CN102838674A - 一种利用蛋白a的高密度包被磁珠纯化抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，该方法包括以下步骤：将磁珠和含有抗体的表达产物加入到反应容器中，在反应容器外部或内部施加磁场，然后转移出上清液；将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场；重复洗涤磁珠2~4次；然后加入洗脱缓冲液，撤去磁场，室温下孵育5~15min；施加磁场使磁珠贴壁，转移出溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体。本发明使用磁珠亲和分离技术进行抗体纯化，比传统的抗体亲和层析技术具有更快的抗体捕获速度；此外，纯化操作无需复杂的层析系统，样品无需进行澄清处理，可以直接对粘度较大的样品进行纯化操作；再者，使用了独特的蛋白A包被磁珠，抗体结合效率大幅提高，蛋白A配基的脱落率达到极低水平。

Description

一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法

技术领域

本发明涉及一种抗体纯化的方法，具体涉及一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法。

背景技术

单克隆抗体是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的，其重链和轻链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单克隆抗体药物Rituxan Anti-CD20抗体上市，至2007年，FDA已批准了20多种治疗性单克隆抗体药物，约一半用于治疗癌症，多个已成为年销售额超十亿美元的“炸弹药物”。全球单克隆抗体药物的市场增长十分迅猛，约有200多种单抗处于临床实验阶段，占整个临床生物技术药品总数的三分之一多，其中四分之一在临床三期或等候批准。单抗药物已成为全球生物制药领域发展的主旋律。

单抗药物的迅猛发展对抗体纯化工业提出了新的挑战。目前，主流的抗体纯化生产主要包括以下步骤：1、发酵液澄清；2、抗体捕获；3、抗体精细纯化；4、抗体浓缩洗滤；5、抗体过滤除菌/制剂。在抗体捕获阶段，主要应用蛋白A亲和层析技术从发酵上清液中提取抗体。蛋白A是一种从金黄葡萄球菌细胞膜上提取的蛋白，具有5个IgG结合结构域，能特异性地与抗体Fc端结合。现阶段最常用的蛋白A亲和层析介质是通过将蛋白A用化学偶联的方法固定在琼脂糖凝胶表面制成亲和填料，然后装填成层析柱。将含有抗体的发酵上清液用泵加压注入层析柱中，抗体被层析填料上固定的蛋白A捕获，被捕获的抗体可以通过洗脱溶液的冲洗从蛋白A亲和填料上解离，达到纯化及浓缩的目的。

然而，以上抗体纯化过程存在以下缺点：

1、发酵溶液需进行澄清操作。单抗通常采用哺乳动物细胞无血清悬浮培养的方法进行制备，发酵液中存在大量细胞，容易对层析系统造成堵塞。因此在层析操作之前需经过离心或过滤操作，去除发酵液中的细胞。工业上大规模的澄清操作通常需要流式离心机或是超滤系统，耗时长、价格高昂而且日常维护复杂。

2、层析操作耗时长，仪器昂贵。由于填料可承受的压力及流速有限，因此单位时间内可处理的样品量受限于层析柱的大小及填料性质。大型的层析设备及蛋白A亲和纯化填料非常昂贵，且基本依赖进口，是抗体纯化工业的瓶颈。

3、层析系统不能处理高粘度样品。由于受限于填料可承受的压力，因此高粘度的样品（如血清或高蛋白浓度样品）均需要经过稀释及过滤才能应用于层析操作，造成样品体积的放大及目标产物的稀释。

4、蛋白A亲和层析填料在反复冲洗的过程中容易发生蛋白A配体的脱落。蛋白A在琼脂糖基质上是通过共价偶联实现固定。比较先进的填料为实现蛋白A配基朝向的一致性而达到提高配基利用率的目的，均采用单点定向固定法，即蛋白A与琼脂糖之间只通过一个共价键进行连接，但这种单点固定的方法使蛋白A容易在反复的层析柱冲洗过程中发生脱落。而蛋白A是高致敏原，容易在人体内引起免疫反应，美国食品及药品监督管理局（FDA）对单抗药物中蛋白A配基的残留量有严格的限定。蛋白A脱落现象也影响了亲和填料的有效载量及使用寿命。

近年来，随着磁性分离技术的发展，蛋白A包被的超顺磁性磁珠越来越多地应用于免疫检测及小规模的免疫亲和纯化领域。蛋白A包被磁珠纯化技术无需复杂的层析设备，对样品的澄清度没有限制，只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便快捷地从单抗表达产物中分离单抗，有效解决了传统层析技术的不足之处。但由于目前市面上出现的蛋白A包被磁珠的抗体结合效率相对于传统的琼脂糖填料仍有很大的差距，因此仍未能大规模地应用于抗体纯化工业。

发明内容

为了克服上述的现有抗体纯化方法的缺点，本发明的目的在于提供一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，包括以下步骤：

（1）将蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗体的表达产物加入到反应容器中，搅匀，室温下孵育5~15min，磁珠在溶液中呈均匀分布状态；在该过程中磁珠与抗体结合；

（2）在反应容器外部或内部施加磁场，使磁珠沿磁场方向运动并贴在容器壁上（见图1）或磁体上（见图2）；

（3）从反应容器中转移出上清液；在该过程中，抗体随磁珠贴在容器壁上或磁体上，其余成分被转移出反应容器；

（4）将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液中；重复步骤（2）~（3），完成一次磁珠洗涤；

（5）重复步骤（4）洗涤磁珠2~4次，彻底洗去磁珠上的非特异吸附物质；

（6）将洗脱缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液中，室温下孵育5~15min；该操作是将磁珠上的抗体洗脱下来；

（7）施加磁场使磁珠贴壁，转移反应容器中的溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体。

步骤（1）中的蛋白A的高密度包被磁珠已经申请专利，即是中国专利申请201210107107.7（申请号）实施例1得到的交联有固定化SL-PA融合蛋白的磁珠。

步骤（1）所述的含有抗体的表达产物可以是血清、细胞表达液或腹水。

步骤（2）和（7）所述的施加磁场，其磁通量为1000~10000高斯，作用时间为1-5min。

步骤（4）所述的洗涤缓冲液含有0.01~0.5M的磷酸缓冲液、1~500mM的NaCl，余量为水，pH值6~9。

步骤（6）所述的洗脱缓冲液含有0.01~4M的氨基酸，pH值1.9~5；所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种以上。

步骤（7）所述的调节pH值是用1M的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液调节。

使用后的磁珠重复步骤（4），洗涤至pH值为中性后可重复用于抗体纯化。

本发明的机理是：

磁性材料的磁性随温度的变化而变化，在低温时材料的磁性很难被改变；而当温度升高时，材料将变成“顺磁体”，其磁性很容易随周围的磁场改变而改变。如果温度进一步提高，或者磁性颗粒的粒度很小时，即便在常温下，磁体的极性也呈现出随意性，难以保持稳定的磁性能，这种现象就是超顺磁效应。超顺磁性磁珠能在外部磁场的作用下迅速聚集，当磁场撤离后即可重新分散而不带有剩磁。本发明即利用磁珠的这一特性使其作为一种新型的分离纯化基质用于生物活性物质的分离纯化技术上。

本发明基于利用SLP将功能蛋白定向固定的方法，获得具有固定化蛋白A配基的超顺磁性磁珠（见专利201210107107.7实施例1）。利用该磁珠对抗体的高效特异性结合，从血清或抗体表达产物中捕获抗体，然后利用磁性分离器将磁珠-抗体复合物从混合液中分离，经过对磁珠复合物的多次洗涤，去除磁珠表面的非特异吸附物质，最后用洗脱缓冲液使抗体与磁珠解离并释放到洗脱缓冲液中，达到纯化抗体的目的。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明使用磁珠亲和分离技术进行抗体纯化，比传统的抗体亲和层析技术具有更快的抗体捕获速度（<15分钟）；此外，纯化操作无需复杂的层析系统，样品无需进行澄清处理，可以直接对粘度较大的样品进行纯化操作。

2、与现有的磁珠亲和分离技术相比，本发明由于使用了独特的SLP固定化技术制备的蛋白A包被磁珠，抗体结合效率大幅提高，蛋白A配基的脱落率达到极低水平，使磁珠分离技术在单克隆抗体大批量纯化中的应用成为可能。

3、本发明的纯化方法节省了发酵液澄清步骤。本发明采用磁珠与样品直接混合孵育的方式从样品中捕获抗体，对样品的澄清度及粘度没有特殊要求，可以省去传统抗体层析纯化工艺中样品澄清过滤的步骤，节省了相应的生产时间及设备需求。

4、本发明的纯化方法解决了传统抗体纯化层析工艺耗时长，仪器昂贵的问题。本发明的纯化方法无需昂贵的进口层析设备，只需要简单的磁场（由永磁体或电磁体提供均可）即可进行磁珠的分离及收集。由于磁珠具有纳米级的直径，因此能提供极大的捕获面积，在15分钟内即可达到与抗体的饱和吸附。

5、本发明的纯化方法解决了现有抗体亲和磁珠载量低的问题。本发明采用以SLP功能蛋白固定化技术制备的具有纳米级直径的蛋白A包被磁珠为原料，具有数倍于一般蛋白A磁珠产品的抗体结合效率，每毫克磁珠抗体结合量高达250μg，使磁珠纯化技术的大规模使用更经济更高效。

附图说明

图1是利用反应容器外部的磁场进行磁珠固液分离的示意图。

图2是利用反应容器内部的磁场进行磁珠固液分离的示意图。

图3是实施例1的纯化方法中各步骤产物的SDS-PAGE检测结果图；其中，human IgG-人源IgG标准品对照，S-纯化前的人血清，F-纯化后的人血清，W1、W2-磁珠与人血清反应后的两次洗涤上清，E1-洗脱产物。

图4是实施例1磁珠纯化产物的western blot验证结果图，左图为SDS-PAGE电泳图，右图为对应的Western blot荧光显色图；其中，M-蛋白质标准分子量，1-人血清样品，2~5-磁珠从人血清中纯化的洗脱产物，6-人源IgG标准品。

图5是实施例2中两种纯化方法得到的人IgG1的SDS-PAGE检测结果图；其中，M-蛋白标准分子量，1~2-SL-PA磁珠纯化产物，3-亲和层析纯化产物。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

利用SL-PA磁珠从人血清中提取人源IgG，包括以下步骤：

SL-PA磁珠制备方法见中国专利申请《一种利用SLP将功能蛋白定向固定的方法》（专利申请号：201210107107.7）实施例1。

（1）取SL-PA磁珠100mg，加入5ml离心管中，再加入5ml洗涤缓冲液（pH值7.5，含有50mM磷酸缓冲液和150mM NaCl；下同），振荡重悬，放置于磁性分离器上2min，待固液分离后吸去上清液。重复此步骤一次；

（2）将洗涤后的磁珠与3ml人血清（购自广州蕊特生物科技有限公司）（即纯化前的人血清S）混合均匀，室温孵育10min，期间不时震荡以保持磁珠与血清的均匀混合；

（3）将离心管放置于磁性分离器上2min，待固液分离后吸去上清液(F)；

（4）加入5ml洗涤缓冲液，振荡重悬，放置于磁性分离器上2min，待固液分离后吸去上清液(W1)。重复此步骤2次(第二次洗涤上清液为W2)；

（5）加入3ml洗脱缓冲液（含有0.1M甘氨酸，pH值2.5），混合均匀，室温孵育10min，期间不时震荡以保持磁珠与溶液的均匀混合；

（6）将离心管放置于磁性分离器上2min，待固液分离后收集上清液，此上清液为含有人IgG的纯化产物。上清液中马上加入100μl 1M Tris溶液（pH 8.0）调节溶液pH值至中性，即为洗脱产物E1；

（7）将步骤（6）的纯化产物用超纯水进行透析或超滤，收集透析或超滤产物，用真空冷冻干燥机制成冻干粉。纯化产物可用于进一步精细纯化操作。

人源IgG的纯化效果：

（1）磁珠纯化各步骤产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见如图3。

从图3可以看出，SL-PA磁珠从人血清中的纯化产物电泳条带（E1）与人源IgG标准品的电泳条带一致，纯度与标准品一致。通过测定280nm处光吸收值计算洗脱产物中人IgG总量为23.14mg，即每毫克磁珠结合人IgG的量为231.4μg。整个纯化流程耗时少于40min，样品血清无需进行稀释及过滤，纯化操作无需层析系统。

而采用传统的抗体亲和层析法处理相同体积的血清样品，需要将血清原液稀释5~10倍，经过0.22μm孔径滤膜过滤，由层析系统将样品加压，使样品流入蛋白A亲和纯化层析柱，样品中的人IgG与蛋白A配基结合，然后再经过冲洗层析柱去除未结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液将结合在层析柱上的抗体洗脱而得到纯化后的抗体，全过程耗时超过3小时，需要昂贵的层析系统及过滤装置。

（2）纯化产物的验证：以小鼠抗人IgG单克隆单体（购自美国ABcam公司）为一抗，以羊抗小鼠IgG-HRP（购自武汉博士德公司）为二抗，进行蛋白质免疫印迹检测（Western blot），验证SL-PA磁珠纯化产物是否为人IgG，结果如图4。

从图4可以看出，磁珠从人血清中纯化的洗脱产物与人源IgG标准品具有相同的免疫印迹显色结果，证明此纯化产物为人源IgG。

（3）纯化产物中蛋白A残留量测定

取SL-PA磁珠从人血清中纯化的人IgG产物，并以蛋白A亲和纯化层析柱（HiTrap MabSelect 1ml；美国GE lifesciences公司）从人血清中纯化的人IgG产物为对照组，用蛋白AELISA检测试剂盒（ProteinAELISAKit，美国RepliGen公司）检测产物中蛋白A残留量。结果如下表：

纯化方式	蛋白A含量（ppm）
		SL-PA磁珠纯化法	12.4
蛋白A亲和层析法	16.7

美国GE公司的HiTrap MabSelect蛋白A亲和层析柱是现在公认的具有最低蛋白A脱落率的层析介质，在抗体纯化工业中具有最广泛的应用。经酶联免疫测试，SL-PA磁珠的纯化产物具有比HiTrap MabSelect更低的蛋白A残留量，符合美国食品及药品监督管理局（FDA）关于抗体药物中蛋白A残留量的限制值（<20ppm）。

实施例2

从CHO细胞表达上清液中提取人源IgG1单克隆抗体，包括以下步骤：

取含有人源IgG1基因的重组CHO细胞表达系（购自广州源生医药科技有限公司），经过无血清悬浮培养，重组CHO细胞系表达人源IgG1并分泌到培养上清液中，表达量为1.15mg/ml。取未经过滤的培养液20ml，与100mg SL-PA磁珠混合，纯化步骤同实施例1步骤1~7。

结果：从重组CHO细胞培养上清液中成功提取21.62mg人IgG1，纯化得率为96%，产物纯度为94%，纯化操作耗时37分钟。

使用抗体亲和层析法对相同体积相同样品进行纯化操作（层析系统：AKTApurifer 10，美国GE lifescience公司；蛋白A亲和纯化柱：HiTrap MabSelect，1ml，美国GE lifesciences公司）。培养液样品经离心，取上清液，再经过0.22μm膜过滤一次。过滤后样品经层析系统纯化，得人IgG119.75mg，纯化得率为86%，产物纯度为95%，纯化操作耗时3小时。

两种纯化方法得到的人IgG1聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱见图5。

实施例3

从CHO细胞混合液中提取利妥昔（Rituximab）单抗，包括以下步骤：

取利妥昔单抗（购自美国罗氏制药）20mg，与20ml CHO细胞培养液混合，得到含有利妥昔单抗的CHO细胞混合液。使用100mg SL-PA磁珠从此混合液中提取利妥昔单抗，步骤同实施例1步骤1~7。结果，从混合液中成功提取19.49mg利妥昔单抗，纯化得率为97.45%，纯度95%。

实施例4

从CHO细胞混合液中提取阿达木（Adalimumab）单抗，包括以下步骤：

取利妥昔单抗（购自德国Vetter Pharma-Fertigung GmbH＆Co.KG）20mg，与20ml CHO细胞培养液混合，得到含有阿达木单抗的CHO细胞混合液。使用100mg SL-PA磁珠从此混合液中提取阿达木单抗，步骤同实施例1步骤1~7。结果，从混合液中成功提取18.59mg阿达木单抗，纯化得率为93%，纯度94%。

实施例5

从CHO细胞混合液中提取英夫利西（Infliximab）单抗，包括以下步骤：

取英夫利西单抗（购自美国强生公司）20mg，与20ml CHO细胞培养液混合，得到含有英夫利西单抗的CHO细胞混合液。使用100mg SL-PA磁珠从此混合液中提取英夫利西单抗，步骤同实施例1步骤1~7。结果，从混合液中成功提取19.02mg英夫利西单抗，纯化得率为95.1%，纯度92%。

实施例6

从CHO细胞混合液中提取西妥昔（Cetuximab）单抗，包括以下步骤：

取西妥昔单抗（购自德国默克里昂制药公司）20mg，与20ml CHO细胞培养液混合，得到含有西妥昔单抗的CHO细胞混合液。使用100mg SL-PA磁珠从此混合液中提取西妥昔单抗，步骤同实施例1步骤1~7。结果，从混合液中成功提取19.65mg西妥昔单抗，纯化得率为98.25%，纯度97%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗体的表达产物加入到反应容器中，搅匀，室温下孵育5~15min；

（2）在反应容器外部或内部施加磁场；

（3）从反应容器中转移出上清液；

（4）将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场；重复步骤（2）~（3）一次；

（5）重复步骤（4）洗涤磁珠2~4次；

（6）将洗脱缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，室温下孵育5~15min；

（7）施加磁场使磁珠贴壁，转移反应容器中的溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体；

步骤（4）所述的洗涤缓冲液含有0.01~0.5M的磷酸缓冲液、1~500mM的NaCl，余量为水，pH值6~9；

步骤（6）所述的洗脱缓冲液含有0.01~4M的氨基酸，pH值1.9~5。

2.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于：步骤（6）所述的洗脱缓冲液所含的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种以上。

3.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于：步骤（1）所述的含有抗体的表达产物是血清、细胞表达液或腹水。

4.根据权利要求1所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于：步骤（2）和（7）所述的施加磁场，其磁通量为1000~10000高斯，作用时间为1-5min。

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