CN110606881A - 人体液中抗mog自身抗体的检测材料、制备方法及应用 - Google Patents

人体液中抗mog自身抗体的检测材料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人体液中抗MOG自身抗体的检测材料、制备方法及应用，本发明将MOG抗原包被于NC膜上制成抗MOG受体检测材料，人血清和脑脊液中的特异性MOG抗体会与抗原结合，利用碱性磷酸酶底物‑配体反应进行显色，并在显色反应中加入本发明的封闭材料，可用通过肉眼观察直接判断检测样品中是否含有MOG抗体。该方法具有灵敏度高，操作简便，快速检测等优点，有助于抗MOG受体脑炎的识别和诊断。

Description

人体液中抗MOG自身抗体的检测材料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人体液中抗MOG自身抗体的检测材料、制备方法及应用。
背景技术
抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)脑炎是一种神经系统自身免疫病。据MOG脑炎国际诊断共识(简称国际共识)，基于免疫学、神经病理学、血清学及人群研究各方面证据表明，MOG脑炎是区别于经典MS和AQP4-IgG阳性的视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的一种独立疾病实体，现被称为MOG-IgG阳性相关脑脊髓炎(MOG-IgG-associated encephalo myel-itis，MOG-EM)。现有的血清MOG-IgG检测方法中，使用线性化或变性MOG肽作为抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中的MOG-IgG，结果表明MOG抗体与多发性硬化(MS)有相关性，但近来新一代基于细胞的检测方法中，用全长、构象完整的MOG抗原检测自身MOG-IgG抗体，结果表明血清MOG-IgG阳性的患者与视神经炎(ON)(多为复发性)、脊髓炎、脑干脑炎以及急性播散性脑脊髓炎(ADEM)样表现等密切相关，而非经典的MS。2018版MOG脑炎国际共识，将通过使用全长人类MOG蛋白作为靶抗原的基于细胞的测定法检测到的MOG-IgG血清阳性作为MOG脑炎诊断标准之一。
目前，以完整、具有空间构象的MOG蛋白作为抗原的检测方法主要为基于细胞的检测方法(cell-Based assay，CBA)，包括免疫荧光法和流式细胞法，但此类检测方法的主要缺陷在于耗时长、操作复杂、需特殊仪器、抗体需求量大、成本高、及灵敏度不高，利用这些方法很难一次性对大批量样本同时检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种对MOG自身抗体进行检测的检测材料、该材料的制备方法及应用，解决现有的检测方法检测耗时长、步骤繁琐、抗体需求量大、成本高、灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，获取MOG的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-MOG；
其中，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0O ri序列、RSV启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；
步骤2，将重组质粒载体17T2A-MOG转染入293T细胞中，得到17T2A-MOG-293T细胞；
步骤3，使用免疫亲和层析法提取17T2A-MOG-293T细胞中的膜蛋白-细胞膜复合物；
步骤4，将步骤3提取得到的MOG抗原固化在载体膜上，得到人体液中抗MOG自身抗体的检测材料。
具体的，所述的步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得MOG的CDS序列作为目的基因，在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为17T2A-MOG；
步骤1.3：对重组质粒17T2A-MOG进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒载体17T2A-MOG。
优选的，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将17T2A-MOG转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
具体的，所述的步骤3具体包括以下步骤：
步骤3.1，将预处理后的凝胶微珠与等体积的抗MOG一抗偶联混合，置于4℃缓慢颠倒混匀1h，14000rpm、4℃、1min离心，弃上清；加入500μl由1XPBS和0.1％～1％BSA组成的稀释液中，置于4℃缓慢颠倒混匀5min，3000rpm、4℃、1min离心，弃上清；
步骤3.2，将偶联产物加入封闭溶液中，其中，封闭溶液为20～25mmol/L的DMP和0.1～0.5mol/L的三乙醇胺溶液按照体积比为1:1的混合溶液；
步骤3.3，将封闭后产物与MOG粗蛋白溶液混合，室温环境下缓慢颠倒混匀1～2h，3000rpm、4℃、5～8min离心，弃上清；加入200μl的1XPBS洗涤2次，3000rpm、4℃、5-8min离心，弃上清；
步骤3.4，在沉淀中加入80～100μl洗脱液，室温缓慢摇晃5～10min，3000rpm、4℃、5～8min离心，收上清，所得上清液即为膜蛋白-细胞膜复合物。
优选的，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
本发明还公开了上述制备方法制备的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从17T2A-MOG-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
本发明还公开了上述人体液中抗MOG自身抗体的检测材料用于检测样品中的MOG抗体。
具体的，检测样品中的MOG抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至6任一项所述的抗MOG自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤后加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色；
其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的17T2A-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入蔗糖与葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明选用改造后的慢病毒载体17T2A，利用病毒表达系统将MOG蛋白表达于293T细胞膜上，该载体不包含荧光基因，更大限度的减少了载体的大小，更有助于目的基因的表达。同时本发明利用复合提取液提取MOG蛋白-细胞膜复合物，获得了结构更完整的MOG蛋白-细胞膜复合物。因此，本发明制备方法可获得浓度更高的MOG蛋白-细胞膜复合物，用本发明的检测材料检测体液中MOG抗体，具有更高的灵敏性和特异性。
(2)目前的MOG抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、流式细胞术、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法，其中间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹法均均有操作复杂，操作技巧强(需专业人士或有经验人士操作)，且检测时长较长(需两天)；酶联免疫吸附法与流式细胞术检测成本高，同时需要特殊设备及需要有经验人士操作。而本发明的检测方法具有操作简单，不需要专业的设备辅助，且检测周期短，整个实验流程仅需1小时左右。
(3)本发明在检测过程中单独制备了封闭材料，该封闭材料来源于与检测材料同源的对照细胞，将该封闭材料应用于MOG抗体的检测能有效的降低杂质蛋白带来的污染，增加检测灵敏度，强阳性血清稀释千倍以上，中等强度阳性血清稀释百倍以上倍，弱阳性血清稀释10倍以上，仍可检测出抗体。
附图说明
图1是本发明制备的检测材料用于检测样品时的显色反应检测过程。
图2是本发明的17T2A质粒载体图谱。
图3是实施例1的提取物的检测结果图。
图4是实施例3的检测结果，其中，图4a为检测材料的示意图，其中A区域包被MOG细胞膜复合物，B区域包被对照细胞膜复合物；图4b为阳性判读结果；图4c为阴性判读结果；图4d为阴性判读结果。
图5是实施例3和对比例1获得的检测结果。
图6是实施例3和对比例2获得的检测结果。
图7是实施例3和对比例3获得的检测结果。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是以下实施例仅是本发明的较佳实施例，本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明下列实施例中的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体购于SBI公司，293T细胞购买于ATCC公司，PLP1质粒、PLP2质粒、PMDG质粒均购于SBI公司，所使用的载体膜如NC膜、PVDF膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫等均购买于MILLIPORE公司。
实施例1
步骤1，质粒构建：获取MOG的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-MOG，测序正确后提取质粒进行后续实验，本实施例的质粒载体构建具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过PCR方法(也可选人工合成法)获得MOG的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为17T2A-MOG；
其中，17T2A质粒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体的基础上删除copGFP元件，同时以T2A元件替换FE1启动子，改造后的质粒载体图谱如图2所示。具体的，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0Ori序列、RSV启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；
其中，17T2A质粒载体的制备步骤为：
(1)合成引物从pCDH-CMV-MCS-T2A-puromycin载体扩增获得NotI-T2A-puromycin-SalI片段，将PCR产物使用NotI和SaLI酶进行双酶切。
(2)pCDH-CMV-MCS-EF1a-copGFP载体通过NotI和SalI双酶切去除EF1a-copGFP。(3)将NotI-T2A-puromycin-SalI连入酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1a-copGFP载体，获得17-T2A。
步骤1.3：对重组质粒17T2A-MOG进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种(即17T2A载体)扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体17T2A-MOG。
在本实施例中，取17T2A质粒的甘油菌种接种于氨苄青霉素抗性的3mLLB液体培养基，置37℃恒温培养箱，220r/min，过夜摇菌。第二日吸取菌液500μL保存菌种，剩余2.5mL菌液用质粒小提试剂盒提取，测浓度。
17T2A载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，SalI、NotI酶各1μL，10x酶切Buffer 5μL，ddH2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng 17T2A载体，200ngMOG基因片段，T4连接酶1μL，ddH2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌DH5α中进行同源重组，涂布于氨苄青霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于氨苄青霉素(25ug/ml)液体LB培养基，37℃过夜培养。次日，各管吸取500μL菌液，-20℃保存，剩余菌液质粒小提，酶切鉴定正确的菌株送测序再次鉴定。测序鉴定正确的菌株留取菌种，-80℃保存。
测序正确的带有目的基因菌种及载体菌种扩大培养进行质粒大提，测浓度。最终得到重组质粒载体17T2A-MOG。
步骤2，慢病毒的扩增及感染：
将重组质粒载体17T2A-MOG转染入293T细胞中，得到慢病毒17T2A-MOG-293T细胞，同时，该步骤还同时设置有对照组17T2A质粒(PS)的扩增及感染，具体包括以下步骤：
步骤2.1，293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，将293T细胞培养加入高糖培养基中，待细胞融合至90％按1:5传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
慢病毒包装：待T-25培养瓶中293细胞长至培养皿底面积70％～80％，更换无血清DMEM高糖培养基继续培养2h，取步骤1得到的17T2A-MOG重组载体和17T2A载体(PS)总量15μg，与辅助质粒PLP1质粒、PLP2质粒、PMDG质粒涡旋混合，其中，PLP1质粒:PLP2质粒:PMDG质粒的质量比为6.5:2.5:3.5，PEI 82.5μg，按着PEI转染方法分别转染17T2A-MOG重组载体和17T2A载体，6h后更换新鲜培养液，12h后再次更换培养基。
其中，转染方法还可以使用lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转(电转选用低场强0.4cm电转杯，电转条件1500V～2000V、25μF、200Ω)。
2.3，慢病毒感染：转染24h后收集细胞培养液，加入到另一皿293T细胞中(细胞密度约为50％～60％)，培养24h后加入嘌呤霉素进行抗生素压力筛选，终浓度为6～8μg/mL。筛选24h后进行细胞传代，培养基中添加3μg/mL嘌呤霉素，经过3～5次传代后获得稳定表达MOG蛋白的细胞系(以下简称MOG细胞)和稳定表达17T2A的对照细胞系(以下简称17T2A细胞，PS)，准备下一步提取蛋白。
步骤3：采用免疫亲和层析法提取17T2A-MOG-293T细胞的膜蛋白-细胞膜复合物，具体包括以下步骤：
MOG粗蛋溶液制备：取准备好的17T2A-MOG-293T细胞，弃细胞培养液，用CaMgBuffer(CaCl2 2mmol/L,MgCl2 10mmol/L,KCl 60mmol/L,NaCl 15mmol/L)清洗细胞1～2次，加入1.2-1.6ml低渗裂解液(ddH2O,1xPI,0.25-0.5x CaMgBuffer),置于摇床上5-10min。用细胞刮板刮下全部细胞，收集细胞及悬液至2mL EP管中，枪头吹打20-30次，250-300g，4℃，3min，收集上清至新的2mL EP管中；
基质的预处理：取500μl商业化凝胶微珠，加入500μl稀释液(0.1mol/L PBS，0.1-1％BSA)，置于4℃、缓慢颠倒混匀30min。3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。再次500μl加入稀释液(1XPBS，含0.1-1％BSA)重悬
偶联：预处理的基质中加入等体积的商业化的抗MOG一抗(用稀释液1:200稀释)，置于4℃缓慢颠倒混匀1h。14000rpm、4℃、1min离心，弃上清。加入500μl稀释液(1XPBS，含0.1-1％BSA)，置于4℃缓慢颠倒混匀5min,3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。
封闭：(1)将偶联产物中加入1ml封闭溶液，室温下缓慢颠倒混匀30min，再加入500μl三乙醇胺溶液(1X PBS,0.1-0.5mol/L三乙醇胺,50mmol/L Tris-HCL调节pH为8.0-9.0)，室温缓慢颠倒混匀5min,3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。此步骤重复2次。
其中，封闭溶液为体积比为1：1的DMP(20-25mmol/L)和三乙醇胺溶液(1X PBS,0.1-0.3mol/L三乙醇胺,20mmol/L Tris,pH＝8.0-9.0)的混合溶液。
(2)加入1ml封闭交联剂(1XPBS，30-60mmol/L乙醇胺，PH 8.0-9.0)，室温缓慢颠倒混匀5min,3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。再加入1ml封闭交联剂，室温颠倒混匀1-2h,3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。然后加入0.5-1ml 1XPBS，室温颠倒混匀，3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。
洗涤：将封闭后的产物中加入与等体积的洗脱液(0.05-0.2mol甘氨酸，HCl调节PH为2.5-3.0),室温缓慢颠倒5-10min，3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。此步骤重复1次。加入0.5-1ml 1XPBS重悬，3000rpm、4℃、1min离心，弃上清。
上样：将经过洗涤处理的产物加入1-2ml提取的MOG粗蛋白溶液，室温环境下缓慢颠倒混匀1-2h,3000rpm、4℃、5-8min离心，弃上清。加入200μl 1XPBS洗涤2次，3000rpm、4℃、5-8min离心，弃上清。
洗脱：加入80-100μl洗脱液(0.1～0.2mol/L甘氨酸，HCl调节PH为2.5-3),室温缓慢摇晃5-10min,3000rpm、4℃、5-8min离心，收上清，重复2次。所得上清液即为膜蛋白-细胞膜复合物，如图3所示为利用MOG抗体，通过Western Blot技术在27KD处出现明确条带，说明提取的样品包含MOG蛋白。
重悬：加入Tris-HCL(50mmol/L,PH＝9)调节溶液的PH至6.8-7.5，再加入重悬液(4-8％NP40：25％BSA体积比为2：1)4℃，保存。
步骤4，取稀释至合适浓度的膜蛋白-细胞膜复合物，取0.8μL，使用移液枪以圆形印记将其点在载体膜(载体一般选择NC膜)上，于37℃烘箱中烘烤10min，即可得到人体液中抗MOG自身抗体的检测材料，于4℃密封保存。
在将上述实施例中制备的抗MOG自身抗体检测材料用于检测样品中的MOG抗体时，本发明首先制备了一种新的封闭材料。由于人血清和脑脊液中存在的某些蛋白，在检测过程中会和抗原进行非特异性结合干扰检测结果，本发明使用一种封闭材料对检测样本进行封闭，实施效果发现可显著降低样本背景，以下给出本发明的封闭材料制备的具体实施例。
实施例2
本实施例公开了一种封闭材料的制备方法，具体包括：
1)将载体膜(本实施例选择玻璃纤维垫)裁成0.5cm×0.5cm的小正方形块，每小块玻璃纤维垫上点15μL 1.9M蔗糖和1.9M葡萄糖的混合液，100℃烤20min，室温放置备用；
2)17T2A细胞(PS)蛋白的提取：刮板刮取上述实施例步骤2.3中获得的17T2A细胞，将17T2A细胞收集于15ml离心管中，1000rpm，5min，室温，弃上清。沉淀加入1mL1×PBS(或生理盐水)，吹打混匀将液体转移至1.5ml EP管中，700g，5min，室温，弃上清。加入1/2细胞团块体积的封闭蛋白提取液(1.25％脱氧胆酸钠，0.25％Triton X-100，0.75％CHAPS，20mMNaCl，2×PI)，吹打混匀将液体转移至2ml EP管中，涡旋震荡数秒后，静置数分钟直至管中有明显团块生成。补加1/2细胞团块体积0.8％NaCl，吹打，4000g，5min，收集上清，弃沉淀。上清与1/4体积25％BSA混合，即为17T2A细胞蛋白液。
3)在每小块经1)处理过的玻璃纤维垫上点12μL 17T2A细胞蛋白液，75℃烤20min，得到封闭材料，4℃放置备用。
封闭材质为玻璃纤维，将对照细胞的蛋白通过高温烘干固定在封闭材料上，使用时加入到血清或脑脊液稀释液中，蛋白可释放到液体中对检测样本中的干扰抗原发生反应，从而达到封闭效果。
实施例3
将实施例1制备的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料用于检测样品中的MOG抗体，具体的，检测样品中的MOG抗体的检测过程包括：
1)将上述实施例步骤4中获得的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料置于24孔板中，包被膜蛋白抗原的一面朝上。
2)血清封闭：待检测样品按1:250，用工作液(1×PBS，0.5％TritonX-100，0.04％EDTA)稀释后，每250μL稀释血清中加入一片实施例4制备的封闭材料，室温静置2min后，涡旋震荡数秒，再室温静置5min。
3)血清孵育：将封闭好的血清加入含有膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的24孔板中，250μL/孔，将24孔板置于水平摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
4)洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入工作液，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内工作液，重复清洗共3次。
5)二抗孵育：去除孔内的工作液，加入1:1000稀释的AP标记羊抗人IgG抗体，300μL/孔。置于摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
6)洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液(0.8％NaCl，0.5％Triton X-100)，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
7)显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物稀释液(底物:反应缓冲液＝1:49)300μL/孔，室温避光静置2～5分钟，获得显色结果。
8)终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料1～2次，将其取出晾干或37℃～45℃烘干，分析结果。
其中，显色反应检测过程示意图如图1所示。图4所示为本实施例中的检测结果，其中，图4a为本发明制备的人体抗MOG自身抗体检测材料的示意图，其中A区域包被MOG细胞膜复合物；B区域包被对照细胞膜复合物，作为阴性对照；图4b为阳性判读结果；图4c为阴性判读结果；图4d为阴性判读结果。
阳性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区呈现明显的色斑，形状近似圆形，浅蓝灰色至深蓝黑色，颜色较其周边区域及阴性对照区深(如图4b所示)。
阴性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区颜色浅于阴性对照区(如图4c所示)，或等同于阴性对照区(如图4d所示)等，判定为阴性结果。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：步骤3.1中所使用的提取液为10mmol/L CHAPS。
检测过程同实施例3，分别对三个已经明确为MOG阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图5。实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例1组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明本发明方法中的复合提取液能获得更好的检测效果。
对比例2
本对比例的检测材料的制备同实施例1，血清的检测过程与实施例3的区别在于：检测过程中不加入实施例2制备的封闭材料，不进行实施例3中的“2)血清封闭”步骤。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为MOG阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图7。实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例2组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明本发明方法中的封闭材料的使用能获得更好的检测效果。
对比例3
本对比例按照申请号201710175642.9的方法进行检测材料制备以及血清样品检测，具体步骤为：
1)通过人工合成获取MOG的CDS序列，并在目的基因两端加设NotI/NheI酶切位点；
2)将带有酶切位点的两种目的基因分别插入pCI-neo质粒载体中，插入位点为NotI/NheI，得到带有目的基因的质粒，命名为MOG；按PEI转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达MOG基因的HEK293/pCI-neo-MOG细胞。
3)通过离心去除HEK293/pCI-neo-MOG细胞的细胞核，然后加入5～20mmol/L的CHAPS去垢剂，4℃作用30～60分钟，再离心去除未溶解部分，上清即为可溶性的MOG-细胞膜复合物。
4)用1×TBS缓冲液稀释MOG-细胞膜复合物，配制成MOG-细胞膜复合物的稀释液，MOG-细胞膜复合物的稀释液中MOG的浓度为0.1～1mg/mL，然后用划膜仪将MOG-细胞膜复合物的稀释液按圆形或线性印迹在载体上，然后放入37℃烘箱内烘干，再使用固定液固定10～20分钟，其中固定液为质量分数为4％多聚甲醛、冰甲醇或体积分数为95％的乙醇；然后用PBS缓冲液洗去固定液，最后用质量分数为1％的BSA封闭液于室温条件下封闭1小时或4℃封闭16～20小时，沥干封闭液并用双蒸水清洗干净，在20～28℃下晾干，即得到人体抗MOG自身抗体检测材料，于-20℃密封保存待用；
5)用于检测样品中的MOG抗体，具体检测过程为：
制备的人体抗MOG自身抗体检测材料置于12孔板，包被MOG抗原的一面朝上；
血清孵育：检测样品按1:500稀释后加至孔内，1mL/孔。将12孔板置于水平摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育40分钟。
洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3-5分钟，弃去孔内的洗涤液。重复清洗共3次。
二抗孵育：去除孔内的洗涤液，加入1:100稀释的AP标记羊抗人IgG抗体，1mL/孔。置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育30分钟。
洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3～5分钟，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物的稀释液(底物:反应缓冲液＝1:49)，1mL/孔。室温避光静置2～5分钟，可每隔1分钟查看一次。
终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料1～2次，将其取出晾干或37℃～45℃烘干，分析结果。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为MOG阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图7，实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例3组三个阳性血清均未能检测阳性结果。

Claims (8)

1.人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，获取MOG的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-MOG；
其中，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0O ri序列、RSV启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；
步骤2，将重组质粒载体17T2A-MOG转染入293T细胞中，得到17T2A-MOG-293T细胞；
步骤3，使用免疫亲和层析法提取17T2A-MOG-293T细胞中的膜蛋白-细胞膜复合物；
步骤4，将步骤3提取得到的MOG抗原固化在载体膜上，得到人体液中抗MOG自身抗体的检测材料。
2.如权利要求1所述的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得MOG的CDS序列作为目的基因，在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为17T2A-MOG；
步骤1.3：对重组质粒17T2A-MOG进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒载体17T2A-MOG。
3.如权利要求1所述的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将17T2A-MOG转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
4.如权利要求1所述的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤3具体包括以下步骤：
步骤3.1，将预处理后的凝胶微珠与等体积的抗MOG一抗偶联混合，置于4℃缓慢颠倒混匀1h，14000rpm、4℃、1min离心，弃上清；加入500μl由1XPBS和0.1％～1％BSA组成的稀释液中，置于4℃缓慢颠倒混匀5min，3000rpm、4℃、1min离心，弃上清；
步骤3.2，将偶联产物加入封闭溶液中，其中，封闭溶液为20～25mmol/L的DMP和0.1～0.5mol/L的三乙醇胺溶液按照体积比为1:1的混合溶液；
步骤3.3，将封闭后产物与MOG粗蛋白溶液混合，室温环境下缓慢颠倒混匀1～2h，3000rpm、4℃、5～8min离心，弃上清；加入200μl的1XPBS洗涤2次，3000rpm、4℃、5-8min离心，弃上清；
步骤3.4，在沉淀中加入80～100μl洗脱液，室温缓慢摇晃5～10min，3000rpm、4℃、5～8min离心，收上清，所得上清液即为膜蛋白-细胞膜复合物。
5.如权利要求1所述的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
6.权利要求1至5任一项所述的制备方法制备的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从17T2A-MOG-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
7.将权利要求1至6任一项所述的人体液中抗MOG自身抗体的检测材料用于检测样品中的MOG抗体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，检测样品中的MOG抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至6任一项所述的抗MOG自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤后加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色；
其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的17T2A-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入蔗糖与葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h。
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