %의 수율을 가지는 뚜렷한 용리 피크를 나타낸다 (총 자성 비드 용량 부피 0.4 L).
결론
혼합 및 유량은 용리 동안 자성 챔버로부터 자비드(magbead)가 유출되어 나오지 않도록 설정하였다. 자석이 작동개시되는 동안의 혼합은 동시에 자비드가 자성 챔버에서 현탁되도록 함으로써, IgG의 배치 용리 대신 연속적인 용리를 가능하게 하게 된다.
이와 같은 실험은 Mag 세파로스 프리즘a 37-100 ㎛를 사용하여 자성 챔버에서 혼합하는 동안 연속 양식으로 IgG를 용리하여 2.7 부피의 Mag 세파로스 비드에서 98 % 수율을 초래하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
실시예 2
목적
본 연구의 목적은 Mag 세파로스 프리즘A (37-100 ㎛) 및 고도 구배 자성 분리기 (HGMS) 시스템인 MES 100 RS (안드리츠 KMPT GmbH 사)를 사용하여 IgG1 단일클론 항체를 포함하는 CHO 세포 배양물을 정화 및 정제하는 것이었다. 목적은 어떠한 Mag 세파로스도 상실하지 않으면서 유동 용리를 사용하여 HGMS 시스템으로부터 mAb를 용리하는 것이 가능한지를 확인하는 것이었다.
재료
CHO 세포 배양물, GE 헬스케어 사
NaH2PO4 H2O, pa, 머크 사
Na2HPO4 2 H2O, pa, 머크 사
Na-아세테이트 삼수화물, pa, 머크 사
아세트산, pa , 머크 사
트윈 20, 머크 사
트리스 염기, pa, 머크 사
Mag 세파로스 프리즘A, 37-100 ㎛, GE 헬스케어 사
mAb 표준, 8.82 mg/mL, GE 헬스케어 사
장비
HGMS 장비, MES 100 RS, 안드리츠 KMPT GmbH 사
25 L 플라스틱 완충제 트레이
혼합 로터, RW20, 잔케 & 쿤켈 사
125 mL 멸균 플라스틱 병, 날진 사
HPLC, 1260 인피니티(Infinity), 아길렌트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 사
유리 필터, G3 세공 크기, ~700 mL, 스콧 듀란(Scott Duran) 사
원심분리기, 5810R, 에펜도르프 사
pH 측정기, 913 pH 측정기, 메트롬(Metrohm) 사
맵셀렉트 슈어 하이트랩(MabSelect SuRe HiTrap), 29-0491-04, GE 헬스케어 사
수퍼덱스(Superdex) 200 인크리스(Increase) 10/300 GL, , GE 헬스케어 사
0.2 ㎛ 주사기 필터, 스테리벡스(Sterivex) HV, 밀리포어(Millipore) 사
10-100 μL 피펫, 메틀러 톨레도(Mettler Toledo) 사
100-1000 μL 피펫, 에펜도르프 사
셀백(Cellbag)™ 10 L, BC11, 기본형, GE 헬스케어 사
조건 및 관찰
용액의 준비:
20 mM Na- 포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 7.4
25 L 완충제 용기에서 25 L의 dH2O를 사용하여 11.35 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O, 74.3 g의 Na2HPO4 및 219.2 g의 NaCl을 희석 및 혼합하였다.
100 mM NaOAc pH 3.2
25 L 완충제 용기에서 25 L의 dH2O를 사용하여 140 mL의 아세트산 및 7.4 g의 NaOAcㆍ3ㆍH2O를 희석 및 혼합하였다.
1 M NaOH
1000 mL의 밀리Q 워터를 사용하여 40 g NaOH를 희석 및 혼합하였다.
0.05 % 트윈을 포함하는 PBS
메디카고 사의 PBS 2개 정제를 2000 mL의 밀리Q 워터와 혼합하였다. 1 mL의 트윈 20을 피펫팅하여 용액과 혼합하였다.
100 mM NaOAc pH 2.9
5.7 mL의 아세트산 및 0.02 g의 NaOAc 3H2O를 1000 mL의 밀리-Q 워터와 혼합하였다.
mAb 공급물의 준비
mAb를 함유하는 ~7 L 양의 CHO 세포를 사용하였다. 세포 밀도는 23.81 MVC/mL, 생존율: 66.4 % 및 mAb 역가는 2.7 mg/mL이었다. 세포를 10 L 셀백 (기본형)으로 펌핑하였다.
역가 분석법, 맵셀렉트 슈어 하이트랩 결합 및 용리의 준비
맵셀렉트 슈어 하이트랩™ 컬럼을 HPLC 시스템상에 커플링하였다. 250 μL 플라스틱 HPLC 바이알에서 하기 표에 따라 mAb (mAb 역가 8.82 mg/mL)를 사용한 표준 곡선을 준비하였다.
Figure pct00002
설명, 맵셀렉트 슈어 하이트랩법 ( HPLC를 사용한 역가 ):
주사 부피: 50 μL
유량: 1 mL/분
검출: 280 nm
A-완충제: PBS+0.05 % 트윈 pH 7.4
B-완충제: 100 mM NaOAc pH 2.9
Figure pct00003
세포 배양물의 역가 측정
~10 mL의 세포 현탁액을 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 세포 현탁액 총 부피 및 고체 총 부피를 모니터링하는 것에 의해 세포 잔사 (고체) 부피를 5 %로 측정하였다. 0.2 ㎛ 필터를 통하여 1 mL HPLC 바이알로 상청액을 여과하였다. 상기한 역가 방법에 따라 상청액의 역가를 측정하였다.
Figure pct00004
세포 상청액 mAb 역가:
반응 = 11924 mAU
역가 = 11924/4383.7 = 2.72 mg/mL
Mag 세파로스 프리즘A의 준비
사용 전에 유리 필터 (G3 세공 크기) 상에서 5 cv의 PBS를 사용하여 400 mL의 Mag 세파로스 프리즘A를 세척하였다.
세포 배양물을 동반한 Mag 세파로스 프리즘A의 인큐베이션
400 mL의 세척된 비드를 6250 g의 CHO 세포 현탁액을 포함하는 병으로 옮겼다. 자성 비드를 1시간 동안 CHO 세포 현탁액과 혼합하였다. 1 mL의 샘플을 원심분리하고, 공급물 중 나머지 mAb (Mag 세파로스 프리즘A에 결합되지 않은 것)를 조사하기 위하여 맵셀렉트 슈어 하이트랩법 (상기 참조)으로 분석하였다.
HGMS 공정
냉각수, 공기압 및 증류수로 MES 100 RS 시스템을 작동개시하였다. 실온에서 1 L 부피측정 플라스크를 채운 물을 사용하여 시스템의 연동 펌프를 보정하였다.
dH2O를 사용하여 유입구 튜브 및 사용될 밸브 XV01, XV02, XV03, XV07을 프라이밍하였다(primed). 시스템을 프라이밍함으로써 자성 분리기의 기포를 제거하고, 동시에 모든 공기가 제거될 때까지 믹서를 50 %로 작동개시하였다. 시스템에서의 역류를 사용하여, 순환 밸브 XV08와 XV013 사이의 호스를 공기가 존재하지 않을 때까지 충전하였다.
물 프라이밍 후, 실제 전개 완충제를 사용하여 시스템을 프라이밍하였다.
XV01= Mag 비드 혼합물 적재 (20 mM Na-포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 7.4를 사용하여 프라이밍)
XV02= 20 mM Na-포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 7.4
XV03= dH2O
XV07= 100 mM Na-아세테이트 pH 3.2
인큐베이션 후, 자성 분리기에 대하여 하기의 프로그램을 사용하였다.
단계 1. 자성 입자와 공급물의 혼합물 적재
펌핑 시간은 6 L의 공급물 혼합물을 펌핑하도록 250초로 설정하였다. PBS 완충제를 사용하여 수동으로 나머지 공급물을 펌핑함으로써, 혼합물의 유입구 튜브를 세척하였다. 분리 유닛의 자성화가능한 디스크상에 모든 자성 비드를 포획하기 위하여, 시스템을 재순환으로 설정하였다.
단계 2. 20 mM Na-포스페이트 + 0.15 M NaCl을 사용한 세척, 4 주기 반복
하위단계 1. 70 % 펌프 속도를 사용하여 60초 동안 완충제를 공급 (2 L 완충제).
하위단계 2. 20초 동안 60 % 로터 속도로 완충제와 비드를 혼합, 자석 및 밸브 작동중지.
하위단계 3. 자석을 작동개시함으로써 비드를 포획.
하위단계 4. 재포획. 모든 비드를 포획하기 위해 30 %의 펌프 속도를 사용하여 재순환.
하위단계 5. 전이. 역류를 방지하기 위한 짧은 (1초) 밸브 개방.
단계 3. 물을 사용한 세척, 1 주기
물이 밸브 XV03으로부터 펌핑되었다는 것 이외에는 20 mM Na-포스페이트 + 0.15 M NaCl을 사용한 세척에서와 동일한 하위단계들을 물 세척에 사용하였다.
단계 4. 용리
본 단계에서는, 믹서 작동개시 및 자석 작동개시를 사용하여 mAb를 유동-용리하였다.
하위단계 1. 포획. 자석 작동개시.
하위단계 2. 재포획. 30 %의 펌프 속도를 사용하여 60초 동안 재순환.
하위단계 3. 전이. 역류를 방지하기 위한 짧은 순간 (1초) 동안의 밸브 개방.
하위단계 4. 공급물 용출액: 100 mM NaOAc pH 3.2, 밸브 XV07을 사용한 용리. 자석 작동개시, 5 %의 펌프 속도 (140 mL/분), 10 %로 믹서 설정. 4286초 동안 용리 수행.
사전-칭량된 150 ml 플라스틱 병에 수동에 의해 ~100 ml 분획으로 용리된 재료를 수집하였다. 용리 후, 각 병을 칭량하고, 빈 병의 용량으로 총 부피를 차감하는 것에 의해, 각 병의 실제 용리 부피를 측정하였다. 하기 표 5를 참조한다.
Figure pct00005
용출액 분획은 옅은 황색이며 투명하였다.
2 M 트리스 염기를 사용하여 용출액을 pH 5로 중화하였으며, 그 후 그것을 0.2 ㎛ 여과하였다. 실제 용량 2 M의 트리스 염기를 상기 용출액의 중량에 포함시켰다. 맵셀렉트 슈어 하이트랩 결합 및 용리 검정에 의해 모든 분획에서 역가를 측정하였으며, 상기를 참조한다.
마지막으로, 분획 7-18을 혼합수집하고, 1.5 mL HPLC 바이알에서 200 mM Na-포스페이트 pH 6.8을 사용하여 그와 같은 혼합수집물 1 mL를 20× 희석한 후, HPLC 시스템에서 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 분석하고, mAb 표준 (동일한 완충제를 사용하여 8× 희석된 것)과 비교하였다.
분리기 내의 Mag 세파로스를 방출하고, 다시 용기로 펌핑하였다. G3 유리 필터에서 30분 동안 2 cv의 1 M NaOH를 사용하여 수지를 세척하고, 5 cv의 PBS를 사용하여 그것을 평형화한 후, 마지막으로 보존 용액으로서의 2 cv의 20 % 에탄올을 사용하여 그것을 세척하고, 저장용 20 % EtOH를 사용하여 수지를 다시 플라스틱 병으로 옮겼다.
SEC법에 의한 순도
주사 부피: 10 μL
유량: 0.8 mL/분
컬럼: 수퍼덱스 200 인크리스 10/300 GL
중지 시간: 26분
214 nm에서 검출.
HCP 분석
개시 및 혼합수집 용출액 샘플에서, 숙주 세포 단백질 (HCP) 분석 전에 50μL의 보존 용액을 450 μL의 샘플에 첨가하였다.
소프트웨어 패키지 5.3.0이 구비된 자이로랩(Gyrolab) 워크스테이션 (자이로 프로테인 테크놀로지스(Gyros Protein Technologies) 사)에서 제3 세대 CHO-HCP 엘리사(ELISA) 키트 (시그너스(Cygnus) 사)를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과, 분석 및 결론
도 5a는 자성 분리기로부터의 mAb의 용리 프로파일을 나타낸다. 1.2 L의 용출액에 상당하는 혼합수집 분획인 분획 7-18은 3 상 부피 (1 상 부피 = 400 mL)의 용리 완충제를 사용하여 87 %의 mAb 수율이 수득될 수 있다는 것을 보여준다. 혼합수집된 용출액에서의 농도는 4× 농도인 10.7 mg/mL이었다. 인큐베이션 단계에서의 결합 수율은 94 %이었으며, 총 용리 수율은 91 %이었다.
혼합수집된 샘플을 SEC 및 HCP 검정에 의해 분석하고, 순수한 mAb 표준과 비교하였다. 결과를 도 5b (더 작은 척도) 및 도 5c (더 큰 척도; 피크의 기저부를 확대하였음)에 나타내었다. 실선은 혼합수집된 mAb 용출액이며, 점선은 순수한 mAb 표준이다. 크로마토그램은 표준화하였다. 응집물 피크, 주 피크 및 주 피크 다음 피크를 적분하였는데, 순도는 98.5 %로 측정되었다.
실시예 3
목적
본 연구의 목적은 비드의 이동 없이 자성 유동화 비드를 사용하는 Mag 세파로스 프리즘A로부터의 IgG의 유동-용리에 어떤 혼합 속도 (로터 속도) 및 유량이 사용될 수 있는지를 조사하는 것이었다. 상이한 혼합 속도, 비드의 부피 및 비드 크기에 의해 IgG 용리 프로파일이 어떻게 영향을 받는지도 조사하였다.
장비
HGMS 분리기, MES100RS 일련 번호 400213239, 안드리츠 Gmbh 사
인큐베이션 시의 믹서, IL82274-3, 잔케-쿤켈 사
UV 판독기, 스펙트라맥스(SpectraMax)™ 플러스(plus), 몰큘라 디바이시즈(Molecular Devices) 사
UV 판독 플레이트, 96 웰, 3635 lot 33918007, 코닝(Corning) 사
저울, PG 5002 델타레인지(DeltaRange), 메틀러 사
플라스틱 병 130 mL
25 L 플라스틱 완충제 병
Mag 세파로스 프리즘A 0-37 ㎛ Lot LS-033447, GE 헬스케어 사
Mag 세파로스 프리즘A 37-100 ㎛ LS-32871, GE 헬스케어 사
재료
인간 IgG, 감마놈 165 mg/mL, 옥타파르마 사
NaH2PO4ㆍH2O, pa, 머크 사
Na2HPO4ㆍ2 H2O pa, 머크 사
NaCl, pa, 머크 사
아세트산, pa, 머크 사
Na-아세테이트ㆍ3 H2O, pa, 머크 사
조건 및 관찰
용액의 준비:
A- 완충제 , 20 mM PO 4 + 0.15 M NaCl pH 7.5
Figure pct00006
B- 완충제 , 0.1 M Na-아세테이트 pH 3.2
Figure pct00007
IgG 2 mg /mL
73 mL의 IgG (감마놈)를 6 L의 A-완충제에 희석함으로써, ~2.0 mg/mL의 IgG 농도를 수득하였다.
비드 상실을 조사하기 위한 로터 속도 및 유량의 시험
100 mL, 300 mL 또는 400 mL (습윤 침강된 수지) Mag 세파로스 프리즘a 37-100 ㎛ 또는 0-37 ㎛를 자석을 작동개시한 채로 HGMS 시스템에 펌핑하였다. 상이한 속도로 로터를 작동개시하고, 어떤 로터 속도 및 유량에서 자성 비드가 HGMS 챔버로부터 이동하기 시작하는지를 조사하기 위하여 (시각적으로), A-완충제를 사용하는 유동 펌프도 변동시켰다.
결과를 하기 표 6-10에 나타내었다.
100 mL의 Mag 세파로스 0-37 ㎛ 적재: 150 rpm의 로터 속도로 2100 mL/분까지 비드를 포획하였다. 비드들은 225 rpm 로터 속도에서 HGMS로부터 이동하기 시작한다.
300 mL의 Mag 세파로스 0-37 ㎛ 적재: 75 rpm의 로터 속도로 560 mL/분까지 비드를 포획하였다.
100 mL의 Mag 세파로스 37-100 ㎛ 적재: 150 rpm의 로터 속도로 2100 mL/분까지 비드를 포획하였다.
300 mL의 Mag 세파로스 37-100 ㎛ 적재: 150 rpm의 로터 속도로 560 mL/분까지 비드를 포획하였다. 비드들은 300 rpm의 로터 속도에서도 여전히 140 mL/분으로 포획된다.
400 mL의 Mag 세파로스 37-100 ㎛ 적재: 75 rpm의 로터 속도로 1400 mL/분까지 비드를 포획하였다.
비드가 HGMS 시스템으로부터 이동 유출되기 시작하는 로터 속도에 비해 더 낮은 로터 속도에서 모든 적재량에 대해 더 고도의 유량을 전개하는 것이 가능하였으며, 하기 표들을 참조한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
IgG의 유동 용리 연구
각 수지 프로토타입 400 mL를 IgG 2 mg/mL 샘플 6 L와 함께 >1시간 동안 인큐베이팅하였다.
100 또는 400 mL (1.6 L 또는 6.4 L의 IgG 수지 혼합물)의 IgG 흡착된 Mag 세파로스 프리즘A를 시스템으로 펌핑하고, 자석에 의해 자성 비드를 포획한 후, 1 L의 A-완충제를 사용하여 비드를 3회 세척하였다.
140 mL/분에서 상이한 로터 속도로 용리를 수행함으로써, 비드 부피 및 로터 속도가 어떻게 용리 성능에 영향을 주는지를 조사하였다.
용리시에는, ~100-2100 mL의 분획들을 수집하였으며, UV 플레이트 판독기를 사용하여 각 분획에 대해 흡광도를 측정하고, 또한 칭량을 사용하여 각 분획에서의 정확한 부피를 측정하였다. 각 분획에 대한 UV를 누적 용리 부피에 대하여 플로팅하였다. 도 1-4를 참조한다.
일반적으로, 0 %의 로터 회전은 IgG의 불충분한 용리를 나타내었는데, >4000 mL인 수 컬럼 부피의 용리 완충제 후 고농도의 IgG가 여전히 용출액 중에 존재하고 용리 프로파일이 농도의 감소 경향을 보이지 않았기 때문이다.
<37 ㎛ 비드의 경우, 더 적은 비드 부피가 로터 속도에 대한 더 적은 의존성으로 이어졌다. 100 mL 비드의 75 및 150 rpm 로터 속도에서의 용리 피크의 형상은 유사하였다 (도 8a). 400 mL 비드의 경우, 용리 피크의 형상이 로터 속도들 사이에서 더 크게 달라졌는데, 가장 효과적인 IgG의 용리는 150 rpm을 사용하는 것이었다 (도 8c).
37-100 ㎛ 비드의 경우, 더 적은 비드 부피가 로터 속도에 대한 더 적은 의존성으로 이어졌다. 100 mL 비드의 경우, 75 rpm 로터 속도 및 150 rpm 로터 속도의 용리 피크가 유사하였다 (도 8b). 400 mL 비드의 경우, 용리 피크의 형상이 150 rpm 회전과 0 rpm 회전 사이에서 극적으로 달랐다. 150 rpm 회전에서는 IgG가 대칭적인 용리 피크로 용리되어 나온 반면, 0 rpm 회전에서는 IgG가 6500 mL의 용리 완충제 후에도 계속 용리되어 나왔다 (도 8d).
0-37 ㎛ 비드를 37-100 ㎛ 비드와 비교해보면, 100 mL의 비드를 사용하여서는 용리 피크 형상이 유사하였다 (각각 도 8a 및 도 8b 참조). 400 mL 비드 및 150 rpm 회전에서는, 더 큰 비드인 37-100 ㎛가 400 mL <37 ㎛ 비드에서의 용리 피크에 비해 훨씬 더 날카로운 용리 피크를 나타내었다. 더 큰 비드를 사용하면 대부분의 IgG가 2000 mL의 용리 완충제 전에 용리되어 나오는 것으로 보이는 반면, <37 ㎛ 비드의 경우 용리 피크가 4000 mL에서도 안정한 기준선에 안착되지 않았다 (각각 도 8c 및 도 8d 참조).
실시예 4
목적
본 연구의 목적은 자성 분리 후 생체분자의 폴리싱을 위하여 멤브레인 크로마토그래피 단계를 추가하는 것의 효과를 평가하는 것이었다. 더 구체적으로, 연구는 고도 구배 자성 분리기 시스템을 사용한 Mag 세파로스 프리즘A에 의한 정제 후의 피브로 애드히어 유닛 프로토타입을 사용한 멤브레인 크로마토그래피에 의한 IgG1 단일클론 항체 (mAb)의 폴리싱으로 구성되었다.
재료
개시 샘플: CHO 세포에서의 XDR-10 배양으로부터의 IgG1 단일클론 항체, 생존율 66.4 %, 농도 2,7 g/L
수퍼덱스™ 200 인크리스 10/300 GL, GE 헬스케어 사
Mag 세파로스 프리즘A 37-100 ㎛, 400 ml, GE 헬스케어 사
피브로 애드히어 유닛 프로토타입, 0.4 ml:
Figure pct00013
피브로 애드히어 1: 167 g/Ltr의 애드히어 반응 농도를 사용하여, 알릴 글리시딜 에테르 (AGE)의 첨가 후, 재료를 디비닐술폰 (DVS)과 가교시켰다. 적정 563 umol/g.
Figure pct00014
피브로 애드히어 2: 167 g/Ltr의 애드히어 반응 농도를 사용하여, AGE를 첨가하기 전에, 재료를 DVS와 가교시켰다. 적정 212 umol/g.
Figure pct00015
피브로 애드히어 3: 500 g/Ltr의 애드히어 반응 농도를 사용하여, AGE를 첨가하기 전에, 재료를 DVS와 가교시켰다. 적정 478 umol/g.
장비
악타(AKTA)™ 퓨어(Pure) 25, GE 헬스케어 사
HPLC 인피니티 1200, 아길렌트 테크놀로지스 사
완충제
25 mM Na- 포스페이트 + 0.15 M NaCl pH 6,3
2 L의 dH2O를 사용하여 4.88 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O, 2.6 g의 Na2HPO4 및 17.5 g의 NaCl을 희석 및 혼합하였다.
25 mM Na- 포스페이트 pH 7
1 L의 dH2O를 사용하여 1.16 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O 및 2.367 g의 Na2HPO4를 희석 및 혼합하였다.
25 mM Na- 포스페이트 + 1 M NaCl pH 7
1 L의 dH2O를 사용하여 0.464 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O, 3.851 g의 Na2HPO4 및 58.44 g의 NaCl을 희석 및 혼합하였다.
25 mM Na- 포스페이트 pH 7.5
1 L의 dH2O를 사용하여 0.73 g의 Na NaH2PO4ㆍH2O 및 3.508 g의 Na2HPO4를 희석 및 혼합하였다.
100 mM 아세트산 pH 3.0
1 L의 dH2O를 사용하여 6 ml의 빙초산을 희석 및 혼합하였다.
조건 및 관찰
실시예 2에서 기술된 바와 같은 고도 구배 자성 분리기 시스템을 사용한 Mag 세파로스 프리즘A로부터의 용출액을 피브로 애드히어 유닛 프로토타입을 사용하는 멤브레인 크로마토그래피에 의한 추가적인 폴리싱에 사용하였다.
피브로 애드히어 유닛을 악타 퓨어 25 시스템에 연결하고, 3종의 상이한 25 mM Na-포스페이트 완충제 조건 (pH 및 전도도)을 평가한 바, 하기 표 11을 참조한다. 50 유닛 부피 (20 ml) 동안 16 ml/분의 유량으로 평형화를 수행한 후, 16 ml/분으로 4 ml의 mAb 샘플을 적용하고, 관통물을 수집하였다. 피브로 애드히어 유닛을 20 유닛 부피 (8 ml)로 세척하고, 16 ml/분의 유량을 25 유닛 부피 (10 ml) 동안 100 mM 아세트산 pH 3.0으로 세척한 후, 50 유닛 부피 (20 ml) 동안 재-평형화하였다. 280 nm에서 계속 UV를 모니터링하였다.
Figure pct00016
결과, 분석 및 결론
가변적인 완충제 조건에서의 피브로 애드히어를 사용한 mAb 폴리싱으로부터의 크로마토그램은 3종 전체의 완충제 조건에서 샘플 적용 동안 높은 UV 값을 나타내었다. 샘플 적용 동안의 샘플 관통물을 수집하고 추가적으로 분석하였으며, 하기 표 12를 참조한다. 0.2 M Na 포스페이트 완충제를 사용하여 샘플 당 26분 동안 0.8 ml/분의 유량으로 SEC-HPLC, 수퍼덱스 200 인크리스 10/300 GL에 의해 mAb의 농도 및 응집물의 백분율을 분석하였다. 시그너스(Cygnus) 제3 세대 CHO HCP 엘리사 키트를 사용하여 관통물 분획들 중 숙주 세포 단백질 농도를 분석하였다.
Figure pct00017
끝으로, mAb의 폴리싱은 고도의 수율 93-100 %, 및 숙주 세포 단백질 (HCP)의 실질적인 감소로 이어졌다. 최고 HCP 감소는 93-99 %의 수율로 이어졌던 pH 7.5 및 3.5 mS/cm의 전도도를 사용한 것에서였으며, 최고의 리간드 밀도를 가지는 피브로 애드히어 프로토타입에서 HCP 감소가 최고였다.
상기한 대표적인 해당 실시양태들로 본 개시내용이 제한되지는 않는다는 것, 그리고 하기하는 청구범위의 영역 내에서 본 개시내용의 몇 가지 생각할 수 있는 변형이 가능하다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (40)

  1. (a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
    (b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
    (c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
    (d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
    (e) 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 분리기에서 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 단계;
    (f) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계
    를 포함하는, 세포 배양물로부터의 생체분자의 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (e)가 자기장의 크기를 변동시키는 것에 의해, 예컨대 진동 자기장을 적용하는 것에 의해, 자성 입자를 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. (a) 생체분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 자성 입자를 제공하는 단계;
    (b) 생체분자를 포함하는 세포 배양물 또는 생물학적 용액을 자성 입자와 접촉시킴으로써, 결합된 생체분자를 포함하는 자성 입자를 수득하는 단계;
    (c) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계;
    (d) 임의적으로, 세척액을 사용하여 자성 입자를 세척하는 단계;
    (e1) 자성 분리기에서 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키면서, 자성 분리기를 통하여 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계;
    (f1) 자성 분리기로부터 용리되는 생체분자를 멤브레인 크로마토그래피 장치로 전달하는 단계;
    (g1) 멤브레인 크로마토그래피에 의해 불순물 및/또는 오염물로부터 생체분자를 분리하는 단계
    를 포함하는, 세포 배양물 또는 생물학적 용액으로부터의 생체분자의 분리 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (e1)이 하기를 포함하는 것인 방법:
    (e1a) 자성 분리기의 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 분리기에서 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 단계;
    (e1b) 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공함으로써, 자성 입자로부터 결합된 생체분자를 용리하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (e1a)가 자기장의 크기를 변동시키는 것에 의해, 예컨대 진동 자기장을 적용하는 것에 의해, 자성 입자를 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (g1)의 멤브레인 크로마토그래피 장치에서의 생체분자의 체류 시간이 약 0.5초 내지 약 6분, 바람직하게는 약 1초 내지 약 30초의 범위인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 자성 분리기가 멤브레인 크로마토그래피 장치를 통하여 용리액의 유동, 및 임의적으로 세척액의 유동을 제공하는 크로마토그래피 시스템에 연결되는 것인 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치가 사용시 이동상이 그를 통하여 투과될 수 있는 복수의 세공을 포함하는 고정 상을 형성하는 1종 이상의 전기방적 중합체 나노섬유를 포함하는 크로마토그래피 재료를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 고정 상이 멤브레인의 형태인 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치가 적어도 하나의 흡착 멤브레인을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 흡착 멤브레인이 중합체 나노섬유를 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 멤브레인이 중합체 나노섬유의 부직 웹을 포함하는 것인 방법.
  13. 제8항, 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 폴리술폰, 폴리아미드, 나일론, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌 옥시드, 그리고 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제8항, 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 셀룰로스계 중합체, 예컨대 셀룰로스 및 셀룰로스의 부분적 유도체, 특히 셀룰로스 에스테르, 가교된 셀룰로스, 그래프팅된 셀룰로스 또는 리간드-커플링된 셀룰로스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치가 (i) 양으로 하전된 기, 예컨대 사차 아미노, 사차 암모늄 또는 아민 기 또는 (ii) 음으로 하전된 기, 예컨대 술포네이트 또는 카르복실레이트 기에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함하는 것인 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치가 다중모드 음이온 교환 리간드 및 다중모드 양이온 교환 리간드로 이루어진 군에서 선택되는 다중모드 리간드에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 다중모드 음이온 교환 리간드가 지지체에 커플링된 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 리간드이며, 여기서 상기 지지체는 링커를 통하여 리간드의 질소 원자에 연결되는 것인 방법.
  18. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치가 (i) 이온 교환 기, (ii) 친화성 펩티드/단백질 기재 리간드, (iii) 소수성 상호작용 리간드, (iv) IMAC 리간드 또는 (v) DNA 기재 리간드 예컨대 올리고 dT에 의해 관능화된 크로마토그래피 재료를 포함하는 것인 방법.
  19. 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (g1)에서의 멤브레인 크로마토그래피가 관통형 멤브레인 크로마토그래피인 방법.
  20. 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 또는 크로마토그래피 재료를 통한 용리액의 유동이 일반 유동 또는 접선 유동인 방법.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e1)과 단계 (f1) 사이에 용리액의 pH 조정, 용리액의 희석 또는 용리액의 전도도 조정을 수행하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
  22. 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)가 하기를 포함하며:
    - 대류-기반 크로마토그래피 재료를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103);
    - 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103)으로, 그리고 그로부터 유체를 분배하도록 구성되는 적어도 하나의 유체 분배 시스템 (107);
    - 유입구 (115);
    - 유체 분배 시스템 (107)을 통하여 유입구를 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103)과 연결시키는 적어도 하나의 유입구 유체 채널 (117);
    - 유출구 (119); 및
    - 유체 분배 시스템 (107)을 통하여 유출구 (119)를 적어도 하나의 크로마토그래피 재료 유닛 (103)과 연결시키는 적어도 하나의 유출구 유체 채널 (121),
    상기 멤브레인 크로마토그래피 장치 (101)의 적어도 일부 부품들은 적어도 유입구 (115) 및 유출구 (119)를 개방된 채로 유지하면서 함께 밀봉되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 또는 (c)가 적어도 하나의 교반기, 예컨대 복수의 교반기를 포함하는 자성 분리기에 자성 입자를 첨가하는 것을 포함하며, 단계 (e) 또는 (e1a)가 교반기(들)를 작동개시함으로써 자성 입자를 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 하기의 하위단계들을 포함하는 것인 방법:
    (d1) 적어도 하나의 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 입자의 유동화된 상을 형성시키는 단계; 및
    (d2) 자기장에서 자성 입자를 잔류시키면서, 적어도 하나의 평면에 본질적으로 수직인 방향으로 세척액의 유동을 제공함으로써, 세포 배양물을 제거하는 단계.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 또는 (e1a)가 자성 분리기의 복수의 본질적으로 평행한 평면에서 자성 입자를 교반함으로써, 자성 입자의 복수의 유동화된 상을 형성시키는 것을 포함하며, 단계 (f) 또는 (e1b)가 복수의 평면들에 본질적으로 수직인 방향으로 용리액의 유동을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자가 최대 10 상 부피, 예컨대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 상 부피; 바람직하게는 최대 4 상 부피, 더욱 바람직하게는 최대 3 상 부피의 용리액을 사용하여 용리되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 단계 (c)-(f) 또는 (c)-(e1), 예컨대 단계 (b)-(f) 또는 단계 (b)-(e1)이 자성 분리기에서 수행되며, 바람직하게는 여기서 자성 분리기는 고도 구배 자성 분리 시스템인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 하기를 포함하는 것인 방법:
    (i) 자성 입자를 자성 분리기에 첨가한 후, 이어서 세포 배양물로부터의 공급물을 자성 분리기에 제공하는 것, 또는
    (ii) 결합된 생체분자를 포함하는 세포 배양물과 자성 입자의 혼합물로부터의 공급물을 자성 분리기에 제공하는 것.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)-(f) 또는 (b)-(e1)이 조합된 생물반응기 용기/접촉기 및 자성 분리기에서 수행되는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 하기의 하위단계들을 포함하는 것인 방법:
    (i) 자기장을 제거하는 단계;
    (ii) 자성 입자를 재현탁하는 단계;
    (iii) 자성 입자를 세척액의 일부와 접촉시키는 단계;
    (iv) 자기장을 사용하여 자성 입자를 잔류시키는 단계; 및
    (v) 잔류되는 자성 입자로부터 세척액을 제거하는 단계.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 또는 (e1)로 진행하기 전에 단계 (d)가 적어도 1회 반복되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f) 또는 (e1)에서 용리액의 선형 유속이 단계 (f)에서 10 내지 3000 cm/시간의 범위, 바람직하게는 50 내지 600 cm/시간의 범위인 방법.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 또는 (e1a)에서 교반기(들)의 속도가 15 내지 1500 rpm의 범위, 바람직하게는 50 내지 300 rpm의 범위인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 자성 분리기가 크로마토그래피 시스템에 연결되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 자성 입자가 8 내지 300 ㎛ 범위, 바람직하게는 37 내지 100 ㎛ 범위의 부피-가중 직경 중간값 (d50,v)을 가지는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 자성 입자가 1.05-1.20 g/ml 침강 입자의 평균 밀도를 가지는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 각 자성 입자가 다공성 중합체 매트릭스, 및 다공성 중합체 매트릭스 중에 매립된 1종 이상의 자성 과립을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 각 자성 입자가 5-15 중량%의 자성 과립을 포함하는 것인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 자성 과립이 1 내지 5 ㎛의 부피-가중 직경 중간값 (d50,v)을 가지는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 각 자성 입자가 입자 표면 영역에서의 농도의 적어도 200 %인 입자 중심 영역에서의 자성 과립 농도를 포함하며, 여기서 중심 영역은 입자 표면으로부터 > 0.2 입자 반경의 거리를 가지는 것으로 정의되고, 표면 영역은 입자 표면으로부터 < 0.2 입자 반경의 거리를 가지는 것으로 정의되는 것인 방법.
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