CN1731182A

CN1731182A - 氯霉素亲和柱及其制备方法和用途

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Publication number: CN1731182A
Application number: CN 200510086345
Authority: CN
Inventors: 张珙; 王家红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-09-02
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2006-02-08
Anticipated expiration: 2025-09-02
Also published as: CN1323295C

Abstract

本发明涉及一种氯霉素亲和柱及其制备方法和用途，其采用蛋白A琼脂糖凝胶(protein A－Sepharose 4 fast flow)作为固相载体，载体上的蛋白A与氯霉素抗体相偶联，偶联后的氯霉素抗体又与固定相化学键合，该亲和柱制备方法简单，可重复使用的，提高了富集和净化的效率，从而提高了方法的灵敏度，理论上可以适用多种基质，由于使用了蛋白A，所以只有IgG可以联结，偶联的特意性高，柱子的氯霉素负载量大，即使使用纯溶剂也可以多次重复使用。

Description

氯霉素亲和柱及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种采用蛋白A琼脂糖凝胶(protein A-Sepharose 4 fastflow)作为固相载体，与氯霉素的多克隆抗体(兔)相偶联制备可重复使用的氯霉素亲和柱及其制备方法和用途，代替样品前处理中传统的固相萃取技术净化样品，提高富集和净化的效率。

背景技术

氯霉素由于其具有疗效好、价格低廉等优点，曾经广泛应用于各类家禽、家畜、水产品及蜂制品疾病的控制和治疗。但氯霉素同时存在严重的副作用，尤其是非剂量依赖的引起不可逆的再生障碍性贫血，引起了国际组织和各国的高度重视，纷纷制定严格的计划进行控制。鉴于此，包括我国在内的许多国家都对动物性食品中氯霉素的残留作了严格的限制，规定不得检出。氯霉素的残留同时也成为国际贸易中的技术壁垒，检测的限量标准一降再降，欧盟的现行标准为0.3μg/Kg。目前，氯霉素的筛选方法较多的是采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，确证主要采用液相色谱-质谱联用(LC/MS/MS)和气相色谱-质谱联用(GC/MS)。在仪器测定中，往往需要复杂的样品净化技术。传统的净化技术包括液液萃取、基质固相分散和固相萃取等。液液萃取的净化方式，一般首先用乙酸乙酯提取浓缩后，用0.4％的氯化钠溶液溶解，再采用正己烷液液萃取除掉油脂，之后用乙酸乙酯反萃取进行浓缩，之后进行分析，该种净化方式测定的检测限不低于10μg/Kg，不能满足目前的检出要求；为了追求高的灵敏度，还需要进一步的净化，通常的方式是采取C₁₈柱或类似其它的固相萃取柱净化，有的报道采用两根以上的固相萃取柱连续净化，可以达到检测要求，但是由于基质的差异，针对不同的样品往往需要采用不同的净化方式以除去不同性质的干扰物质；有研究使用氯霉素抗体与凝胶固相载体相联制备亲和层析柱，该方法特意性高，净化富集的效果好，目前已有产品上市，但是目前的偶联方式是采用抗体通过CNBr与凝胶固相载体联结，这种方式决定了其对抗体的纯度要求较高，否则杂蛋白的存在会影响测定结果、同时影响了柱的氯霉素负载量，而且可重复使用的次数有限，有些开发为一次性的亲和层析柱，这样成本较一般的固相萃取柱成本高出很多，而可以重复使用的产品对于溶剂的使用要求严格，一般禁止使用纯溶剂，这样就存在洗脱残留造成的假阳性结果。

发明内容

本发明的目的是采用蛋白A琼脂糖凝胶(protein A-Sepharose 4fast flow)作为固相载体，与经过硫酸铵盐析纯化的氯霉素多克隆抗体(兔抗)相偶联制备可重复使用的亲和层析柱，代替样品前处理中传统的固相萃取技术净化样品，提高富集和净化的效率，提高方法的灵敏度，同时该亲和层析柱理论上可以适用多种基质。本发明的技术方案如下：

亲和柱的制备：

(1)将氯霉素多克隆免疫血清抗体经过硫酸铵分级沉淀纯化后和0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液混合；

(2)将蛋白A琼脂糖凝胶与0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液混合；

(3)将(1)与(2)混合，室温，振荡1-3小时，蛋白A琼脂糖凝胶：氯霉素多克隆免疫血清抗体：0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液按体积1∶1∶3配比；

(4)待氯霉素多克隆免疫血清抗体与蛋白A琼脂糖凝胶特意性结合后，分别用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液和0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液洗去未结合的抗体和其它的杂蛋白；

(5)然后加入0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液和二甲基庚二酸酯(DMP)，室温，振荡1-2小时，三乙醇胺溶液∶氯霉素多克隆免疫血清抗体∶蛋白A琼脂糖凝胶按体积1∶1∶1配比，三乙醇胺溶液∶二甲基庚二酸酯按1ml∶5mg配比；

(6)用0.02mol/L，pH7.4的乙醇胺溶液终止联接反应后，换含0.01％柳硫汞钠的0.01mol/L，pH7.4，磷酸盐缓冲液置换柱内液体，装柱，0.25ml/柱，4℃保存。

氯霉素免疫亲和柱的使用方法：

将制备好的氯霉素免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，室温中放置2小时使用。

上样：放掉柱内溶液，分别用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)和0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；将提取的样品用0.3M，pH8.0的磷酸钾缓冲液溶解、上样；

淋洗溶液：依次用水和甲醇-水，甲醇∶水＝20∶80淋洗柱床、弃去；

洗脱溶液：用100％甲醇洗脱用于测定；

活化再生：100％甲醇淋洗，用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)活化再生；

保存条件：用含0.01％柳硫汞钠的0.01mol/L，pH7.4，磷酸盐缓冲液置换柱内液体，4℃保存，以待重复使用。

适用范围：可用于蜂蜜、水产、动物组织氯霉素残留的测定以及饲料、血液和尿样当中氯霉素的测定。

亲和柱性能的评价：包括柱容量、柱空白、柱回收、柱重复性和稳定性。柱容量：采用过量的氯霉素通过亲和柱，测定柱内的氯霉素决定其柱容量。柱空白：选择经过柱容量测定的亲和柱，采用上样溶液通过亲和柱，经过淋洗、洗脱后测定洗脱液中的氯霉素。柱回收：20ng氯霉素通过亲和柱，经过淋洗、洗脱后测定洗脱液中的氯霉素。柱重复性和稳定性：以测定食品实际样品的结果来表示。氯霉素的含量通过N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1)衍生，然后采用GC-MS/MS进行测定。氯霉素的衍生原理、衍生物的全扫描质谱图和二级质谱图分别见图1、图2和图3。

柱容量：将制备好的氯霉素免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，室温中放置2小时进行测试。放掉柱内溶液，分别用10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；0.3M磷酸钾缓冲液10ml，加入54ng氯霉素标准，混匀，上样；自然流速收集上样溶液；再分别用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗弃去，2ml甲醇洗脱并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，换液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的内标(d₅-氯霉素)；收集的上样溶液用乙酸乙酯40ml萃取并浓缩，最终各收集管用氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同标准一起在75℃反应30分钟进行衍生，氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，进行GC-MS分析。标准系列取不同浓度Cap系列标准溶液及50μL，100μg/L d₅-Cap内标溶液(100μg/L，50μg/L，20μg/L，10μg/L，5μg/L，2μg/L)，N₂流下吹干，同上述衍生操作步骤。

GC-MS分析条件：

色谱条件：载气：高纯氦气；恒压：10psi；进样口温度260℃；初始柱温150℃，保持1min，20℃/min升至270℃，保持5min。传输线温度：250℃；进样方式：不分流进样1μL。

质谱参数：灯丝电流：50μA，离子化方式：电子轰击源，离子制备：多反应监测(MRM)；溶剂延迟：8.5min；阱温：220℃；倍增器补偿电压：250V；扫描时间：0.4s；最大离子化时间：65000μs；阱内目标离子数：5000counts；预扫描时间：1500μs；碰撞诱导电位：0.4V。Cap及d₅-Cap监测离子分别为：m/z 225＞208、178、m/z 230＞213。

定量计算

以各系列标准溶液的进样量(ng)与对应的氯霉素(m/z 208)和内标(m/z 213)的峰面积比进行线性回归计算，得出线性方程为：

按下式用内标法计算样品中AA的含量。

X = \frac{A \times m 2}{m 1 \times m 3}

X-试样中AA含量，μg/kg；

A-试样色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的氯霉素质量，ng；

m1-取样量，g；

m2-标准溶液中标的质量，ng；

m3-样品中内标的质量，ng。

计算结果保留三位有效数字。

柱容量的测定结果见表1，由表1可以看出该免疫亲和柱的柱容量不小于45ng。对于氯霉素的检测，各国的规定均＜1μg/Kg，所以该亲和柱的柱容量完全满足样品分析的容量要求。亲和柱的制备日期为2004-10-18，截止2005-3-14共5个月的保存时间，重复使用次数不小于40次的情况下，其柱容量不低于40ng，而对于氯霉素残留的检测，10ng的柱容量已经足够。

表1柱容量测定结果

柱号	上样液含量(ng)	洗脱液含量(ng)
柱号	上样液含量(ng)	洗脱液含量(ng)	12	6.4ND	47.455.8

柱空白：测试过程同柱容量，不同处为1)不上标准；2)只收集洗脱液(2ml甲醇)柱空白的测定为ND，其色谱图见图4，该方法的检出限为2pg，定容体积为100μl，则柱空白不大于200pg。

柱回收：测试过程同柱容量，不同处为1)将标准量改为20ng，因为考虑到各国制定的标准均＜1μg/Kg，而目前测定方法的取样量一般≤10g；2)只收集洗脱液(2ml甲醇)。

柱回收结果：同一根亲和柱测定四次结果为85-96％之间。结果显示亲和柱的回收率可以满足分析方法的要求。

重复性和稳定性

亲和柱的重复性和稳定性以测定食品中基质复杂的蜂蜜样品的加标回收来表示，加标的水平分别为0.1、0.3和1.0μg/Kg。

提取：称取蜂蜜样品5g，加入10ml超纯水，振荡溶解；加入25ml乙酸乙酯振荡提取30分钟，3500rpm离心5分钟，滴管转移上层有机相，重复乙酸乙酯提取过程合并有机相；加入5ml 0.3M磷酸钾缓冲液，45℃减压旋转蒸发至瓶口出现水雾；蒸发残留物溶解在10ml0.3M磷酸钾缓冲液中过亲和柱。

净化及GC-MS测定见柱容量。

重复性和稳定性实验结果：蜂蜜样品的加标结果见表2，测定的三个水平的回收率在80-90％之间，RSD在0.1μg/Kg水平为14.4％，其余两个水平均小于10％。结果表明该方法测定蜂蜜中的氯霉素可以满足分析方法的要求。蜂蜜的空白样品含量＜0.1μg/Kg，将取样量扩大到10g平行测定6次，结果为0.05±0.01，RSD20％。亲和柱蜂蜜样品0.1μg/Kg加标的质量色谱图见图5，其信噪比为8-14，达到定量检出的要求，m/z 208和178丰度比分别为100％、13％，与标准的丰度相比比误差＜20％，满足分析要求。

表2蜂蜜样品的加标结果

加标水平(μg/Kg)	加标前含量(μg/Kg)	测定均值(μg/Kg)	回收率(％)	RSD(％)
加标水平(μg/Kg)	加标前含量(μg/Kg)	测定均值(μg/Kg)	回收率(％)	RSD(％)	0.1(n＝5)0.3(n＝6)1.0(n＝6)	0.050.050.05	0.13750.3030.948	87.584.289.8	14.45.97.9

与C₁₈柱净化结果的比较：

以目前最常用Sep-pak C₁₈柱净化蜂蜜样品进行二者净化效果的比对，加标的水平分别为0.1μg/Kg和0.3μg/Kg

提取过程类似亲和柱，但将内标在提取前加入，并将最终的定溶液改为4mL乙腈/水(5/95，V/V)

净化：先按下述过程活化Sep-pak C₁₈柱：依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、10mL水淋洗。将样品提取液上活化后的SPEC₁₈柱，用5mL乙腈/水(5/95)淋洗后，用3mL乙腈/乙酸乙酯(98/2)洗脱，收集洗脱液，在N₂流下吹干。

衍生和测定同亲和柱。

Sep-pak C₁₈柱的测定结果为加标水平为0.3μg/Kg(n＝6)时，回收率111％±1.06，RSD为6.98％。加标水平为0.1μg/Kg时，其信噪比只有3-5，不足以达到定量检出的要求。比较二者0.3μg/Kg的加标结果，回收率和RSD没有显著性差别，二者的质量色谱图均没有杂峰干扰，但背景的离子化时间有明显的区别，而离子化时间与阱中的离子数成反比反应了背景的干净程度它，离子化时间越长说明背景越干净。亲和柱净化的样品背景的离子化时间均不小于45000μs，Sep-pak C₁₈柱净化的样品背景的离子化时间均不大于20000μs。说明亲和层析柱净化效果优于C₁₈柱，虽然在测定蜂蜜时0.3μg/KKg的加标水平下两种处理方式均能满足分析要求，但在0.1μg/Kg加标水平下测定结果明显优于C₁₈，而且可以预测面对基质更复杂的样品相对于C₁₈柱本方法会有更好的净化效果。

该亲和层析柱提高了富集和净化的效率，从而提高了方法的灵敏度，理论上可以适用多种基质，该技术由于使用了蛋白A所以只有IgG可以联结，偶联的特意性高，柱子的氯霉素负载量大，即使使用纯溶剂也可以多次重复使用。

附图说明

图1氯霉素衍生原理

图2氯霉素衍生物的全扫描质谱图

图3氯霉素衍生物MS/MS质谱图

图4柱空白的质量色谱图

图5亲和柱蜂蜜样品0.1μg/Kg加标的质量色谱图

具体实施方式

实施例1

本实施例是氯霉素免疫亲和柱的制备。

所用试剂

氯霉素多克隆抗体：BSA-琥珀氯霉素免疫家兔，免疫血清经过硫酸铵沉淀纯化(蛋白浓度5mg/ml)；蛋白A琼脂糖凝胶(PharmaciaBiotech)；二甲基庚二酸酯(Pierce Bitochnology，DMP)；甲醇、乙醇胺、三乙醇胺、柳硫汞钠、NaCL、KCL、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O。

缓冲液的配置

0.3M磷酸钾缓冲液，pH8.0：64.8g K₂HPO₄·3H₂O，蒸馏水溶解定容至1000ml，磷酸调节pH8.2；0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)：NaCL 8.00g，KCL 0.2g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，蒸馏水溶解定容至1000ml；含0.01％柳硫汞钠的磷酸盐缓冲液(PBS-0.01％)；0.2mol/L三乙醇胺溶液(pH8.2)：三乙醇胺5.968g蒸馏水溶解定容至200ml，磷酸调节pH8.2；0.02mol/L乙醇胺溶液(pH7.4)：用0.2mol/L三乙醇胺溶液新鲜配置。

亲和柱的制备：

取1ml蛋白A琼脂糖凝胶微珠，3000rpm离心2分钟，倒掉上清，加入2ml PBS轻轻混匀后3000rpm离心2分钟，倒掉上清夜，重复两次；加入氯霉素抗体1ml和1ml PBS室温振荡2小时；PBS洗三遍，每次2ml，三乙醇胺溶液洗两遍，每次2ml；3000rpm离心2分钟，倒掉上清，加入1ml三乙醇胺溶液和5mgDMP，室温振荡1小时；3000rpm离心2分钟，倒掉上清，乙醇胺溶液洗两遍，换液PBS-0.01％；装柱，0.25ml/柱，4℃保存。

氯霉素免疫亲和柱用于蜂蜜、水产、动物组织氯霉素残留的测定以及饲料、血液和尿样当中氯霉素的测定。

上样：放掉柱内溶液，分别用10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；将提取的样品用10ml0.3M磷酸钾缓冲液(pH8.0)溶解、上样。

淋洗溶液：依次1ml水和2ml甲醇-水(甲醇∶水＝20∶80)淋洗柱床、弃去；

洗脱溶液：2ml100％甲醇洗脱用于测定；

活化再生：4ml100％甲醇淋洗，用10ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)活化再生；

保存条件：0.01％柳硫汞钠的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。

实施例2

用实施例1所述的方法制备氯霉素免疫亲和柱，重复使用亲和柱，测定食品中基质复杂的蜂蜜样品的加标回收，加标的水平分别为0.1、0.3和1.0μg/Kg。

净化：将制备好的氯霉素免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，室温中放置2小时后进行测定。放掉柱内溶液，分别用10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；样品提取物上样；自然流速，弃取上样溶液；再分别用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗弃去，2ml甲醇洗脱并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，换液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的内标(d₅-氯霉素)；最终用氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同标准一起在75℃反应30分钟进行衍生，氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：

蜂蜜样品的加标结果见表2，测定的三个水平的回收率在80-90％之间，RSD在0.1μg/Kg水平为14.4％，其余两个水平均小于10％。结果表明该方法测定蜂蜜中的氯霉素可以满足分析方法的要求。蜂蜜的空白样品含量＜0.1μg/Kg，将取样量扩大到10g平行测定6次，结果为0.05±0.01，RSD20％。亲和柱蜂蜜样品0.1μg/Kg加标的质量色谱图见图5，其信噪比为8-14，达到定量检出的要求，m/z 208和178丰度比分别为100％、13％，与标准的丰度相比比误差＜20％，满足分析要求。另外，使用上述方法参加了2005年3月英国中心实验室组织的FAPAS蜂蜜样品的分析质量考核，测定结果为0.56μg/Kg，全世界共有30多家实验室参加考核，英国中心实验室统计的均值为0.54μg/Kg，我们的测定结果相当准确，z评分为0.2。(z评分≤1，成绩优秀；1＜z评分≤2，成绩良好；2＜z评分≤3，测定结果可疑；z评分＞3，测定结果无效)。

实施例3

用实施例1所述的方法制备氯霉素免疫亲和柱，测定虾仁样品的加标回收来，加标的水平分别为0.1、0.3和1.0μg/Kg。

提取：称取空白虾仁样品5g，加入氯霉素标准，加入10ml超纯水，振荡溶解；加入25ml乙酸乙酯振荡提取30分钟，3500rpm离心5分钟，滴管转移上层有机相，重复乙酸乙酯提取过程合并有机相；加入5ml 0.3M磷酸钾缓冲液，45℃减压旋转蒸发至瓶口出现水雾；蒸发残留物溶解在10ml 0.3M磷酸钾缓冲液中，再用分别用2ml正己烷液液萃取2次去除脂肪后备用。

净化：将制备好的氯霉素免疫亲和柱从4℃冰箱中取出，室温中放置2小时后进行测定。放掉柱内溶液，分别用10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；样品提取物上样；自然流速，弃取上样溶液；再分别用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗弃去，2ml甲醇洗脱并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，换液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的内标(d₅-氯霉素)；最终用氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同标准一起在75℃反应30分钟进行衍生，氮气吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，进行GC-MS分析。其余过程见实施例2

测定的三个水平的回收率在80-90％之间，RSD在0.1μg/Kg水平小于20％，其余两个水平均小于10％。结果表明该方法测定虾仁中的氯霉素可以满足分析方法的要求。

Claims

1.一种氯霉素亲和柱的制备方法，其特征在于：

(2)将蛋白A琼脂糖凝胶与0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液混合；

(3)将(1)与(2)混合，室温，振荡1-3小时，蛋白A琼脂糖凝胶∶氯霉素多克隆免疫血清抗体∶0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液按体积1∶1∶3配比；

2.根据权利要求1所述的氯霉素亲和柱的制备方法制备的氯霉素亲和柱，其特征在于：由蛋白A琼脂糖凝胶(protein A-Sepharose 4 fastflow)作为固相载体，载体上的蛋白A与氯霉素抗体相偶联，偶联后的氯霉素抗体又与固定相化学键合。

3.根据权利要求2所述的氯霉素亲和柱的用途，其特征在于：用于蜂蜜、水产或动物组织氯霉素残留的测定及饲料、血液或尿样当中氯霉素的测定。

4.根据权利要求2所述的氯霉素亲和柱的使用方法，其特征在于：

(1)放掉柱内溶液，分别用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)和0.3M磷酸钾缓冲液淋洗柱床；

(2)将提取的样品用0.3M，pH8.0的磷酸钾缓冲液溶解、上样；

(3)淋洗溶液：依次用水和甲醇-水，甲醇∶水＝20∶80淋洗柱床、弃去；

(4)洗脱溶液：用100％甲醇作为洗脱溶剂洗脱并测定洗脱液；

(5)活化再生：100％甲醇淋洗，用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)活化再生；

(6)保存条件：用含0.01％柳硫汞钠的0.01mol/L，pH7.4，磷酸盐缓冲液置换柱内液体，4℃保存，以待重复使用。