CN108085358A - 一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法 - Google Patents

一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b‑Fab片段的制备方法，包括以下步骤：1、采用木瓜蛋白酶酶解单克隆抗体IgG2b后，透析、离心，得上清液；2、分别将琼脂糖‑Protein G和琼脂糖‑Protein L装入层析柱，用结合Buffer进行平衡；3、将上清液泵入琼脂糖‑Protein G层析柱中，收集流出液；用洗杂Buffer清洗，再用洗脱Buffer洗脱，收集洗脱液A，即Fc片段；4、将流出液泵入琼脂糖‑Protein L层析柱中，用洗杂Buffer清洗，再用洗脱Buffer洗脱，收集洗脱液B，即IgG2b‑Fab片段。本发明操作简单易控，重复性强、获得的Fab片段纯度高。

Description

一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法
技术领域
本发明属于抗体的制备领域，具体涉及一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法。
背景技术
临床治疗犬细小病毒病采用最多的药剂为单克隆抗体，由于单克隆抗体特异性极强，可到达病毒侵染的组织和细胞而中和病毒，达到治愈的目的，是目前世界上用于治疗和预防犬细小病毒效果较好的生物制剂。采用的犬细小病毒单克隆抗体IgG分子上，Fab片段是与抗原结合的部位，可以中和病毒；Fc片段是IgG与效应分子或者细胞相互作用的部位。由于通常采用的单克隆抗体是鼠源性IgG，病犬反复或者长期使用，IgG中Fc片段的鼠源成分会使犬的机体创造出的一种新型抗体，从而不利于犬细小病毒单克隆抗体的治疗；而Fab片段不仅能够保证抗体和抗原结合的特性，避免了机体产生新型抗体的可能性，此外，还由于Fab片段中不存在Fc段，且Fab片段的分子量较小，可以更快的到达病毒侵染的组织和细胞而中和病毒，达到快速治愈的目的。因此，消化IgG，获得纯化的Fab片段成为避免新型抗体产生的关键。
而目前，纯化IgG-Fc片段和IgG-Fab片段的主要技术手段是离子交换法，此种方法缺点较多，比如纯化的片段纯度不高，有残存的木瓜蛋白酶和IgG-Fc片段污染，对于临床治疗患犬细小病毒的病犬带来麻烦，且相互有污染，步骤麻烦，不易操作，重复性差，抗体片段损失较多等。因此，需要研发一种操作简单易控，重复性强、且可获得高纯度的Fab片段的犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其操作简单易控，重复性强、且可获得高纯度的Fab片段。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用木瓜蛋白酶酶解犬细小病毒单克隆抗体IgG2b后，装入截留分子量小于10KD的透析袋中，于结合Buffer中进行透析，然后将酶解液于4℃12000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液；
所述酶解用酶解体系为：10mg/mL犬细小病毒单克隆抗体IgG2b，0.5mg/ml木瓜蛋白酶，10mmol/L-半胱氨酸，2mmol/L EDTA，去离子水定容，pH7.6；酶解时间4h；
步骤二：将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱中，分别用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，得琼脂糖-Protein G层析柱和琼脂糖-Protein L层析柱，备用；
步骤三、将步骤一所得的上清液泵入琼脂糖-Protein G层析柱中，收集流出液；然后用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fc片段，收集洗脱液A，即Fc片段；
步骤四、将步骤三收集的流出液泵入琼脂糖-Protein L层析柱中，然后10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fab片段，收集洗脱液B，即IgG2b-Fab片段。
进一步的，步骤一和步骤二中所述结合Buffer为：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH7.0；
步骤三和步骤四中所述洗杂Buffer为：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 7.0；
步骤三和步骤四中所述洗脱Buffer为：0.1M甘氨酸，pH 3.0。
进一步的，步骤二中将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱时，琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L的装入高度均小于等于15cm。
进一步的，还包括步骤五、按洗脱液B与中和液体积比5：1,向步骤四收集的洗脱液B中加入中和液，使洗脱液B的PH为7，储藏，备用。
更进一步的，步骤五所述中和液为：1M Tris-HCl，pH8.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用木瓜蛋白酶消化犬细小病毒单克隆抗体的亚型IgG2b的方法来制备Fab片段，方法简便易操作。
2、本发明使用的Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶纯化出的犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段，其中Protein G是一种从G型链球菌属分离得到的细胞壁蛋白，Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，Protein G特异性的和抗体的Fc片段结合，Protein L特异性的和抗体的Fab片段结合，由于是特异性的吸附抗体片段，所以纯化的IgG2b-Fab片段纯度较高，为以后临床治疗病犬带来了方便；此外，用Protein G和Protein L亲和吸附抗体片段时，片段回收率较高，避免了离子交换法的损失。
3、本发明层析用填料是将Protein G和Protein L共价耦合到琼脂糖介质上所得的琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L，这种共价耦合结合方式极大的保证了亲和介质的稳定性和结合特性，使其片段回收率较高。
4、本发明的纯化方法比较简单，纯化步骤容易控制，各种缓冲溶液的配置比较简单，避免了离子交换法的线性梯度洗脱的繁琐步骤。
5、本发明采用层析柱纯化IgG2b-Fab片段，纯化片段的回收率较高，理论上讲，只要填料Protein G和Protein L不超载，所有的片段都能够被分别吸附，节约了成本。
附图说明
图1为纯化后IgG2b-Fab片段的SDS-PAGE电泳图；
其中，泳道1为纯化的IgG2b-Fab片段；泳道2为蛋白Marker(即蛋白标记物)；
图2为纯化后IgG2b-Fab片段的ELISA检测结果；
其中，1为1号区，加入的酶标抗体是羊抗大鼠IgG-HRP；2为2号区，加入的酶标抗体是羊抗人IgG-HRP；3为3号区，加入的酶标抗体是羊抗小鼠IgG(Fab)-HRP；4为4号区，加入的酶标抗体是羊抗兔IgG-HRP。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
本发明中，
结合Buffer(结合缓冲溶液)的配制方法为:称取8.775g NaCl，2.839g Na2HPO4，用去离子水溶解，用HCl调pH至7.0；定容至1L。
洗杂Buffer(洗杂缓冲溶液)的配制方法为:称取8.775g NaCl，2.839g Na2HPO4，用去离子水溶解，用HCl调pH至7.0；定容至1L。
洗脱Buffer(洗脱缓冲溶液)的配制方法为:称取7.507g甘氨酸，用去离子水溶解，用HCl调pH至3.0，定容至1L。
中和液的配制方法为：称取121.14g Tris(又名：三(羟甲基)氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷)，用去离子水溶解，用HCl调pH至8.5，定容至1L。
所述酶解体系的具体的配置方法：取100mL的烧杯，用去离子水清洗干净，加入0.5mol/L的EDTA 0.4mL,加入L-半胱氨酸0.2253g，加入木瓜蛋白酶50mg，加入犬细小病毒单克隆抗体IgG2b 1g，用去离子水定容至100mL,最后用1mol/L的氢氧化钠或者1mol/L的盐酸调PH7.6。
琼脂糖-Protein G：购自北京索莱宝生物科技有限公司。
琼脂糖-Protein L：购自北京索莱宝生物科技有限公司。
实施例1
一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用木瓜蛋白酶酶解犬细小病毒单克隆抗体IgG2b后，装入截留分子量小于10KD的透析袋中，于结合Buffer中进行透析，然后将酶解液于4℃12000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液；所述结合Buffer为：0.15M NaCL,20mM Na2HPO4,pH 7.0；
所述酶解用酶解体系为：10mg/mL犬细小病毒单克隆抗体IgG2b，0.5mg/mL木瓜蛋白酶，10mmol/L-半胱氨酸，2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，去离子水定容，pH7.6；酶解时间4h；
步骤二：将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱中，分别用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使层析柱的填料处于与步骤一透析后的酶解液处于相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用，得琼脂糖-Protein G层析柱和琼脂糖-Protein L层析柱，备用；其中，将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱时，琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L的装入高度均小于等于15cm，可以防止洗脱抗体时，由于抗体的局部浓度过高而发生变性失活；
步骤三、将步骤一所得的上清液泵入琼脂糖-Protein G层析柱中，收集流出液；然后用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fc片段，收集洗脱液A，即Fc片段；所述洗杂Buffer为：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 7.0；所述洗脱Buffer为：0.1M甘氨酸，pH 3.0；
步骤四、将步骤三收集的流出液泵入琼脂糖-Protein L层析柱中，然后10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗去除非特异性吸附的杂蛋白，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fab片段，收集洗脱液B，即IgG2b-Fab片段；
步骤五、按洗脱液B与中和液体积比5：1,向步骤四收集的洗脱液B中加入中和液，使洗脱液B的PH为7，防止IgG2b-Fab片段在酸性环境下变性，储藏，备用；所述中和液为：1MTris-HCl，pH8.5。
效果例1
采用SDS-PAGE电泳法检测实施例1制得的IgG2b-Fab片段的位置和纯度，结果见图1。
从图1中可以看出：泳道1中仅有IgG2b-Fab片段的条带，无其他杂带，因此，证明制得的IgG2b-Fab片段纯度较高；而由于IgG2b-Fab片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳时已经变性，二硫键打开，所以IgG2b-Fab的位置符合预期。
效果例2
对实施例1制得的IgG2b-Fab片段进行ELISA检测，结果见图2；
ELISA检测的操作方法为：首先将实施例1制得的纯化IgG2b-Fab片段按照1μg/m了的浓度包被酶标板，再分别加入不同稀释度的四种HRP标记抗体；左上四个孔即1号区加入的酶标抗体是羊抗大鼠IgG-HRP，左下四个孔即2号区加入的酶标抗体是羊抗人IgG-HRP，右上四个孔即3号区加入的酶标抗体是羊抗小鼠IgG-HRP，右下四个孔即4号区加入的酶标抗体是羊抗兔IgG-HRP，反应后洗去没有结合的标记抗体，加TMB显色，颜色变蓝，即为阳性；颜色无变化，为阴性。
从图2中可以看出：只有右上四个孔即3号区反应结果为阳性，说明包被的物质是小鼠IgG，或者是小鼠IgG的一部分。
因此，效果例2的结果结合效果例1中图1的结果，可以判断本发明的方法可靠，可以推广应用。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (5)

1.一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用木瓜蛋白酶酶解犬细小病毒单克隆抗体IgG2b后，装入截留分子量小于10KD的透析袋中，于结合Buffer中进行透析，然后将酶解液于4℃12000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液；
所述酶解用酶解体系为：10mg/mL犬细小病毒单克隆抗体IgG2b，0.5mg/ml木瓜蛋白酶，10mmol/L-半胱氨酸，2mmol/L EDTA，去离子水定容，pH7.6；酶解时间4h；
步骤二：将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱中，分别用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，得琼脂糖-Protein G层析柱和琼脂糖-Protein L层析柱，备用；
步骤三、将步骤一所得的上清液泵入琼脂糖-Protein G层析柱中，收集流出液；然后用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fc片段，收集洗脱液A，即Fc片段；
步骤四、将步骤三收集的流出液泵入琼脂糖-Protein L层析柱中，然后10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fab片段，收集洗脱液B，即IgG2b-Fab片段。
2.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其特征在于，
步骤一和步骤二中所述结合Buffer为：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 7.0；
步骤三和步骤四中所述洗杂Buffer为：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 7.0；
步骤三和步骤四中所述洗脱Buffer为：0.1M甘氨酸，pH 3.0。
3.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其特征在于，步骤二中将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱时，琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L的装入高度均小于等于15cm。
4.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其特征在于，还包括步骤五、按洗脱液B与中和液体积比5：1，向步骤四收集的洗脱液B中，加入中和液，使洗脱液B的PH为7，储藏，备用。
5.根据权利要求4所述的一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其特征在于，步骤五所述中和液为：1M Tris-HCl，pH8.5。
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