CN113480624B - 含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用 - Google Patents

含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质及其应用。其由黄曲霉产毒菌制备获得，黄曲霉产毒菌产黄曲霉毒素预警分子AFT‑YJFZ01，黄曲霉毒素预警分子AFT‑YJFZ01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质通过检测标定其中AFT‑YJFZ01的含量，作为参考物质使用。可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平；稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用。

Description

含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。
对黄曲霉毒素污染产品实施预警是国际通行做法。现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF)利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
已有研究表明，黄曲霉毒素的产毒真菌不同菌株之间产毒力差异很大，从不产毒真菌菌株一直到高产毒力菌株都有分布。以花生中分离的黄曲霉菌株为例，有相当一部分黄曲霉菌株缺失了产毒基因或产毒关键调控基因，它们不具有产生黄曲霉毒素的能力；有约不到20％的黄曲霉菌株为强产毒力菌株。如何在黄曲霉毒素污染事前评估预警风险？这一直是本领域的世界性难题。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子不明是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，构建了我国黄曲霉毒素产毒菌株库、菌株产毒力数据库、强产毒菌株蛋白质抗体库，建立了用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的抗体库方法，发现了黄曲霉毒素的产毒真菌产毒力指示分子，并首次明确其具有黄曲霉毒素污染事前预警功能，因此成为黄曲霉毒素预警分子。研究发现该预警分子发生水平与黄曲霉毒素污染水平之间存在显著的正相关关联性，由此利用此关联性，进一步建立了黄曲霉毒素分子预警方法。然而，在实际应用中我们发现黄曲霉毒素预警分子纯品用作标准物质时存在稳定性较差容易引发检测结果偏离的问题。进一步，我们为了通过准确检测黄曲霉毒素预警分子以实现其预警功能，本发明提供了含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质及其制备方法，并建立了参考物质的标准曲线，用于黄曲霉毒素污染风险预测预警，攻克了上述难题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用，其用于预测预警黄曲霉毒素风险水平，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质，其由黄曲霉产毒菌制备获得，黄曲霉产毒菌产黄曲霉毒素预警分子，黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质通过检测标定其中AFT-YJFZ01的含量，作为参考物质使用。
按上述方案，所述的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质中的AFT-YJFZ01含量通过采用黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZ01的氨基酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现对该预警分子蛋白质的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该黄曲霉毒素预警分子蛋白质有一一对应关系的定量检测，从而达到上述用途，部分序列是指与该黄曲霉毒素预警分子蛋白质有一一对应关系的全序列中的一部分。
按上述方案，所述的黄曲霉产毒菌优选为产毒力经鉴定不小于10μg/kg的黄曲霉产毒菌。可采用经NY/T 2311—2013标准方法进行产毒力测试。
上述含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的制备方法，包括：将黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐处理，并通过检测标定其中预警分子AFT-YJFZ01的含量，得到黄曲霉产毒菌参考物质得到。
按上述方案，上述方法还包括将脱盐后裂解液，再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质，通过检测标定黄曲霉产毒菌裂解液干物质中预警分子AFT-YJFZ01的含量。
黄曲霉产毒菌参考物质的应用：
提供一种测定样品中黄曲霉产毒菌参考物质含量的方法，以黄曲霉产毒菌参考物质建立标准曲线，测定样品中黄曲霉产毒菌参考物质含量，进一步地，结合黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的黄曲霉毒素预警分子标定含量，用于黄曲霉产毒菌产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量的检测。
按上述方案，上述应用包括：标定黄曲霉产毒菌参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量；建立标准曲线，测定样品中黄曲霉产毒菌参考物质含量。
按上述方案，上述标定黄曲霉产毒菌参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量为通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液或者上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量，具体的过程为：
a制备黄曲霉产毒菌参考物质溶液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度；
用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，得到黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的浓度，标定黄曲霉产毒菌参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量。
按上述方案，其使用的检测方法为为：间接非竞争双抗体夹心ELISA法，荧光免疫层析法或其他可以达到检测目的的方法。
所述非竞争双抗体夹心ELISA法为：
a制备待测样品待测液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度；
以系列浓度的黄曲霉产毒菌参考物质替换待测液，用于制作标准曲线，用于计算得到待测样品中黄曲霉产毒菌参考物质的含量。计算得到待测样品中黄曲霉产毒菌参考物质的含量，可结合黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的黄曲霉毒素预警分子标定含量，得到样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量，预测预警黄曲霉毒素污染风险水平。
所述的荧光免疫层析法为：
提供黄曲霉毒素风险预警智能感知卡，包括黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
制备待测样品待测液，用上述黄曲霉毒素风险预警智能感知卡测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量，具体方法为：样品垫上装载有信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体时，将待测样品待测液加到黄曲霉毒素风险预警智能感知卡的样品垫上，反应一段时间，读取分析结果；
样品垫上没有装载信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，将待测样品待测液加到信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体中，然后将黄曲霉毒素风险预警智能感知卡插入待测样品待测液中，反应一段时间，读取分析结果。
按上述方案，所述的信号材料是指常规的铕乳胶微球、金纳米颗粒以及其他可达到类似效果的标记材料，均可通过商业购买获得。
按上述方案，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，是指信号材料通过常规标记方法与黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体发生偶联以后的产物。
所述的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体为免疫试纸条常规材料，均可通过商业购买获得。
上述待鉴别样品液的制备：待鉴别样品培养，获得待鉴别样品的待测液；具体可为：称量待鉴别样品，转移至无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品稀释液，取10-1000μL样品稀释液加在含6-600mL常规沙氏液体培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
所述的产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌可以为公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17以及3.4408黄曲霉菌标准菌株，也可采用其他产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌株，均可达到类似功效。
按上述方案，所述的样品可以为农田土壤、农产品、饲料等。将样品粉碎后转移至水或样品稀释液中，常规方法匀浆后静置，取上清即可制成待测样品待测液。
所述的样品稀释液可为含有0.1％山梨醇和绵糖的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5g、NaCL 4.0g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCL 0.1g、KH2PO4 0.1g，加入去离子水定容至500mL。
所述的预测预警黄曲霉毒素污染风险水平，是指测定实际样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01或含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的含量，其浓度越高，则说明黄曲霉毒素污染风险越高。
本发明有益效果在于：
1.可用于建立检测黄曲霉毒素预警分子以及检测含有黄曲霉毒素预警分子的产毒黄曲霉菌的标准曲线。
2.可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平。
3.稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
附图说明
图1为利用含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质建立黄曲霉毒素风险预警标准曲线。
具体实施方式
实施例1黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZ01，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZ01的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZ01的量最少。
所述的免疫亲和方法，是利用黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体，通过常规方法制备成免疫亲和柱，再利用免疫亲和方法从黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液中富集纯化，去离子水溶解获得。上述免疫亲和柱是指利用黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01抗体通过常规的亲和柱制备方案制备获得。具体可用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01水溶液。
黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZ01的初始获得用发掘方法：
用于发掘黄曲霉菌株产毒力预警分子的方法如下：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力预警分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力预警分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力预警分子。
上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
上述黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01抗体也可以在获知黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01全部序列后，利用其全部肽段或部分肽段通过常规的抗体制备技术流程制备获得。
实施例2黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01纳米抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，按照专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZ01和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZ01的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZ01单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点AFT-YJFZ01单克隆抗体。
实施例4黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体。
实施例5含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的标定
将上述黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度AFT-YJFZ01溶液(浓度为0.000003、0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、30ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并基于标准曲线计算黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量结果。
实施例6含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的制备
制备方法流程包括：将产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐，然后再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质。最后通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液或者上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量，即可获得含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质溶液或者固体的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质。
所述的产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌可以为公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17以及3.4408黄曲霉菌标准菌株，也可采用其他产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌株，均可达到类似功效。
如下以3.4408黄曲霉菌标准菌株为例，阐述含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的制备过程，具体如下：
(1)将黄曲霉菌标准菌株接种于PDA固体培养基上进行活化，28℃温箱内恒温黑暗培养7天后取出，用灭菌的0.1％的吐温水冲洗孢子得到孢子悬浮液，将孢子液加至察氏培养基培养基中，使其终浓度为5×105cfu/mL，继续放置在摇床中培养5d后，用灭菌滤纸过滤收集菌丝；
(2)用液氮充分研磨上述收集的菌丝至粉末状，将菌丝粉末溶解于常规磷酸盐缓冲液中，随后用高压均质仪充分裂解黄曲霉菌菌丝，裂解过程中要保持低温状态，即可获得黄曲霉产毒菌裂解液；
(3)上述裂解液经过常规的脱盐处理，然后再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质；
(4)最后通过实施例5建立的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液和上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量，结果为：上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量为0.16ng/μg，由此获得了含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质溶液或者固体的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质。
所述的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法，可以为实施例5的ELISA法，也可以为荧光免疫层析法及其他可以定量测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的方法，均可以达到类似功效。
实施例7黄曲霉毒素风险预警智能感知卡制备
黄曲霉毒素风险预警智能感知卡由黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体通过常规的免疫试纸条搭建方式组装而成，即底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，其中不同之处在于核心试剂的装载：
(1)所述的硝酸纤维素膜的检测线上固定有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，固定方法为：采用常规点膜仪喷涂，喷涂黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体的浓度为1mg/mL，喷涂速度为0.6μL/cm；质控线上固定有羊抗兔抗体，固定方法为：采用常规点膜仪喷涂，喷涂羊抗兔抗体浓度为0.5mg/mL，喷涂速度为0.6mL/cm。
(2)所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载在常规的小孔、小瓶等器皿中，通过常规冷冻干燥处理后即可。
如下以常规铕乳胶微球为例，说明所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体制备方法：取100μL铕乳胶微球，于900μL pH 6.0的MES溶液涡旋混匀，置于超声波细胞破碎仪中，功率20％，超声9s，11000rpm离心10min，小心弃上清，沉淀中加入1mL硼酸缓冲溶液(pH 8.2)重悬，涡旋混匀后再重复超声9s，加入20μL现配15mg/mL的碳二亚胺水溶液活化，室温剧烈震荡15min，11000rpm离心10min，小心弃去上清液，沉淀中加入1mL硼酸缓冲溶液重悬，涡旋混匀后再超声9s，加入60μg黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，10℃摇床震荡2h，11000rpm离心10min，沉淀物用1mL 0.1％牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液复溶，重复超声步骤，4℃下摇床震荡1h，使牛血清白蛋白封闭微球表面未结合的位点；反应完成后即可获得所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，置于4℃保存备用。使用时，采用含有1％蔗糖、0.5％卵清蛋白、2.5％吐温-20、0.5％ PVPK30的常规磷酸盐缓冲液将上述制备获得的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体稀释1000倍再使用。
(3)与上述(2)方案相互呼应的是：所述的硝酸纤维素膜质控线上固定有羊抗兔抗体。
实施例7利用含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质建立黄曲霉毒素风险预警标准曲线
以上述铕乳胶微球最终制备成的黄曲霉毒素风险预警智能感知卡为例，阐述利用含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质建立黄曲霉毒素风险预警标准曲线过程。
采用实施例6制备的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质，用常规磷酸盐缓冲液配置成0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/mL等系列浓度的溶液，然后依次用其溶解黄曲霉毒素风险预警智能感知卡的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，再通过常规的免疫层析反应15min，最后通过读取黄曲霉毒素风险预警智能感知卡上荧光信号，以荧光信号作纵坐标，以黄曲霉产毒菌参考物质作横坐标绘制标准曲线见附图1，结果表明，黄曲霉毒素风险预警智能感知卡快速定量测定黄曲霉产毒菌参考物质的含量，其检测限可达1.0μg/mL，相关系数达0.99。再采用常规方法评价黄曲霉毒素风险预警智能感知卡快速测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的重复性和准确度，重复性评价结果显示：测定结果的变异系数均在10％以下，表明方法测定结果重复性良好；准确度评价结果表明，向花生、玉米、大米等产品中添加实施例1制备的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01，回收率范围为83％-107％，表明方法测定结果准确度良好。因此，快速定量测定AFT-YJFZ01的黄曲霉毒素风险预警智能感知卡方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，测定结果表明，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法具有良好的特异性。
实施例8含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01纯品的稳定性比较
将实施例1制备的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01纯品和实施例6制备的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质，在相同条件下存放，比较二者的稳定性即货架期。采用实施例5和实施例7共两种方法测定，研究结果均表明：含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01纯品相比，稳定性更高，货架期更长，4℃保存可延长3个月以上。实施例9含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在预测预警黄曲霉毒素污染风险水平方面的应用
随机选择土壤、花生、玉米、稻米、小麦、核桃、开心果等样品共299份，采用实施例5的方法测定上述样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的浓度，并采用《GB 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中的高效液相色谱-质谱联用方法测定黄曲霉毒素水平。测定结果表明：当测定的AFT-YJFZ01浓度小于0.16μg/g时，86％样品的黄曲霉毒素污染水平在1.0μg/kg以下，为低风险；当测定的AFT-YJFZ01浓度大于1.12μg/g时，76％样品的黄曲霉毒素污染水平在10μg/kg以上，为高风险；其余测定AFT-YJFZ01浓度在0.16μg/g～1.12μg/g则为中风险。
利用上述低风险时黄曲霉毒素预警分子阈值——0.16μg/g，高风险时黄曲霉毒素预警分子阈值——1.12μg/g，以及上述实施例6中标定结果为0.16ng/μg的含有黄曲霉毒素预警分子的参考物质，则可获知：当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在1.0mg/g以下时属于低风险区域，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在7.0mg/g以上时属于高风险区域，由此建立基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的黄曲霉毒素污染风险预测预警方法。
利用实施例7基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质建立的黄曲霉毒素风险预警标准曲线，采用该方法测定花生根际土壤样品6个、花生样品6个、大米样品6个、核桃样品3个、开心果样品3个、小麦样品3个、饲料样品6个，通过测定获知有1个土壤样品、2个花生样品、1个开心果样品、3个饲料样品的结果都在7.0mg/g以上，其余样品测定结果均在1.0mg/g以下，根据上述基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的黄曲霉毒素污染.风险预测预警方法判断：7.0mg/g以上的1个土壤样品、2个花生样品、1个开心果样品、3个饲料样品的黄曲霉毒素污染风险水平较高，应予以预警重视，并及时采取有效的防控措施来降低污染危害；而其余样品的黄曲霉毒素污染风险水平属于低风险，在指导生产生上可以放心利用，在没有遭遇恶劣天气影响下无需采取任何额外的防控措施。
综合以上实施例证明，本发明技术方案具有如下优势：
1.可用于建立检测黄曲霉毒素预警分子以及检测含有黄曲霉毒素预警分子的产毒黄曲霉菌的标准曲线。
2.可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平。
3.稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 33172
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
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GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2700
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2760
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2820
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT 2880
FRHVDGFGIH TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD 2940
GFGIHTFRHV DGFGIHTFRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT FRHVDGFGIH 3000
TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD GFGIHTFRHV 3060
DGFGIHTFRI VPEEYVPITK IVPEEYVPIT KIVPEEYVPI TKLFSYLDTQ LNRLFSYLDT 3120
QLNRLFSYLD TQLNRLFSYL DTQLNRLFYN SLTPAEQQFV VDAIRLFYNS LTPAEQQFVV 3180
DAIRNAGIQT SRNAGIQTSR DGVYVDKNNV IIQLNRNYFA ETEQVMFQPG HNYFAETEQV 3240
MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3300
IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF 3360
AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV 3420
MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3480
IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RQDLFEAIEA GRQDLFEAIE AGRQLSEDGV DVVVVAERQL 3540
SEDGVDVVVV AERQLSEDGV DVVVVAERQL SEDGVDVVVV AERSLQGKAS MVWEEAQQVS 3600
GKSLQGKASM VWEEAQQVSG KSPSFEDVWS QPRSVTSGFV DGIKSVTSGF VDGIKDGLRS 3660
VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3720
VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3780
VTSGFVDGIK DGLRTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT 3840
FGQKLKTTDV GTFGQKLKVG FLASVETPAS IEAASELSKV GFLASVETPA SIEAASELSK 3900
VGFLASVETP ASIEAASELS KVGFLASVET PASIEAASEL SKVGFLASVE TPASIEAASE 3960
LSKVGFLASV ETPASIEAAS ELSKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN 4020
NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKYPEWEL 4080
GVQIMDEEDQ LKYPEWELGV QIMDEEDQLK ALFNRDIATG KANNYCSNQV EGPYSLYSGR 4140
DIATGKVSIA KDYACPWNGG EEVSLKDYAC PWNGGEEVSL KVEYSDAAKE GDPEMYGNNE 4200
TVNKVCAKAN NYCSNQVEGP YSLYSGREPG ICETTPGVKE QTASVVNGTA VIKGFSATGD 4260
YPRGGPGSSS MIGLMQENGP CRGYLEDIAY VLDSGIKGYY DISHFDPDIG LMQENGPCRL 4320
AAEGDPEMYG NNETVNKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNQVEG PYSLYSGRNY 4380
CSNQVEGPYS LYSGRPGGCK DQIIECRQVE GPYSLYSGRQ YGNFSFTRSN QVEGPYSLYS 4440
GRTNASYVGG LVRTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKPGG TVYDMAMEAW SKPGGCKVAL 4500
VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VFEAGHEVPA YQPETAYEIF VFEAGHEVPA YQPETAYEIF 4560
HRVSIWTESY GGRYCSNQVE GPYSLYSGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRVEYSDAAK 4620
FRISYKEPGI CETTPGVKFT AFFQEQNEKS IWTESYGGRN YIVVDADSSF WFFESRISYK 4680
EPGIHDDRVS IWTESYGGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRDYAANNYC SNQVEGPYSL 4740
YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ VEGPYSLYSG 4800
RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG PYSLYSGRAN 4860
NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC 4920
SNQVEGPYSL YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ 4980
VEGPYSLYSG RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG 5040
PYSLYSGRAN NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRDIAT GKVSIAKDYA 5100
CPWNGGEEVS LKDYACPWNG GEEVSLKGDP EMYGNNETVN KVCAKANNYC SNQVEGPYSL 5160
YSGRGGPGSS SMIGLMQENG PCRIGLMQEN GPCRIGLMQE NGPCRISYKE PGICETTPGV 5220
KISYKEPGIC ETTPGVKISY KEPGICETTP GVKISYKEPG ICETTPGVKI SYKEPGICET 5280
TPGVKISYKE PGICETTPGV KISYKEPGIC ETTPGVKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE 5340
NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW MNGGPGSSSM IGLMQENGPC 5400
RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG PGSSSMIGLM QENGPCRNAP 5460
LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW 5520
MNGGPGSSSM IGLMQENGPC RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG 5580
PGSSSMIGLM QENGPCRNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRPGGCK DQIIECRTVY 5640
DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKTVY 5700
DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKPGGTVYD MAMEAWSKPG GTVYDMAMEA 5760
WSKPGGCKTV YDMAMEAWSK PGGCKTVYDM AMEAWSKPGG CKTVYDMAME AWSKPGGCKT 5820
VYDMAMEAWS KPGGCKTVYD MAMEAWSKPG GCKTVYDMAM EAWSKPGGCK TVYDMAMEAW 5880
SKPGGCKVAL VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VALVYGDRDY ACPWNGGEEV SLKVALVYGD 5940
RDYACPWNGG EEVSLKVALV YGDRDYACPW NGGEEVSLKV ALVYGDRDYA CPWNGGEEVS 6000
LKVALVYGDR DYACPWNGGE EVSLKVALVY GDRDYACPWN GGEEVSLKVA LVYGDRDYAC 6060
PWNGGEEVSL KVALVYGDRD YACPWNGGEE VSLKVALVYG DRDYACPWNG GEEVSLKVFE 6120
AGHEVPAYQP ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI 6180
FHRVFEAGHE VPAYQPETAY EIFHRVFEAG HEVPAYQPET AYEIFHRVFE AGHEVPAYQP 6240
ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI FHRVFEAGHE 6300
VPAYQPETAY EIFHRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRVSI WTESYGGRVS IWTESYGGRV 6360
SIWTESYGGR VSIWTESYGG RVSIWTESYG GRVSIWTESY GGRVSIWTES YGGRVSIWTE 6420
SYGGRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRYGP SFTAFFQEQN EKYGPSFTAF FQEQNEKYGP 6480
SFTAFFQEQN EKAAWLFEDS QAKADEINQI FDAISYMKAD VPSGSTNITH GRAFPCFDEP 6540
ALKAGMIADA GALASSGYQS TSGLLSLLKA VEQSLDAIRD GHILQQFKFA AGETSAIHPN 6600
IRGFDNEAEF IVWNEIVARI VDVLLDEKIV DVLLDEKNSG ASRLNADHSA IYRLTFTGIL 6660
NDNMAGFYRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRNVGFPV VTVAEDAASS SIKSSHPIEV 6720
PVKSSHPIEV PVKRTGDVRP EEDTTLYPVM LGLRTHEIGW EFSEKTKQGL DENTMLTERT 6780
LGLALSDEVK VYATPDQDIE HGRYLASTQM EPTDARYLGE DVFIQGVRQG LLTVEDRGSV 6840
FSIVLKAAQE MFQRQGLDEN TMLTERTDVE SWLKAGMIAD AGALASSGYQ STSGLLSLLK 6900
FAAGETSAIH PNIRLTFTGI LNDNMAGFYR NGGEKEYNVV YDRNGGEKEY NVVYDRNGGE 6960
KEYNVVYDRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRVYATPD QDIEHGRYLA STQMEPTDAR 7020
AWYENGITNC VGDNTRCCDS GVEQLVSFSD VSDFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDN 7080
TCNAPIPVSF PVAPTDTKDP YMFHQANLRD QCNYSLQYTI GNKFAANGNY GSETTAAVIN 7140
NFNGRFTTSA SDGFDGMQVN PRGNGVIEAA AGKGNVAGNI LVIAKITTAD MDGISSWLPT 7200
INGKIYYNCD TPACTVQEWI DTSAGSGDFS NLLATEKKPL GTGTDLWPKL DDLFVWWTTP 7260
ANRLVDWPIV TITHQEMSAN MNAGSSYFVE VGHNMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKQ 7320
AWVETMVQEF VRSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 7380
VNPRVIANGN VAGNILVIAK YFTSNGIIPP AITGLHNGDA LRQITGVTLS AKSASDGFDG 7440
MQVNPRDPYM FHQANSDVSD FKEAGLKGII PPAITGLHNG DALRYFTSNG IIPPAITGLH 7500
NEISFNQAWL RLVDWPIVTI THQEMSANFL DRKPLGTGTD LANGNVAGNI LVIAKHQEMS 7560
ANFLDRYNRD QCNYSLQYTI GNKAWYENGI TNCVGDNTRA WYENGITNCV GDNTRAWYEN 7620
GITNCVGDNT RAWYENGITN CVGDNTRAWY ENGITNCVGD NTRAWYENGI TNCVGDNTRA 7680
WYENGITNCV GDNTRAWYEN GITNCVGDNT RDADACNGGG IEYDSPADTP LEFKDADACN 7740
GGGIEYDSPA DTPLEFKDAD ACNGGGIEYD SPADTPLEFK DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK 7800
DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK DPYMFHQAND PYMFHQANLR DPYMFHQANL RDPYMFHQAN 7860
LRDPYMFHQA NLRDQCNYSL QYTIGNKEIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS 7920
FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF 7980
AANGNYGSET TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN 8040
NFNGRFAANG NYGSETTAAV INNFNGRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF AANGNYGSET 8100
TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD 8160
MDGISSWLPT INGKITTADM DGISSWLPTI NGKITTADMD GISSWLPTIN GKITTADMDG 8220
ISSWLPTING KITTADMDGI SSWLPTINGK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8280
TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8340
TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKLDDLFV 8400
WWTTPANRLD DLFVWWTTPA NRLDDLFVWW TTPANRLDDL FVWWTTPANR LVDWPIVTIT 8460
HQEMSANLVD WPIVTITHQE MSANFLDRLV DWPIVTITHQ EMSANFLDRM NAGSSYFVEV 8520
GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA 8580
AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS 8640
YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN 8700
GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8760
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8820
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8880
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8940
VNPRVIANGN VAGNILVIAK VIANGNVAGN ILVIAKYFTS NGIIPPAITG LHNGDALRAS 9000
HTVDKNGIWS SEVKATDNYI ANAAAAVAKD LLQDIVTWDD KEAGIYLIAR GPLNEGGLYA 9060
ERGTNYVALS LWALESDGAK HTDYSSQEST SYKLGSFELS YTTPVLTGYG NVESPEQPKL 9120
SGQDASAITW KLTGNLGGED YQDKLTGNLG GEDYQDKVRN SAYNYWVPEL PTEGTSPGFS 9180
TSKPGIGFYT AQFDLDLPKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSPGSFFV VRSSYDDSAW 9240
VSADLPKTSY DYGSPITETR YPDADYMQYV MDQARNGIWS SEVKVLVLYG GPKASPSYLT 9300
ATPRYLDTLP EIKTLHLEQS PSTPYAQLYV NGYQYGKKAD IVVPFPWGGP GFEKAQLYVN 9360
GYQYGKAQLY VNGYQYGKAT DNYIANAAAA VAKLSGQDAS AITWKLTGNL GGEDYQDKVR 9420
NGIWSSEVKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSSYDDSA WVSADLPKYP DADYMQYVMD 9480
QARYPDADYM QYVMDQARAL TNGAGAIKEA IADVLEHLGE NDEDIAVYAP NPFYKGFAPL 9540
EYLGSNFENG ELPKGFDNAG FVMGTSSSLF NQFILRGKMP MPILVADGRH FQLINTAAYW 9600
KIPNVAIAVS GGGYRLNGTD IPNFLKLNLS SFDASGYIDR LPDICNTCFK MPMPILVADG 9660
RNSILEGPDV KSAAALSTSE KDWLQVRSSS LFNQFILRTF LNLGLNKTNT KLPDICNTCF 9720
KTSLTDYWGR SSFDASGYID RSTSEKDWLQ VRGTDIPNFL KLNLGLNKGF DNAGFVMGTS 9780
SSLFNQFEYL GSNFENGELP KMPILVADGR DLYDAVKINT AAYWKSIALG DDFKKALTNG 9840
AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKGKMPM PILVADGRGK MPMPILVADG 9900
RGKMPMPILV ADGRGKMPMP ILVADGRGKM PMPILVADGR GKMPMPILVA DGRHFQLINT 9960
AAYWKHFQLI NTAAYWKLPD ICNTCFKLPD ICNTCFKMPI LVADGRMPMP ILVADGRMPM 10020
PILVADGRMP MPILVADGRM PMPILVADGR MPMPILVADG RMPMPILVAD GRMPMPILVA 10080
DGRMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNSILE GPDVKNSILE GPDVKNSILE GPDVKSAAAL 10140
STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10200
AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10260
QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE 10320
KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL 10380
STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10440
AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10500
QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RTNTKLPDIC 10560
NTCFKTNTKL PDICNTCFKT NTKLPDICNT CFKAASLPAS FSGFKALVSH DGTFVADAKE 10620
NSLVWHQQVL GWLNKFNAVF SGTLKGDAGS PVFSPDSKGD AGSPVFSPDS KKIAYWQMAD 10680
ESYEADHRIQ AFVIYPENFD KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRLPV SEGLSLFNIL 10740
QERMINWIQG SDLGRNAESP YPPFGGASDY DLSPDGKRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK 10800
SEAIPNPSGD VAVFSQSQYS FKTAVPINGP DSPGTPEGVK TAVPINGPDS PGTPEGVKGD 10860
AGSPVFSPDS KTLATANKID PELKTLYVYT VGSEETIPSL AADWDRTTSQ WNVLDLKVVT 10920
TDSGDVRWIQ GSDLGRALVS HDGTFVADAK ALVSHDGTFV ADAKGDAGSP VFSPDSKKIA 10980
YWQMADESYE ADHRIAYWQM ADESYEADHR IAYWQMADES YEADHRLFSI PADAGDDYKP 11040
KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK RSEAIPNPSG 11100
DVAVFSQSQY SFKTAVPING PDSPGTPEGV KTAVPINGPD SPGTPEGVKT AVPINGPDSP 11160
GTPEGVKGDA GSPVFSPDSK TTSQWNVLDL KTTSQWNVLD LKAASNFDGD TLVLGYDSGN 11220
GNPETSFMTL MRAGSTIAVT DVQITGGAVG IKASGTCSGP IQSAPTSYWL ADQDHSGDAR 11280
DAGSPKPVVQ IGHEGDVGVA EIQNMRFSVA EILPGAKGDG STDDSASLNA ILANNAANCK 11340
GTCSGPIQSA PTSYWLADQD HSGDARIVGE AWAVITGAGD AFKNSQILIQ NLSHDNSNAI 11400
AVDSKNSQIL IQNLSHDNSN AIAVDSKDNI KNVVLDTTAL SANTKSAPTS YWLADQDHSG 11460
DARVGTIITG DPLDPPVLKV TNSPSNLVWY SISTRYPAEV FLPGGTYQLG KSLGSLVLLD 11520
SSSINSGPVV RDTLVIPPGS RAQPTYAEYS NDQIVNVKSG TCSGPIQSAP TSYWLADQDH 11580
SGDARAGSTI AVTDVQITGG AVGIKAQPTY AEYSNDQIVN VKAQPTYAEY SNDQIVNVKD 11640
AGSPKPVVQI GHEGDVGVAE IQNMRFSVAE ILPGAKNSQI LIQNLSHDNS NAIAVDSKNS 11700
QILIQNLSHD NSNAIAVDSK NSQILIQNLS HDNSNAIAVD SKNSQILIQN LSHDNSNAIA 11760
VDSKDNIKNS QILIQNLSHD NSNAIAVDSK DNIKNSQILI QNLSHDNSNA IAVDSKDNIK 11820
NVVLDTTALS ANTKSAPTSY WLADQDHSGD ARVTNSPSNL VWYSISTRVT NSPSNLVWYS 11880
ISTRAGALLL GKAGVIPESL HQDTVGTFGK DRLETTAGSW ALLGSVVPRG IMDETYYQAL 11940
EFCQRGKTPE GGYAQFLTNK GPLHGIPFIV KIHQTQPYLN AILQVNPDAF KLETTAGSWA 12000
LLGSVVPRNS VVGIKPTVGL TSRTIVSPDG FNWDYGSTRT PEGGYAQFLT NKTTREEGID 12060
AALKVDFYNN LKDYLSEVEN TKAALSEWAD MRALGTETDG SVINPAQREE GIDAALKDAV 12120
YALDAIYGID ARAALSEWAD MRAALSEWAD MRAGVIPESL HQDTVGTFGK AGVIPESLHQ 12180
DTVGTFGKAG VIPESLHQDT VGTFGKAGVI PESLHQDTVG TFGKGIMDET YYQALEFCQR 12240
IHQTQPYLNA ILQVNPDAFK NSVVGIKPTV GLTSRNSVVG IKPTVGLTSR NSVVGIKPTV 12300
GLTSRTIVSP DGFNWDYGST RTTREEGIDA ALKAVWPGDM GVAVPAAFVS TGDLESVKAY 12360
QGYFHSNDDL LNRDGSASYV MPDKDRAVWP GDMGVAVPAA FVSTGDLESV KDSAFPGLWE 12420
ENIYAPSSRG GSGALGLAFS EAKGVYYVDD TATITVSGGG SHRIWYSGAY TLQTNAVPVN 12480
TGRNALQTMY DTQDKNALQT MYDTQDKTTG AFDESGPPLS QKSPDGYTLQ FSVPPGTKSS 12540
EKPSITIDGN NINKTTGAFD ESGPPLSQKI APQFGDLKAL ELIRRFQASW DKSPDGYTLQ 12600
FSVPPGTKIS SFEIQGHFKA VWPGDMGVAV PAAFVSTGDL ESVKAYQGYF HSNDDLLNRA 12660
YQGYFHSNDD LLNRAYQGYF HSNDDLLNRA YQGYFHSNDD LLNRDGSASY VMPDKDGSAS 12720
YVMPDKDRAV WPGDMGVAVP AAFVSTGDLE SVKGVYYVDD TATITVSGGG SHRGVYYVDD 12780
TATITVSGGG SHRISSFEIQ GHFKNALQTM YDTQDKNALQ TMYDTQDKNA LQTMYDTQDK 12840
NALQTMYDTQ DKTTGAFDES GPPLSQKNAL QTMYDTQDKT TGAFDESGPP LSQKNALQTM 12900
YDTQDKTTGA FDESGPPLSQ KNALQTMYDT QDKTTGAFDE SGPPLSQKSP DGYTLQFSVP 12960
PGTKSPDGYT LQFSVPPGTK SSEKPSITID GNNINKSSEK PSITIDGNNI NKSSEKPSIT 13020
IDGNNINKTT GAFDESGPPL SQKDNILPEN LDDGLPSQFV YEKFGPHEYN GDQYTSIIRL 13080
VIDLSGNGGG YILQGYDTFR NVGLVSVSLD GKPSSDPMQG IGGIKQLFPS IVQDGYTRSD 13140
KYAGEYEFQA DLFKSFEPST PAEFQAVLEK YAGEYEFQAD LFKPFAASTP GFDGYFSGSA 13200
RAASTPGFDG YFSGSARYDL NLENKAFNLA HDGHFRHFTS LEEKFFPDLL TKSIAIGGRP 13260
SSDPMQGIGG IKFGPHEYNG DQYTSIIRFG PHEYNGDQYT SIIRQLFPSI VQDGYTRQLF 13320
PSIVQDGYTR QLFPSIVQDG YTRSDKYAGE YEFQADLFKE PGAEGVCETT PGVKFANQMP 13380
NGCQDLISTC KGCQDLISTC KQLPKNPTGV KSAGYTPLKV NGVEYGETRS YSGYVDTSPE 13440
SHTFTALADY ALCAEATNMC RTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKKVYEA GHEVPYYQPI 13500
ASLYKEPGAE GVCETTPGVK LSGLPSLDSR SYSGYVDTSP ESHTFFHNPE TAPITLWLNK 13560
IWPSYKVYEA GHEVPYYQPI ASVNGVEYGE TRTALADYAL CAEATNMCAE GVCETTPGVK 13620
FANQMPNGCQ DLISTCKFAN QMPNGCQDLI STCKFANQMP NGCQDLISTC KFANQMPNGC 13680
QDLISTCKFA NQMPNGCQDL ISTCKFANQM PNGCQDLIST CKKIWPSYKK IWPSYKSAGY 13740
TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN 13800
GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE 13860
TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY 13920
TPLKVNGVEY GETRTALADY ALCAEATNMC RTALADYALC AEATNMCRTA LADYALCAEA 13980
TNMCRTALAD YALCAEATNM CRTALADYAL CAEATNMCRT ALADYALCAE ATNMCRTALA 14040
DYALCAEATN MCRTALADYA LCAEATNMCR TALADYALCA EATNMCRTIF GWDIAEGQKT 14100
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14160
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14220
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKKVNGVEY GETRVNGVEY GETRVNGVEY GETRYKEPGA 14280
EGVCETTPGV KYKEPGAEGV CETTPGVKYK EPGAEGVCET TPGVKYKEPG AEGVCETTPG 14340
VKYKEPGAEG VCETTPGVKA SDFWANELVT WWNKEAEPSQ EYVSYSHGVF LRFSYEEGEK 14400
FLNKGAKDDV FIKGGSILPM QEVALTTRKA TGDVLFNTKN AHGQEILLRN HNVLSAIPQE 14460
PYRQYQLSTV GLPAMQQYNT LGFHQCRSSE AEPSQEYVSY SHGVFLRTLG GSVDLTFYSG 14520
PTQAEVTKWA SVIDATKSEA EPSQEYVSYS HGVFLRAEPS QEYVSYSHGV FLRAEPSQEY 14580
VSYSHGVFLR AEPSQEYVSY SHGVFLRAEP SQEYVSYSHG VFLRASDFWA NELVTWWNKE 14640
AEPSQEYVSY SHGVFLREAE PSQEYVSYSH GVFLREAEPS QEYVSYSHGV FLRFSYEEGE 14700
KFLNKGGSIL PMQEVALTTR GGSILPMQEV ALTTRNAHGQ EILLRNAHGQ EILLRNHNVL 14760
SAIPQEPYRN HNVLSAIPQE PYRNHNVLSA IPQEPYRNHN VLSAIPQEPY RNHNVLSAIP 14820
QEPYRSEAEP SQEYVSYSHG VFLRWASVID ATKWASVIDA TKDPSINDDS VMIYAPAVRF 14880
LDEALTYPPP KGIQINDPSI NDDSVMIYAP AVRIASAMLD EEDEKYFNVK NGDQSPPSAL 14940
GPLPSVIERP SINDDSVMIY APAVRTDYSV CGETTIFKVY LTGESYAGQY IPYIASAMLD 15000
EEDEKVYLTG ESYAGQYIPY IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKT DYSVCGETTI 15060
FKNGDQSPPS ALGPLPSVIE RVYLTGESYA GQYIPYTLIA GAGLLGTAHT ERETTIFKNG 15120
DQSPPSALGP LPSVIERTDV QKALHVPRDD SVMIYAPAVR FLDEALTYPP PKGIQINDPS 15180
INDDSVMIYA PAVRGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV MIYAPAVRGI 15240
QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKIASAMLDE EDEKYFNVKI ASAMLDEEDE 15300
KYFNVKIASA MLDEEDEKYF NVKIASAMLD EEDEKYFNVK IASAMLDEED EKYFNVKIAS 15360
AMLDEEDEKY FNVKIASAML DEEDEKYFNV KNGDQSPPSA LGPLPSVIER TDYSVCGETT 15420
IFKNGDQSPP SALGPLPSVI ERTDYSVCGE TTIFKNGDQS PPSALGPLPS VIERVYLTGE 15480
SYAGQYIPYI ASAMLDEEDE KYFNVKAHIL PPNGRDLNPN GSQFITPGGK DLNPNGSQFI 15540
TPGGKNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKFHVLTAQ LSFPRFRDLN PNGSQFITPG 15600
GKLDRPPVIP LPPSDSDVTA FRNDPVAVFD GSVIPKPVAV FDGSVIPKTI SNVVDNELAR 15660
TTNGIVSTNE SGRDPVAVFD GSVIPKFALS TWARILPATS QVSTKAHILP PNGRAHILPP 15720
NGRAHILPPN GRDLNPNGSQ FITPGGKFAL STWARFALST WARFHVLTAQ LSFPRFHVLT 15780
AQLSFPRFRD LNPNGSQFIT PGGKFRDLNP NGSQFITPGG KFRDLNPNGS QFITPGGKND 15840
PVAVFDGSVI PKTISNVVDN ELARTISNVV DNELARTISN VVDNELARTT NGIVSTNESG 15900
RDWSDSYYQG PAFKFGLGAD NTLAFEVVTA DGQLVTASRG VGSDAWTVSE SGRITNEYVP 15960
QLEAVTPGSG CYQNEGNFRN VLENNPTGMA SVLRSKWDPN NFFYVLKTTA LTDLGIAYKV 16020
SAGVMGYQIL NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RWDPNNFFYV 16080
LKDWSDSYYQ GPAFKGVGSD AWTVSESGRG VGSDAWTVSE SGRGVGSDAW TVSESGRGVG 16140
SDAWTVSESG RITNEYVPQL EAVTPGSGCY QNEGNFRNVL ENNPTGMASV LRNVLENNPT 16200
GMASVLRVSA GVMGYQILNA AHAKVSAGVM GYQILNAAHA KVSAGVMGYQ ILNAAHAKVS 16260
AGVMGYQILN AAHAKVSAGV MGYQILNAAH AKVSAGVMGY QILNAAHAKV SAGVMGYQIL 16320
NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RALMNGAGAI KDAGYETSIT 16380
DYWGRDFFNH VTIKDGNWTT CVGCAILSRG FVPLEYVGSK HVYDAVQDKP TVYGFVPLEY 16440
VGSKTNTQVP DACTQCFQKQ ADMPMPLLVA DGRTAFSDIL AKSIALTDTF KILDSATYYK 16500
ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK 16560
ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK DAGYETSITD YWGRDAGYET SITDYWGRDA 16620
GYETSITDYW GRDAGYETSI TDYWGRDAGY ETSITDYWGR DFFNHVTIKD FFNHVTIKDF 16680
FNHVTIKDFF NHVTIKGFDN AGFVMGTSSS LFNQFMPLLV ADGRMPLLVA DGRMPMPLLV 16740
ADGRMPMPLL VADGRMPMPL LVADGRMPMP LLVADGRMPM PLLVADGRMP MPLLVADGRM 16800
PMPLLVADGR QADMPMPLLV ADGRQADMPM PLLVADGRQA DMPMPLLVAD GRQADMPMPL 16860
LVADGRTSIT DYWGRAHDDT VNYLYEELKK ATAFAVATYA NDLSSIPKGG DPNNVVALGG 16920
HTDSVEAGPG INDDGSGIIS NLVIAKGPYS AIVGISLEDG QKNLGCSEAD YPSDVEGKQP 16980
QVHLWSNADQ TLKTMTYSPS VEVTADVAVV KTTYNVVAQT KVGDEEIEAK AHDDTVNYLY 17040
EELKKAHDDT VNYLYEELKK AHDDTVNYLY EELKKQPQVH LWSNADQTLK TMTYSPSVEV 17100
TADVAVVKAG QFPISANDGA TSTKAGVLSW SYTWSPADKE AASAALAAGY KFDGVTWDEE 17160
NWLLKFDPSA AIYPWTSGRF VGGASTDAFA DPKLLPEEGI YITPNLPPQI PYVKPSAAIY 17220
PWTSGRVVLT LTGIEPSTIY TAEEENQVRA YVASDSELEY VTWTVDNRGD WEVTSILSID 17280
QERTLIPADK IPTGKTLSTN EEGYETSAVR VSQTNPTVTL SLLNIASKYP ILFTPYGGPG 17340
AQEVTKDGTD GWLDNLLSMK TLSTNEEGYE TSAVRKFYDS MYTERTLIPA DKIPTGKATS 17400
GGTSAAAPVF AGLVGMLNDA RDFTDITAGS SIGCDGVNPQ TGKGFPDVAA HSLTPRPDVA 17460
AHSLTPRPNS ALPQVLSNSY GDEEQTVPEY YAKSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKSYG 17520
DEEQTVPEYY AKVCNLIGLM GLRLKDLVLS LAWYQESAVS KATSGGTSAA APVFAGLVGM 17580
LNDARATSGG TSAAAPVFAG LVGMLNDARA WYQESAVSKA WYQESAVSKD FTDITAGSSI 17640
GCDGVNPQTG KGFPDVAAHS LTPRGFPDVA AHSLTPRGFP DVAAHSLTPR SALPQVLSNS 17700
YGDEEQTVPE YYAKVCNLIG LMGLRDAEEE PYDWSNEGRG ISDGIDWQAG YSAVQKMDDA 17760
EQYEATSRNI YIQSATLDGK PYSKSLNYIP VEDFDYKTLE YSYDDFTIAQ MARTMINPQD 17820
YTGENPLWKD NGIFVNSRSI NGYPLPGGAF VRMDDAEQYE ATSRTLEYSY DDFTIAQMAR 17880
DIDFGENGDG IKDYVPNTQI PVTVAANTFP GGQEGFIDFV KFQESPEGAD FWGARTKVTI 17940
SPELSIRVFQ TAFGPAGTML TYEPIVRADA IVAAIRLAED HINWVEIRVT ISPELSIRHE 18000
LGVDEIWRDI DFGENGDGIK DIDFGENGDG IKFQESPEGA DFWGARLAED HINWVEIRAG 18060
VKPSNYVGDI FGTLGGTPDF GPGRCDVATT DVYYSGKSKY TAEGYEAATK TASNFDQPHS 18120
DESALQHLRY CASAQEDNAT LQALLRYTAE GYEAATKYVD AGGFEPSIKL QALLRSKYTA 18180
EGYEAATKTA SNFDQPHSDE SALQHLRGHL TAMTGDGVND APSLKTAALV QGASDSGHFK 18240
TGTLTANQLS IRAYGIVVAT AKTGDGVNDA PSLKMLTGDA LAIAKLAIEH EVDAHGKIEN 18300
MLSHLSKDKS ETETETEIEI SNKIKEIQEA GDVRLSDELE DDNAPIGFET TKSVEIAQLH 18360
SEVEALVEKY TVTAGELTSD FKEVEVEKEW TKTETKTEIE IERIKEIQEA GDVRASSDDS 18420
NYGWEDSKGI QDAGVIATAK IGAQSTVLLK NFGEIGDASE YVYPEGLERY TPPNFSSWTR 18480
VNEFVDVQRA VDIVSQMTLT EKDSPNWDVD SDALPAIPEG AKEIPVGYSA ADIDTNRGVD 18540
YQPGGSSNLA DPIADAEGCK RNTLAFFSGN EVINDGPSSK YGLVEIDDGK VKTLADFDAL 18600
KYGLVEIDDG KVKDLMQAMA DFGPKFPGGN NLEGDTLDGR TGEVYASAVI VSKYPSNLDA 18660
WIPVDGSALS LKYVEVGNED NLNDGLDSYK FQAFYDAIKE QTYTGSFYVK ASLGHPEPWT 18720
VKDLMQAMAD FGPKELPSGP YFVSLYTGEV FKGISPEAHQ SLTTFTRLYP DDNLAFIQAG 18780
ISDEKQLLLA GGGWDGKSLF VSVYSVGTTD YRLYYTPTAE KPLAGLRGIS PEAHQSLTTF 18840
TRQLLLAGGG WDGKDSLSEA IAYAKGGGGG TFGVVMESTH RIANECQNQE LFWALRSQGG 18900
TAVIEEFPSW YEFYQKYVVP NAVTVGNAHF AATRSSGQGT LSLWTRAVTV GNAHFAATRG 18960
GGGGTFGVVM ESTHRGGGGG TFGVVMESTH RGGGGGTFGV VMESTHRIAN ECQNQELFWA 19020
LRSSGQGTLS LWTRYVVPNA VTVGNAHFAA TRYVVPNAVT VGNAHFAATR YVVPNAVTVG 19080
NAHFAATRAS SVSGVITLSD GRTTADSDGN FSFENVRVQD ETWELSDGSY ITKYDWSDFI 19140
NSAKYEEFEV PAGTLVKIWQ IGTLDRAYTQ YTETSVYGML KDGDLVTQQN ELQGKHEGWI 19200
DEAAVQEAKL HYGAYSIKSN LFNSYSENQV LLPASVYGSY KETYGSAAGW DKLADALAAS 19260
SLPEAWWGEN YEPLLNIKGG GGGTFGVVIE STHRIANECQ NQDLFWALRV EPQLSFVAAV 19320
IKYVTSNAVS VGVTHFAGSR AVFETAEGRG GGGGTFGVVI ESTHRYVTSN AVSVGVTHFA 19380
GSRDAEVAPP NDPVDPMAPD SSTKFEGYLP DARGSTGNVL VDVSHVLPSF RVGISWLSTE 19440
KLSITATGGD GNGDSQIYVQ KGAVNWEDGY RDAEVAPPND PVDPMAPDSS TKDSVKEDDY 19500
EDLFNYICAK KFTDTPVLYG PKMLDDAGIY LITDLSSPSE SINRSDGQCS DLLKQQLSFV 19560
MNQWYEKYGA YSVCSPKTLP AIESKKFTDT PVLYGPKMLD DAGIYLITDL SSPSESINRS 19620
DGQCSDLLKA DAAGSHGEAL NEVQAKAKAD AAGSHGEALN EVQAKLEAAE QALSEARVGA 19680
LESQLSTEQD AIKEAAESAG TTHSQQLQEL RDALEAAEAA AKIQEQLKGQ TPLPILVADG 19740
RNNILEGPDV KSHLSVVDGG EDGQNIPLHP LIQPERTIDY WTELVDTVKT STTLPEVCSK 19800
AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK GQTPLPILVA 19860
DGRINLGLNK NNILEGPDVK SHLSVVDGGE DGQNIPLHPL IQPERTFINL GLNKTSLTDY 19920
WGRFNVDETA FTGAWGRIGS LAITDVSLPF FKIQGISNPS GALSSGGLGE PKVQNGAVTW 19980
ESDPNRATTV YGESIKSIYA INSGRELDTQ HIHPPDSYFV SPLTRGFTEI DELWNGVTAE 20040
TNAAQDLRQA QVAHDFWQKF YHQVVELNRK DAELTDAGVK LNTGAVIPVL VRELDTQHIH 20100
PPDSYFVSPL TRLNTGAVIP VLVRLNTGAV IPVLVRQAQV AHDFWQKQAQ VAHDFWQKAI 20160
NDYIDSQLDK KGVQISTNIP KSSPWIMLGG SYPGMRYQSL EYQQSLCYRL FSLALKISIP 20220
IDHEDPSMGT YQNRAINDYI DSQLDKKCSS HDDCSDELAC TDGVCACTAD SAVTCSWEGH 20280
CAGAKLNLQY QASGDAKKSL VDFSAARGDN PSILGLRSAV TCSWEGHCAG AKIGTTIDDI 20340
KCTADSAVTC SWEGHCAGAK CTADSAVTCS WEGHCAGAKC TADSAVTCSW EGHCAGAKCT 20400
ADSAVTCSWE GHCAGAKAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KIAFASYLEE 20460
YARQGLQDIT LGASIGCTGR YADLENFENY LAPWAKAFPD VAAQGMNFAV YDKAFPDVAA 20520
QGMNFAVYDK ELYNIGDYQA DANSGSKYAD LENFENYLAP WAKYADLENF ENYLAPWAKA 20580
GSSPTDIISG ISDKTDALDS AIKKVEQAID DIIAKSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 20640
LPEPVQALTK SPTDIISGIS DKTDALDSAI KAQNDPNAFG VVAARLGACP PGKETALLGD 20700
KPNAFGVVAA RQNDPNAFGV VAARAATYCP ENIEKIENQS DADGYSSCST LKLTGLTTLT 20760
TLSFAALTKS DKLNVIDFPK VGSIEFTALP QLQSLDFTKL NVIDFPKTVN GGFQIARGVA 20820
AWLFERLSFG SIDLENANIN RSLSFIPGVL YDGSPIGKQE STFAAVERSC FEIGKFVDPL 20880
IGSNNGGNVF AGASLPYGMA KGWTQGGSNA DVVLTDAYVK VGISYISTDR AGNWQNLYKA 20940
QHPFLTIVDP EAQSRSVFSQ NESVAAGLKT TAVLFDEGKE ICLAALGRAL VIVSDSIRTD 21000
TIHGVGQNSF YKASHPIEVP VKASHPIEVP VKIMSILLGG AIPDDLKPLV LFDSVTKTAT 21060
ESEPSLSDIE KTGYVNYNVD TTNLRKHNPL VLFDSVTKTS PFPYDSKKHN PLVLFDSVTK 21120
KHNPLVLFDS VTKKHNPLVL FDSVTKTGYV NYNVDTTNLR APTPPDFSLG YIQSKIEQDG 21180
SESLLTNEYA PLKGYAFIWN MPAQGRTSGW GGNPGGYRYQ LASYLRDYLD EYLVFPPAGV 21240
QPQKIYVTGE SYAGRVDHLP DVPFDVGEMY SGLVPIDKDD KNFQELFGIK KTPLDDFRAD 21300
DVLEVNPLAD PEVVSYFRLD ADAITAQYFG NDAPWYRSDY ASFLYGPYRL VFAPQEEKAT 21360
WDGVDADKIR FQYPGDLFDQ GTTIRFTGDA ATVNSIAARP DSDEIYFGGQ FEKNLEVLSL 21420
TKHVAAYSFG SKAWTALGGG VNGPVHKNLA LLDGKDLTDY LMKSYELPDG QVITIGNERV 21480
APEEHPVLLT EAPINPKQEY DESGPSIVHR QEYDESGPSI VHRVAPEEHP VLLTEAPINP 21540
KVAPEEHPVL LTEAPINPKV APEEHPVLLT EAPINPKAEL PEGYPESSAN PAFRDIQYLE 21600
NYQGQGYSGP AVKFVTVTEE TDPDLFWALR LSLGDSGACK DAEVEPANWG VEGRLGGAQL 21660
FTSRTVSLVE DGSNTPATLS AGTFARSLVD IYRTVSLVED GSNTPATLSA GTFARAYVEM 21720
MQCTDEKEPL VRLEKDLPGT TLSSKYYGYG GGNPLGPAQG IGFANELIAR LEKDLPGTTL 21780
SSKLSEAGHS VLLIEKTPIE SDATSYLNDR GGPMGTYLVS ASERVILSAG TFGTPKAVIT 21840
DIVNQQRLIN QVELSEDKTI ARGGSNNFGI VTRLLLSDAM WYTRERPSAQ LLSGKFDTLG 21900
TSGPTAKLAN AYTWEGGRAV ADRIPLAIHD EVSPVGDTDA LLERAPVVQY ALNRDGYMGY 21960
HGVPQIPIYA YKAIHDEVSP VGDTDALLER AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 22020
DALLERDGYM GYHGVPQIPI YAYKLAEESA ALGVKVNPII LTGDMWRVSD NAGLGDWVPN 22080
PDRFPDGLTP LVEDVTKALG GTSTINGMAY TRSQLSDYAA ATVKAEDVQI DVWQKALGGT 22140
STINGMAYTR EIGFTVQEDN TDGKIDFGSA PNIVNAIAED RNSPVWPDGI QQTYEYPNRA 22200
STNMITSNSG AGLVPQDENR IGGSAGTELQ SDKITGEVWP VLMAYGQKSA ISQYGDSFAK 22260
SQSDFESEFS TAKVNAGIGI GPDDLVSFIK GNAMDHFSSI MERYGPTYAA YFLDQNEKAI 22320
TETQYEEAKD LTLDLPDIGL QYAGTVKTVA ALINWRNIWD GTTAQNVKKE DLETSSYSFS 22380
GDGKVDFASL QSAATQSTTY SNAPAVKTCS LVFLFPKKED LETSSYSFSG DGKFDGILGL 22440
GFDTISVNKY GSGSLSGFVS QDTLKWYSVY DLGNGAVGLA KDAYSPHEIY SRIFEQLEGM 22500
SLSKTYEVVG NVYKDQVLKD VALIKAVPGT AQQAAAIKDA GEFDVERGTV VTNDQCGGAS 22560
SVRLHLVTAE EADIKIIYDM PDGSSCKGID VAKPTGRVNG VWTVTHSPFE GLSALKSAMT 22620
LPRVNGVWTV THSPFEGLSA LKVPTVLMSP WVGKSIDQFF NDAKNVAPDD PDHSITGGNQ 22680
QVYSTYHPNA KESTLHLVLR IQDKEGIPPD QQRIQDKEGI PPDQQRIQDK EGIPPDQQRD 22740
VSLVANHIDT VGKTAATVNT WTGGWSDSKA IGTYQNSGLS QYTVRYSEGV HFPARTVANW 22800
LVREVAGDVD NAVNPAWRLG AGVQGFEAYE AANAQGLRLD GGVIEDFAQK NPDLSSTSDT 22860
TDVIRGPDEP YSGQYDEERQ FISVTNPTGA EPVPKFLSEL LEDEYFTKFV NIWLENTDYE 22920
SAANDPHLSK LLEYDIASGT PVYRNNNQGL EALTISPDGK VYAISDQDDT GPWIRDAYQN 22980
DFAARVDPST AVDYNHYSDA ADRSGDVQTL QFAWALQHLS ERTGNQTGQL GTYFNKNINM 23040
LLYGTDDCSG KGMVFSIDAQ GEKNINMLLY GTDDCSGKNP NPDQAFLQVR FWVATGDSSK 23100
AALDALQQSI YLQPKFSDGN GLFYQYERVA VAGYDDTTGG VGPLLAQKAI AIALQSSHRQ 23160
TGSVDGYAYT DANKNDLITY LKSVVENNND GLTAAYRVAP NSGAYLNEAD FRSLPLIVGN 23220
SDQEGKANEQ PTWVYRSDYQ ECADAPGQKF GATGDEYREP SNDPNPPETY SKVALLFSER 23280
LADGSIPTRS ISSDEDSAET EQSDSSDPKV AIIDGLADPW RTMGVGYATN DDSTIRDVPI 23340
MQELNTNTIR DVDPIVIKVE TGVIKPGMVV TFAPANVTTE VKIVVIGHVD SGKDDADLQE 23400
LGAKSSAFAF RKDPSDAIPS IPSIPISYKE AIPFLKEAAE IDSHWERDDY MPFIEVPRDD 23460
YMPFIEVPRA LQGVDELVEK DALHPQFDNF YQEQPKASYG AGVTIQDRDL SVFFTRINDL 23520
LPVYVELLQK AALTNMVNAA KGEITPEQYE KIINEPTAAA IAYGLDKQLT SEEIWQAEEK 23580
LDKPAGDYTI RDYSNNWESG ALKLAPNQMT GSLDATYLKL APNQMTGSLD ATYLKCASDG 23640
SAETCSWEGH CKCASDGSAE TCSWEGHCKC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG 23700
HCKCASDGSA ETCSWEGHCK LAAISVEPGK ASELGCSSGD LDCLCKVGEC AQMCISNMNA 23760
KGTLLSSNQG SQAADVKNDD DFLNYGISSK APSVITYDEA TKYEAAGITV HKDDYLPFID 23820
MPSEVTQIDA KIPMALDDWP TLSNMIFSGK DNFDTSSVTH RGYQINFLSN SAKDNIQGIT 23880
KPAIRDNIQG ITKPAIGPLG LSPKLQLWDT AGQERAEDYL LNPSPKNFGI GQDIQPKIDA 23940
TTNPGMRQLG LAMLGNKLVI DGLKEVTEIP ATADASRVNV DYTEVPRLAV NMVPFPRYCD 24000
LILGEWRDQI KDVLRIDYIG GGDLFRGSSP NVLYKSANWT PPEGIVRAAS TGSMAEQYTK 24060
AATGTYASST TVYKAENQAV AVGRALVEGS TFAKALYSSA ATGTYASSTT VYKATGTYAS 24120
STTVYKATTV YGESIKAYAD GYVQIVQTYA ASTGSMAEQY TKDLTWSYAA LLTANNRFNV 24180
DETAFTGAWG RGQSAQGASP GVVIASPSKI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KIGSLAITDV 24240
SLPFFKIQGI SNPSGALSSG GLGEPKKYTV PSTCGVKPSG ALSSGGLGEP KQAILNNIGA 24300
DGQSAQGASP GVVIASPSKS DPDYFYTWTR SIYAINSGRT GTYASSTTVY KTVGSSCPYC 24360
DSQAPQVRVQ NGAVTWESDP NRVQNGAVTW ESDPNRKPDY FYTWTRYTVP STCGVKSSAA 24420
TGTYASSTTV YKGAVTWESD PNRIVGSISQ LGSWNPSSAT ALSAVQSDVW RDINTVLGSI 24480
HTFDPQNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKA ASTGSMAEQY TKAENQAVAV GRAENQAVAV 24540
GRALVEGSTF AKALVEGSTF AKALYSSAAT GTYASSTTVY KAYADGYVQI VQTYAASTGS 24600
MAEQYTKDLT WSYAALLTAN NRDLTWSYAA LLTANNRIQG ISNPSGALSS GGLGEPKIQG 24660
ISNPSGALSS GGLGEPKNIG ADGQSAQGAS PGVVIASPSK PDYFYTWTRQ AILNNIGADG 24720
QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ 24780
GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KQAILNNIGA DGQSAQGASP 24840
GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI 24900
ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS 24960
KQAILNNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI 25020
LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKSAVQSDV 25080
WRSAVQSDVW RSAVQSDVWR SAVQSDVWRS AVQSDVWRSD PDYFYTWTRS DPDYFYTWTR 25140
SDPDYFYTWT RSDPDYFYTW TRSDPDYFYT WTRSDPDYFY TWTRSIYAIN SGRSIYAINS 25200
GRSIYAINSG RTVGSSCPYC DSQAPQVRTV GSSCPYCDSQ APQVRVQNGA VTWESDPNRV 25260
QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE SDPNRVQNGA 25320
VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE 25380
SDPNRVQNGA VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN 25440
RKVQNGAVTW ESDPNRKVQN GAVTWESDPN RKVQNGAVTW ESDPNRKASM VWEEAQQVSG 25500
KAVSPSFEDV WSQPRDGAGQ MFIPLNPNAY SPNTLNKDVG GPIEDQNSLQ VGDRFGFDLF 25560
DPTKGPTLLE DFIFRHGGPN FEQLPINQPR HVDGFGIHLF SYLDTQLNRL FYNSLTPAEQ 25620
QFVVDAIRNN VIIQLNRQDL FEAIEAGRSL TPAEQQFVVD AIRSVTSGFV DGIKVGFLAS 25680
VETPASIEAA SELSKTTDVG TFGQKDVHGF ATRIVPEEYV PITKFVTDNG DSKASMVWEE 25740
AQQVSGKASM VWEEAQQVSG KASMVWEEAQ QVSGKASMVW EEAQQVSGKA SMVWEEAQQV 25800
SGKASMVWEE AQQVSGKAVS PSFEDVWSQP RAVSPSFEDV WSQPRAVSPS FEDVWSQPRA 25860
VSPSFEDVWS QPRAVSPSFE DVWSQPRDGA GQMFIPLNPN AYSPNTLNKD GAGQMFIPLN 25920
PNAYSPNTLN KHGGPNFEQL PINQPRHGGP NFEQLPINQP RHGGPNFEQL PINQPRHGGP 25980
NFEQLPINQP RLFSYLDTQL NRNNVIIQLN RNNVIIQLNR NNVIIQLNRS VTSGFVDGIK 26040
SVTSGFVDGI KAAALAELVW SGNRAELVWS GNRASNSLQY VNVQVKDAYS PHEIYSREYL 26100
VANGVQAQAL VPKGIMLDTG RGVQAQALVP KHIVGATAPL WGEQVDDINV SHIVGATAPL 26160
WGEQVDDINV SSMIFEQLEG MSLSKVIPEI DMPSHSSSGW KYNVMANPDA NTPNFNYGGN 26220
GGSWCAPYKT YEVVGNVYKD IEADLQHAET VWGALHAFLV MWEDIALSAD NAHDVPKAAA 26280
LAELVWSGNR AAALAELVWS GNRAAALAEL VWSGNRAAAL AELVWSGNRA SNSLQYVNVQ 26340
VKASNSLQYV NVQVKASNSL QYVNVQVKAS NSLQYVNVQV KDAYSPHEIY SRDAYSPHEI 26400
YSRDAYSPHE IYSRDAYSPH EIYSRDAYSP HEIYSRDAYS PHEIYSRDAY SPHEIYSREY 26460
LVANGVQAQA LVPKEYLVAN GVQAQALVPK EYLVANGVQA QALVPKGIML DTGRIFEQLE 26520
GMSLSKIFEQ LEGMSLSKIF EQLEGMSLSK IFEQLEGMSL SKTYEVVGNV YKYNVMANPD 26580
ANTPNFNYGG NGGSWCAPYK YNVMANPDAN TPNFNYGGNG GSWCAPYKYN VMANPDANTP 26640
NFNYGGNGGS WCAPYKYNVM ANPDANTPNF NYGGNGGSWC APYKATSGGT SAAAPVFAGL 26700
VGMLNDARAW YQESAVSKDF TDITAGSSIG CDGVNPQTGK GFPDVAAHSL TPRPDVAAHS 26760
LTPRPNSALP QVLSNSYGDE EQTVPEYYAK SALPQVLSNS YGDEEQTVPE YYAKSNSYGD 26820
EEQTVPEYYA KSYGDEEQTV PEYYAKYLDQ QITAETKAWY QESAVSKAWY QESAVSKAWY 26880
QESAVSKAWY QESAVSKGFP DVAAHSLTPR GFPDVAAHSL TPRGFPDVAA HSLTPRGFPD 26940
VAAHSLTPRG FPDVAAHSLT PRPDVAAHSL TPRSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKYLD 27000
QQITAETKYL DQQITAETKA NEQPTWVYRF FCPTDYLIDV RGTPSVLTEQ GLVKLGVPGN 27060
ELAIEIGSTG DYNARQGTPS VLTEQGLVKS LPLIVGNSDQ EGKTFQGTPS VLTEQGLVKY 27120
PVVQNPVTLA ESSCQSVFNP NIPKNPSAGP GWDQAKPTNG PLAKFQGTPS VLTEQGLVKA 27180
NEQPTWVYRA NEQPTWVYRG TPSVLTEQGL VKNPSAGPGW DQAKPTNGPL AKSLPLIVGN 27240
SDQEGKSLPL IVGNSDQEGK SLPLIVGNSD QEGKARNHGT STVAPQVQAS VYRASVDISN 27300
VDTYSSTEVA NDDSFQQVGK ATFLVWDQQR KASVDISNVD TYSSTEVAND DSFQQVGKNH 27360
GTSTVAPQVQ ASVYRSSTEV ANDDSFQQVG KTLYLTDTDA GVPMIDPRTV YAFDVSEDGS 27420
YLKVASNGYV ITGAGKARNH GTSTVAPQVQ ASVYRARNHG TSTVAPQVQA SVYRATFLVW 27480
DQQRATFLVW DQQRATFLVW DQQRKASVDI SNVDTYSSTE VANDDSFQQV GKTVYAFDVS 27540
EDGSYLKVAS NGYVITGAGK VASNGYVITG AGKIENQSDA DGYSSCSTLK LTGLTTLTTL 27600
SFAALTKSAS SLNSIGDTFK SDKLNVIDFP KSLNSIGDTF KVGSIEFTAL PQLQSLDFTK 27660
TVNGGFQIAR LNVIDFPKGQ LGFWGNKGTY SGDLQLNGVK LNVIDFPKSD KLNVIDFPKS 27720
DKLNVIDFPK TVNGGFQIAR TVNGGFQIAR AVGSDEWTVR LGITYTTYSK MTNDYISALT 27780
KSEMLAEQDK MTNDYISALT KSTITTPWKS VVENNNDGLT AAYRVAPNSG AYLNEADFRY 27840
FYGDNYATLR SGAYLNEADF RTAVGSDEWT VRLGITYTTY SKMTNDYISA LTKMTNDYIS 27900
ALTKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA 27960
EQDKMTNDYI SALTKSVVEN NNDGLTAAYR SVVENNNDGL TAAYRSVVEN NNDGLTAAYR 28020
SVVENNNDGL TAAYRETTMF VLQGFGASMA RLNALQGGRL VQNDFNTLLR QDILGGMVDS 28080
YTDPKTGETT QIHARYGLEA AVPLMYESTG LGLGDMTKVS VADVKIDYIG GGDLFRLVQN 28140
DFNTLLRQDI LGGMVDSYTD PKYGLEAAVP LMYESTGLGL GDMTKALEAY KVNGKAVDFS 28200
GHDEFQGKEP SNDPNPPETY SKFGATGDEY RSDYQECADA PGQKYIARPD IMKSTLPDLS 28260
EVIKVNGKEV GQFKSVDNFH LLTVYAVDFS GHDEFQGKFG ATGDEYRYIA RPDIMKFLDE 28320
ALTYPPPKGI QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKYFNVKNGD QSPPSALGPL 28380
PSVIERPSIN DDSVMIYAPA VRTDYSVCGE TTIFKTVDDE EGVAAQFKIA SAMLDEEDEK 28440
FLDEALTYPP PKFLDEALTY PPPKGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV 28500
MIYAPAVRIA SAMLDEEDEK IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKY FNVKNGDQSP 28560
PSALGPLPSV IERNGDQSPP SALGPLPSVI ERAGAVAAVV YNNEKHGIPG GGIATGAEGI 28620
KLVLGDAVPE SAAPMGLTPP TKSDKELVSS SAFQSHVKSF EGFPKRLVAH SVATYARIAD 28680
LGKEEYNHPT RAGAVAAVVY NNEKHGIPGG GIATGAEGIK HGIPGGGIAT GAEGIKLVLG 28740
DAVPESAAPM GLTPPTKLVL GDAVPESAAP MGLTPPTKLV LGDAVPESAA PMGLTPPTKS 28800
DKELVSSSAF QSHVKFTDTP VLYGPKKFTD TPVLYGPKML DDAGIYLITD LSSPSESINR 28860
QQLSFVMNQW YEKYGAYSVC SPKSDGQCSD LLKWDVDLYS RLITDLSSPS ESINRDLSSP 28920
SESINRKFTD TPVLYGPKKF TDTPVLYGPK QQLSFVMNQW YEKQQLSFVM NQWYEKCDVA 28980
TTDVYYSGKG GTPDFGPGRS KYTAEGYEAA TKVATIGSAT FARYCASAQE DNATLQALLR 29040
YTAEGYEAAT KYVDAGGFEP SIKSKYTAEG YEAATKVATI GSATFARVAT IGSATFARYV 29100
DAGGFEPSIK DADACNGGGI EYDSPADTPL EFKDNTCNAP IPVSFPVAPT DTKEISFNQA 29160
WLRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD MDGISSWLPT INGKVIANGN VAGNILVIAK 29220
SDVSDFKEAG LKDADACNGG GIEYDSPADT PLEFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDA 29280
DACNGGGIEY DSPADTPLEF KFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRANNYCSN QVEGPYSLYS 29340
GRVSIWTESY GGRYGPSFTA FFQEQNEKTV YDMAMEAWSK ISYKEPGICE TTPGVKSAGY 29400
APLKPGGCKD QIIECRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC SNQVEGPYSL YSGRANNYCS 29460
NQVEGPYSLY SGRISYKEPG ICETTPGVKV SIWTESYGGR AIMGAEEAAK TGGAMWPYRT 29520
LIPDVVGIFA GTPKFVTNMQ AALLKALSEM ILQSEKDYYA SMLQQPKANF EVETPRGITG 29580
TSIARANFEV ETPRDYYASM LQQPKFVTNM QAALLKFVTN MQAALLKTGG AMWPYRTGGA 29640
MWPYRAEDYL LNPSPKLSDL TGDTEYAQLS QKTDDQVSLF ETTIRTDSGF AGLTNVNAAN 29700
GGGRYDNQES FLFAEVLKIT GQEIYRAEDY LLNPSPKTDD QVSLFETTIR AGFAGDDAPR 29760
QEYDESGPSI VHRSYELPDG QVITIGNERV APEEHPVLLT EAPINPKDLT DYLMKIIAPP 29820
ERSYELPDGQ VITIGNERVA PEEHPVLLTE APINPKALLF GAAGSAEDPV VVKNVGFPVV 29880
TVAEDAASSS IKVYATPDQD IEHGRAVEQS LDAIRQGLLT VEDRGPLNEG GLYAERLSGQ 29940
DASAITWKLT GNLGGEDYQD KASPSYLTAT PRALMNGAGA IKDAGYETSI TDYWGRPTVY 30000
GFVPLEYVGS KTAFSDILAK TNTQVPDACT QCFQKMPMPL LVADGRTAFS DILAKAFPDV 30060
AAQGMNFAVY DKELYNIGDY QADANSGSKI AFASYLEEYA RLETIGDTFK QGLQDITLGA 30120
SIGCTGRAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KQGLQDITLG ASIGCTGRLV 30180
EGAAAGIVVA SPSKQGVLNN IGADGKSSSA YESLTSAVKA SALIAYGNSL ISSDKSVYGI 30240
NNGRPDYFYT WTRPDYFYTW TRSNPDYFYT WTRSNPDYFY TWTRSNPDYF YTWTRSNPDY 30300
FYTWTRSNPD YFYTWTRSNP DYFYTWTRFS VAEILPGAKN VVLDTTALSA NTKVGTIITG 30360
DPLDPPVLKY PAEVFLPGGT YQLGKADKET DIGSAIEKAS AIQLDGIIYR QLSGHVGPLT 30420
SSSSKETDIG SAIEKADKET DIGSAIEKQL SGHVGPLTSS SSKQLSGHVG PLTSSSSKIY 30480
SFFVGGAVPE NLRQTSSEQN PSLEEIQAAQ ATVLPHSPVS NVKSAGEYNT FSPEWPVPLT 30540
KTFDENDTYE IGNKSIDQFF NDAKVPTVLM SPWVGKDGQE ATFHFDRVDW SPSFRAAEVI 30600
NYYTPDHVPV FNAMSIDQFF NDAKNAFITN YPSEQRYDTA TFIDKRIDAT TNPGMRQLGL 30660
AMLGNKNMHD VIGNDGTVPS EFRIDATTNP GMRIDATTNP GMRNAFITNY PSEQRNAFIT 30720
NYPSEQRQLG LAMLGNKAQI TAVNLEARGD GGGGPTFEHL EKSMDNDNTS LLVFGKMGES 30780
VDDFFARAQI TAVNLEARMG ESVDDFFARG IVSGEGEESS DPVKVDNVVA SFKYMQQLLD 30840
QTKVVWQDSV RAQNDPNAFG VVAARDPNAF GVVAARNDPN AFGVVAARAA TYCPENIEKA 30900
QNDPNAFGVV AARAQNDPNA FGVVAARTIF GWDIAEGQKS AGYTPLKVNG VEYGETRSAG 30960
YTPLKVNGVE YGETRSAGYT PLKVNGVEYG ETRGGSILPM QEVALTTRWA SVIDATKKAT 31020
GDVLFNTKHT ADGAWAKGGS ILPMQEVALT TRGGSILPMQ EVALTTRWAS VIDATKDGLE 31080
GSFKWDNLDS AALNTKVEDG NLILTMPKVE DGNLILTMPK VEDGNLILTM PKWDNLDSAA 31140
LNTKWDNLDS AALNTKSAIS QYGDSFAKSQ SDFESEFSTA KVNAGIGIGP DDLVSFIKSA 31200
ISQYGDSFAK SQSDFESEFS TAKGFNIVVA PGLDGRHVDV PLTGEDEITI LAIHDEVSPV 31260
GDTDALLERA PVVQYALNRY LVDQLNPEGK AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 31320
DALLERAPVV QYALNRAPVV QYALNRDAEL TDAGVKQAQV AHDFWQKLNT GAVIPVLVRL 31380
GDLSANPIER VLPQVIEATN RIYVTGQSYA GRLGDLSANP IERVLPQVIE ATNRVLPQVI 31440
EATNRNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKTLGIDIA RGQTPLPILV ADGRTSTTLP 31500
EVCSKNNILE GPDVKGQTPL PILVADGRIN TAAYWKEAIA DVLEHLGEND EDIAVYAPNP 31560
FYKNSILEGP DVKMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNDDDF LNYGISSKSP VTSEYTSVRS 31620
IFEAANEKAI NDYIDSQLDK YLTNSQALAD LPYFAEKGVQ ISTNIPKGVQ ISTNIPKEII 31680
STYSIDGLRS VYQTMTDRYN TDAELYKGGS ELGFRSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 31740
LPEPVQALTK AGSSPTDIIS GISDKTDALD SAIKYDYENV DSDGANKYNL SNGAPAPETV 31800
TNKSMPTSGA VDLVAKCSSH DDCSDELACT DGVCACTADS AVTCSWEGHC AGAKGDNPSI 31860
LGLRCTADSA VTCSWEGHCA GAKDSPNWDV DSDALPAIPE GAKTLADFDA LKTLADFDAL 31920
KINPGPLARL YPDDNLAFIQ AGISDEKLYT GEVFKTDEGK GQEPPAAIVE VQKVAIIDGL 31980
ADPWRSVNIV NYTPSDSYTY SDNSGSWQSV KVTTGGQGAE FTLAKDQTTW SVDGNVVRVT 32040
TGGQGAEFTL AKVTTGGQGA EFTLAKAGQF PISANDGATS TKEAASAALA AGYKQTYTSC 32100
NPLKKTLNYA DALDGENYPQ TPSRVAVAGY DDTTGGVGPL LAQKINPSSG LLEPQTPLAV 32160
SPGSGPRVAV AGYDDTTGGV GPLLAQKTTG AFDESGPPLS QKNALQTMYD TQDKAALDAL 32220
QQSIYLQPKF SDGNGLFYQY ERLGAEVVTA GRIYAVADTQ ERLINQVELS EDKAVITDIV 32280
NQQRAVITDI VNQQRGENIL SAPLITYAPA GPELDEKELG FTAVGGEGKD IQYLENYQGQ 32340
GYSGPAVKIL QYAQGRDYSN NWESGALKDD YMPFIEVPRE AAEIDSHWER TIPIDNDVDY 32400
VVTGYRVYWV DSGPRTGDGV NDAPSLKDGQ EQEILARADA IVAAIRSALI AFEKNINMLL 32460
YGTDDCSGKG MVFSIDAQGE KTGTDQASVG YYKDAVYALD AIYGIDARDN ILPENLDDGL 32520
PSQFVYEKIL VENLQDQTAK ILVENLQDQT AKAEPYVTGS SAASGSNFVA DFAEAGTDGK 32580
QISYWAFTTP AVKFEPPAVY NDELKDAEEE PYDWSNEGRL SDELEDDNAP IGFETTKDQE 32640
MAVAAFRTSD DFASQMDGRC MGCDSTSIDV SRCMGCDSTS IDVSRDASGG DQITEWQDIY 32700
LPPITKGIQD AGVIATAKGV GSDAWTVSES GRGIDGDKGL VVKDLYGNIV MSGGSTLYPG 32760
IADRAGFAGD DAPRQEYDES GPSIVHRSYE LPDGQVITIG NERSYELPDG QVITIGNERL 32820
SGGVAVIKTT AVLFDEGKIG GSAGTELQSD KDLALVDPGL ELSYNTKLVG GSDFGEDEAK 32880
TLSTNEEGYE TSAVRASYGA GVTIQDRSAY VVYDLSNNEI SLANTKVPYL IGANTDEGTS 32940
FAIRLPVEAF QALASSTSET KDAGNAATND PLFPFSRAAL PGTEVLFADS VAKVTSAQYY 33000
VNPKIQAFVI YPENFDKVGA GVNVGELYAF ADKALTQYSV KTTYNVVAQT KTYANLPQAL 33060
VNSGAIKVIP LQGCDADEYG RDNIQGITKP AIRLANAYTW EGGRYQGASQ CPFRTMGVGY 33120
ATNDDSTIRC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG HCKLILPGEL AK 33172

Claims (10)

1.含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质，其特征在于：所述含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质为黄曲霉产毒菌裂解液或者黄曲霉产毒菌裂解液干物质，由黄曲霉产毒菌制备获得，黄曲霉产毒菌产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01，黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质通过检测标定其中预警分子AFT-YJFZ01的含量，作为参考物质使用。
2.权利要求1所述的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质的制备方法，其特征在于：将产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐，然后再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质，最后通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法标定黄曲霉产毒菌裂解液或者黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量。
3.权利要求1所述的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量检测中的应用。
4.一种样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量的检测方法，其特征在于：以权利要求1所述的黄曲霉产毒菌参考物质建立标准曲线，测定样品中黄曲霉产毒菌参考物质含量，然后结合黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的黄曲霉毒素预警分子标定含量，用于黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量的检测，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：标定黄曲霉产毒菌参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量为通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01检测方法标定黄曲霉产毒菌裂解液或者黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZ01含量，具体的过程为：
a制备黄曲霉产毒菌参考物质溶液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度；
用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，得到黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的浓度，标定黄曲霉产毒菌参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：其使用的检测方法为间接非竞争双抗体夹心ELISA法，荧光免疫层析法或其他可以达到检测目的的方法；
所述间接非竞争双抗体夹心ELISA法为：
a制备待测样品待测液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度；
以系列浓度的黄曲霉产毒菌参考物质替换待测液，用于制作标准曲线，用于计算得到待测样品中黄曲霉产毒菌参考物质的含量，计算得到待测样品中黄曲霉产毒菌参考物质的含量，进一步结合黄曲霉产毒菌参考物质中AFT-YJFZ01的黄曲霉毒素预警分子标定含量，得到样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量；
所述的荧光免疫层析法为：
提供黄曲霉毒素风险预警智能感知卡，包括黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
用上述黄曲霉毒素风险预警智能感知卡测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZ01含量，具体方法为：样品垫上装载有信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体时，将待测样品待测液加到黄曲霉毒素风险预警智能感知卡的样品垫上，反应一段时间，读取分析结果；
样品垫上没有装载信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，将待测样品待测液加到信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体中，然后将黄曲霉毒素风险预警智能感知卡插入待测样品待测液中，反应一段时间，读取分析结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的信号材料是指常规的铕乳胶微球、金纳米颗粒以及其他可达到类似效果的标记材料，均可通过商业购买获得。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，是指信号材料通过常规标记方法与黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体发生偶联以后的产物。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的样品为农田土壤、农产品、饲料。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：根据黄曲霉产毒菌参考物质含量预警黄曲霉毒素污染风险水平，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在1.0mg/g以下时属于低风险区域，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质在7.0mg/g以上时属于高风险区域。
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