CN105842454A

CN105842454A - 一种赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN105842454A
Application number: CN201510016963.5A
Authority: CN
Inventors: 张彦明; 柳家鹏
Original assignee: Konald Biotechnology Co
Current assignee: Konald Biotechnology Co
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明涉及一种赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途，该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶联到磁珠上，然后用抗赭曲霉毒素的抗体与磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶联，然后再利用交联剂对结合赭曲霉毒素抗体的蛋白G/蛋白A磁珠进行交联，该免疫制备方法充分利用了蛋白G与蛋白A与抗体亲和力高以及与抗体的Fc片段特异性结合的特点。主要用于对于粮食、食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的赭曲霉毒素的结合和纯化，可以用于赭曲霉毒素检测前样品前期处理，样品中赭曲霉毒素检测以及赭曲霉毒素纯化。

Description

一种赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种赭曲霉毒素的定向免疫磁珠及其制备方法和用途，属于赭曲霉毒素的纯化与检测领域。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)简称OTA，是曲霉属和青霉属的一些菌种的有毒代谢产物，属真菌毒素之一。自然界中产生赭曲霉毒素A的真菌种类繁多，但以纯绿青霉( Penicillium verrucosum) 、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和碳黑曲霉(A. carbonarius)三种菌为主，其中赭曲霉是稻谷感染的常见菌。赭曲霉毒素能引起肾脏的严重病变、肝脏的急性功能障碍、脂肪变性、透明变性及局部性坏死，而且还有致畸性、致突变性、免疫抑制和致癌性。1993年国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。赭曲霉毒素广泛的存在于谷类、大豆、绿豆、花生、香料、干果、动物肾脏、血液、咖啡、牛奶、白酒、啤酒、葡萄酒、巧克力、奶制品和调味品中。赭曲霉毒素A的测定已经引起广泛的关注。

目前赭曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测赭曲霉毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，主观影响较大，灵敏度不高等，已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用，因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法( HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，其中的抗原与抗体结合，其他杂质则通过水溶液洗掉，再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来，从而使样品中的毒素得以净化。

由于检测原理的不同，高效液相色谱法对样本的处理要求高。对于目前常用的样本前处理方法主要是通常的做法都是先将待检样本通过粉碎，过滤等步骤后，利用免疫亲和柱对样本进行赭曲霉毒素的免疫亲和净化。然后将洗脱产物进行高效液相色谱检测。由于待检样本比较复杂，尽管前期经过了过滤等步骤，但是在用免疫亲和柱的时候还是会发生亲和柱堵塞的现象。亲和柱堵塞会降低毒素结合力，减缓反应溶液的通过率，进而影响亲和柱的纯化效率。此外，由于免疫亲和柱自身的特点，会造成类似于塔板效应，位于亲和柱顶部的凝胶与赭曲霉毒素结合更多，而越到亲和柱底部，毒素结合越少。导致亲和柱底部的凝胶往往不能有效的结合样本中的赭曲霉毒素。

如果利用赭曲霉毒素的定向免疫磁珠对样本中的赭曲霉毒素进行纯化，对样本的要求就会放宽，只需要将粉碎后的样本在一定的溶液中与磁珠混合，磁珠上面的抗体就可以将样本中的赭曲霉毒素吸附，磁珠利用磁性原理贴壁后，将其余的部分去除。然后再将结合在定向免疫磁珠上面的赭曲霉毒素洗脱下来。不但操作简单，而且还可以对样本中的赭曲霉毒素进行富集。可以检测低含量的样本。此外，由于完全在液相条件下进行赭曲霉毒素纯化，每个磁珠对于毒素的结合能力都是相同的。

目前市场上常见的定向免疫磁珠都是将抗体直接偶联到磁珠表面，但是由于抗体分子较大，偶联不受控制，抗体可能以任何方向偶联到磁珠上。某些抗体偶联方向会导致在抗原分子结合时由于空间位阻的原因无法结合，更有些情况下，抗体的抗原结合区域偶联到磁珠上导致这一抗原结合区域被封闭掉。由于赭曲霉毒素分子很小，携带的抗原表位只有1-2个，一个抗原结合区域的封闭就可能导致这一分子的抗体失去抗原结合能力。因而会影响到整个定向免疫磁珠的抗原结合效率。利用蛋白A或者蛋白G能够特异性结合抗体恒定区（Fc区）的特点，通过蛋白A或者蛋白G将抗体固定在磁珠表面，抗体的抗原结合区域（Fab区）全部暴露在外，大大增加了定向免疫磁珠的抗原结合能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途，为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G或者蛋白A的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。蛋白A是葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，与蛋白G类似。蛋白A也具有抗体结合能力，也是通过抗体的Fc区域与抗体结合。微生物来源的蛋白G和蛋白A这一特性与其多年来进化获得的宿主逃避和自我保护能力密切相关。我们克隆了野生蛋白G和蛋白A的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G和蛋白A。将基因重组的蛋白G或蛋白A偶联到磁珠上后，再将赭曲霉毒素抗体偶联到蛋白G或蛋白A上，制备出了赭曲霉毒素—蛋白G/蛋白A—磁珠，再用交联剂将载体进行交联。就形成了高亲和力的赭曲霉毒素定向免疫磁珠。该磁珠操作简便，纯化赭曲霉毒素效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的赭曲霉毒素。用于高效液相色谱检测。

本发明利用了蛋白G与蛋白A与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。与蛋白G类似，蛋白A是葡萄球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白A与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白A，1个分子的蛋白G可以结合6个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。以此蛋白G或者蛋白A为基础制备的定向免疫磁珠具有特异性好，赭曲霉毒素结合量大，纯化效率高的特点。

赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制备方法说明如下：

1.将磁珠用含0.01% SDS 的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。

2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）至终浓度5-20mg/ml，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sulfo-NHS）至终浓度10-25mg/ml。

3.室温反应15-60分钟。

4.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mM PH6.0的MES缓冲液中。

5.将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1。

6.室温反应2-4小时。

7.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次。

8.反应后的磁珠用1M的乙醇胺室温封闭。

9.磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4 洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中。

10.在磁珠中加入抗赭曲霉毒素抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1。

11.将加入抗体的磁珠在37℃反应10-40分钟。

12.磁珠用0.1 M 硼酸缓冲液 PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在1M PH9.0的硼酸缓冲液中。

13.将赭曲霉毒素抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯（DMP），PH8.3，室温反应1-2小时。

14.用50mM PH9.0 的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4 洗涤赭曲霉毒素抗体—蛋白G/蛋白A —磁珠3次。

15.将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4中。放于4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.充分的利用了蛋白G与蛋白A与IgG抗体特异性结合的特性，使抗体通过蛋白G/蛋白A偶联到载体上。并且IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了赭曲霉毒素的捕捉能力，赭曲霉毒素的纯化效率也得到有效提高。

2.本发明使用了基因改造后的蛋白G和蛋白A，通过对密码子的优化和IgG结合域基因的优化。使蛋白G和蛋白A的抗体结合能力大幅度提高，进而提高了赭曲霉毒素的纯化效率。

3.使用本发明纯化赭曲霉毒素操作简便，几步就可以得到纯度较高的赭曲霉毒素。更方便操作者使用。

4.使用本发明得到的赭曲霉毒素纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1、蛋白G偶联的赭曲霉毒素定向免疫磁珠结构示意图。

图2、瓜拉纳果粉中OTA含量检测HPLC图谱。

图3、欧芹样本中OTA含量检测HPLC图谱。

图中A：磁珠，B：蛋白G，C：赭曲霉毒素抗体。

实施例

实施例1：利用基因重组蛋白G制备赭曲霉毒素定向免疫磁珠

本发明制备赭曲霉毒素定向免疫磁珠的一个优选的实施方案如下：

1.磁珠活化

取5mg羧基修饰的纳米磁珠，用含0.01% SDS 的50mM PH6.0 MES缓冲液洗涤3次，然后将磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。

2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）100mg，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sulfo-NHS）100mg，室温反应15分钟。

3.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次，然后重悬在5ml 50mM PH6.0的MES缓冲液中。

4.在磁珠中加入20mg蛋白G，室温反应4小时。

5.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次。

6.反应后的磁珠用20ml 1M的乙醇胺室温封闭2小时。

7.磁珠用50ml 20mM PBS缓冲液PH7.4 洗涤3次，然后重悬在5ml 20mM PBS PH7.4缓冲液中。

8.在磁珠中加入200mg抗赭曲霉毒素抗体，将加入抗体的磁珠在37℃反应30分钟.

10.磁珠用0.1 M 硼酸缓冲液 PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在5ml 0.1 M 硼PH9.0的硼酸缓冲液中。

11.称取26mg二甲基庚二酸酯（DMP）加入含赭曲霉毒素抗体—蛋白G—磁珠的PBS缓冲液中，然后加入100ul 2M的三乙醇胺至调PH8.3. 室温反应1小时。

12.用25ml 50mM PH9.0 的乙醇胺终止反应。

13.用含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4 洗涤赭曲霉毒素抗体—蛋白G —磁珠3次。然后将磁珠重悬在5ml的该缓冲液中，放于4℃保存。

实施例2：利用基因重组蛋白A制备赭曲霉毒素定向免疫磁珠

1.磁珠活化。

2.取5mg羧基修饰的纳米磁珠，用含0.01% SDS 的50mM PH6.0 MES缓冲液洗涤3次，然后将磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。

3.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）100mg，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sulfo-NHS）100mg，室温反应20分钟。

4.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次，然后重悬在5ml 50mM PH6.0的MES缓冲液中。

5.在磁珠中加入30mg蛋白A，室温反应4小时。

6.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次。

7.反应后的磁珠用20ml 1M的乙醇胺室温封闭2小时。

8.磁珠用50ml 20mM PBS缓冲液PH7.4 洗涤3次，然后重悬在5ml 20mM PBS PH7.4缓冲液中。

9.在磁珠中加入300mg抗赭曲霉毒素抗体，将加入抗体的磁珠在37℃反应30分钟。

10.磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4 洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中。

11.磁珠用0.1 M 硼酸缓冲液 PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在5ml 0.1 M 硼PH9.0的硼酸缓冲液中。

12.称取26mg二甲基庚二酸酯（DMP）加入含赭曲霉毒素抗体—蛋白A—磁珠的PBS缓冲液中，然后加入100ul 2M的三乙醇胺至调PH8.3. 室温反应1小时。

13.用25ml 50mM PH9.0 的乙醇胺终止反应。

14.用含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4 洗涤赭曲霉毒素抗体—蛋白A —磁珠3次，然后将磁珠重悬在5ml的该缓冲液中，放于4℃保存。

实施例3：利用蛋白G偶联的赭曲霉毒素定向免疫磁珠纯化和检测瓜拉纳果粉中的赭曲霉毒素

1.将瓜拉纳果粉样品用钢磨粉碎，过2mm分样筛。

2.取10g过筛粉碎的样品加入50mL 20mM PH7.4 PBS缓冲液溶液混匀。

3.加入1mg/ml蛋白G偶联的黄曲霉素定向免疫磁珠10ml，混匀后室温放置30分钟。

4.将反应后的磁珠混合液放到磁力架上2分钟，待磁珠贴壁。用吸管去掉其余的缓冲液。

5.在磁珠中加入50ml 20mM PH7.4 PBS洗涤磁珠，然后将磁珠放入磁力架中待磁珠贴壁后，用吸管去除缓冲液。

6.重复洗涤步骤3次。

7.在磁珠中加入5ml 0.1M PH3.0的甘氨酸缓冲液，混匀。使磁珠上的赭曲霉毒素洗脱下来。

8.将磁珠放入磁力架中使磁珠贴壁，将洗脱的缓冲液取出到另一试管中，马上加入500ul PH9.0 1M Tris缓冲液，充分混合。

9.洗脱后的缓冲液用高效液相色谱（HPLC）检测其含量。

10.高效液相色谱检测结果如图2所示，根据HPLC检测图谱可以得出该瓜拉纳果粉样本中赭曲霉毒素含量为4.73ppb。

实施例4：利用蛋白A偶联的赭曲霉毒素定向免疫磁珠纯化和检测欧芹中的赭曲霉毒素

将欧芹样品用钢磨粉碎，过2mm分样筛；

1.取10g过筛粉碎的样品加入50mL 100mM PH8.0 Tris缓冲液溶液混匀；

2.加入1mg/ml蛋白A偶联的黄曲霉素定向免疫磁珠10ml，混匀后室温放置30分钟。

3.将反应后的磁珠混合液放到磁力架上2分钟，待磁珠贴壁。用吸管去掉其余的缓冲液。

4.在磁珠中加入50ml 100mM PH8.0 Tris缓冲液洗涤磁珠，然后将磁珠放入磁力架中待磁珠贴壁后，用吸管去除缓冲液。

5.重复洗涤步骤3次。

6.在磁珠中加入5ml 0.1M PH5.0的柠檬酸缓冲液，混匀。使磁珠上的赭曲霉毒素洗脱下来。

7.将磁珠放入磁力架中使磁珠贴壁，将洗脱的缓冲液取出到另一试管中。洗脱后的缓冲液用高效液相色谱（HPLC）检测其含量。

8.高效液相色谱检测结果如图3所示，根据HPLC检测图谱可以得出该欧芹样本中赭曲霉毒素含量为1.72 ppb。

蛋白G基因序列

1 efnkygvsdy yknlinnakt vegvkdlqaq vvesakkari seatdglsdf lksqtpaedt

61 vksielaeak vlanreldky gvsdyhknli nnaktvegvk dlqaqvvesa kkariseatd

121 glsdflksqt paedtvksie laeakvlanr eldkygvsdy yknlinnakt vegvkalide

181 ilaalpktdt yklilngktl kgettteavd aataekvfkq yandngvdge wtyddatktf

241 tvtekpevid aseltpavtt yklvingktl kgettteavd aataekvfkq yandngvdge

301 wtyddatktf tvtekpevid aseltpavtt yklvingktl kgetttkavd aetaekafkq

361 yandngvdgv wtyddatktf tvtemvtevp gdaptepekp easiplvplt patpiakdda

421 kkddtkkeda kkpeakkeda kkaetlpttg egsnpfftaa alavmagaga lavaskrked

GenBank: CAA27638.1

蛋白A 基因序列

1 mkkkkiysir klgvgiasvt lgtllisggv tpaanaaqhd eaqqnafyqv lnmpnlnadq

61 rngfiqslkd dpsqsanvlg eaqklndsqa pkadaqqnkf nkdqqsafye ilnmpnlnee

121 qrngfiqslk ddpsqstnvl geakklnesq apkadnnfnk eqqnafyeil nmpnlneeqr

181 ngfiqslkdd psqsanllae akklndaqap kadnkfnkeq qnafyeilhl pnlteeqrng

241 fiqslkddps vskeilaeak klndaqapke ednnkpgked gnkpgkedgn kpgkednkkp

301 gkedgnkpgk ednkkpgked gnkpgkedgn kpgkedgnkp gkedgnkpgk edgngvhvvk

361 pgdtvndiak angttadkia adnkladknm ikpgqelvvd kkqpanhada nkaqalpetg

421 eenpfigttv fgglslalga allagrpspn yknkqyttid iilskpilty ir

GenBank: AAB05743.1

Claims

1.一种赭曲霉毒素的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠载体、蛋白G或者蛋白A和赭曲霉毒素抗体。

2.根据权利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通过共价键偶联在载体上，然后赭曲霉毒素抗体与蛋白G结合，然后用交联剂交联，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-赭曲霉毒素抗体形式的偶联载体。

3.根据权利要求1中所述的赭曲霉毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重组表达的蛋白G。

4.根据权利要求1中所述的赭曲霉毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重组表达的蛋白A。

5.根据权利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列1表达的蛋白G，以及经过序列优化后表达的蛋白G。

6.根据权利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表达的蛋白A，以及经过序列优化后表达的蛋白A。

7.根据权利要求1中所述的载体，包括纳米磁珠和直径超过1μm的普通磁珠。

8.根据权利要求2中所述的抗赭曲霉毒素抗体，其特征在于包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。

9.一种纯化赭曲霉毒素的定向免疫磁珠制备方法，其特征在于：

1）将磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起；

2）在磁珠中加入EDC至终浓度5-20mg/ml，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺至终浓度10-25mg/ml；

3）室温反应15-60分钟；

4）反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mM PH6.0的MES缓冲液中；

5）将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1；

6）室温反应2-4小时；

7）反应后的磁珠用50mM MES缓冲液 PH6.0洗涤3次；

8）反应后的磁珠用1M的乙醇胺室温封闭；

9）磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4 洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中；

10）在磁珠中加入抗赭曲霉毒素抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1；

11）将加入抗体的磁珠在37℃反应10-40分钟；

12）磁珠用0.1 M 硼酸缓冲液 PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在1M PH9.0的硼酸缓冲液中；

13）将赭曲霉毒素抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯（DMP），PH8.3. 室温反应1-2小时；

14）用50mM PH9.0 的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4 洗涤赭曲霉毒素抗体—蛋白G/蛋白A —磁珠3次；

15）将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的10mMPBS PH7.4中，放于4℃保存。

10.一种赭曲霉毒素的定向免疫磁珠，其用途在于包括蔬菜、水果及果汁制品、粮食、酒类、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中赭曲霉毒素的分离纯化，纯化后的赭曲霉毒素可以用于高效液相色谱及其它方法检测。