CN112230002A - 一种血清及脑脊液中神经束蛋白nf155和nf186抗体的检测方法 - Google Patents

一种血清及脑脊液中神经束蛋白nf155和nf186抗体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，包括如下步骤：S1、质粒的构建：将目的基因NF155和NF186分别与载体连接，获得目的质粒；S2、将步骤S1获得的质粒转染293T细胞，获得病毒；S3、将步骤S2获得的病毒感染293T细胞，获得转染细胞；S4、利用转染细胞表达蛋白对血清和脑脊液中抗体进行检测。本发明通过构建合适的质粒并转染到细胞中，采用特殊的培养基进行筛选，产生稳定表达效果后，再根据血清或脑脊液中相应抗体与其表达蛋白结合，从而准确的检测有无相应抗体，提升检测灵敏度及准确性。

Description

一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测 方法
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法。
背景技术
针对郎飞结的自身抗体可能是致慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病的重要原因，在一些自身免疫性神经系统疾病中，朗飞结区、结侧区、近结侧区的分子都有可能成为自身抗体的靶抗原。NF属于免疫球蛋白超家族，有NF155和NF186两种亚型。NF155位于郎飞结侧区胶质环中，使接触蛋白相关蛋白(Caspr)和接触蛋白(Contactin)在结侧区聚集，形成间隔样连接，促进神经细胞黏附和轴突生长。NF186位于郎飞结和轴突起始段，抑制细胞黏附和轴突增生。两者在神经发育及维持胶质细胞和轴索结构稳定的过程中均发挥重要作用。
目前NF155和NF186抗体的检测技术为ELISA酶联免疫法和细胞免疫荧光法，ELISA方法使抗原结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性及酶的活性，待测抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原起反应，该方法特异性好，但蛋白抗原提纯到最后包被处理，氨基酸结构已不具备天然的表达构象，免疫原性出现改变，这导致在反应过程中存在一定的错识抗原抗体反应，出现假阳性，同时国外进口，检测成本高。而细胞免疫荧光是目前主要的检测方式，免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗原上，与其相应的抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应的过程。免疫荧光可以准确识别正确的表达位点，但同时免疫荧光法存在不同质粒载体、不同比例的质粒浓度，就有不同的转染效率，最终导致出现检出率不同的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，通过构建合适的质粒并转染到细胞中，采用特殊的培养基进行筛选，产生稳定表达效果后，再根据血清或脑脊液中相应抗体与其表达蛋白结合，从而准确的检测有无相应抗体，提升检测灵敏度及准确性。
本发明通过下述技术方案实现：
一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，包括如下步骤：
S1、质粒的构建：将目的基因NF155和NF186分别与载体连接，获得目的质粒；
S2、将步骤S1获得的质粒转染293T细胞，获得病毒；
S3、将步骤S2获得的病毒感染293T细胞，获得转染细胞；
S4、利用转染细胞表达蛋白对血清和脑脊液中抗体进行检测。
所述步骤S1具体步骤如下：1)将纯化的目的基因NF155和NF186分别与载体连接，连接产物分别命名为pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP以及pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3]/EGFP；2)分别取连接产物转化超级感受态细胞；3)挑取菌落接种培养，提取质粒，得到目的质粒pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP和pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3]/EGFP。
所述步骤S2具体步骤如下：1)取293T细胞铺板；2)取目的质粒分别与质粒pMDLg/pRRE，PMD2.G，pRSV-Rev，按比例8：8：2：2混匀；3)将2)的混合液加入1)细胞孔板中培养；3)收集病毒上清颗粒保存。
所述步骤S3具体步骤如下：1)取293T细胞培养；2)向细胞中加入含有病毒的培养基；3)设置不加病毒的细胞作为阴性对照，在第2天开始向培养基中加入嘌呤霉素，后续每天加大抗生素量，当对照细胞及未表过细胞全部死亡时，记录药筛浓度，保留药筛后感染细胞。
所述步骤S4具体步骤如下：1)去转染细胞进行铺片培养、固定、封闭、通透；2)向细胞中加入待检测样本反应；3)加入Alexa Fluor 555标记的羊抗人IgG反应；4)使用荧光显微镜。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明通过构建合适的质粒并转染到细胞中，采用特殊的培养基进行筛选，产生稳定表达效果后，再根据血清或脑脊液中相应抗体与其表达蛋白结合，从而准确的检测有无相应抗体，提升检测灵敏度及准确性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为NF155的质粒载体；
图2为NF186的质粒载体；
图3为抗体检测的免疫荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
质粒构建：
1.1利用同源重组的方法，将纯化的目的基因NF155和NF186分别与载体(如图1和图2所示)连接，于50℃连接70min，连接产物命名为pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP以及pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3]/EGFP。
1.2取10μL连接产物转化50μL超级感受态细胞，将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴5min，42℃热激60s后立即置冰上放置1-2min，加入500μL LB培养基，100rpm，37℃恒温摇床培养30min，3000rpm离心2min，弃去400μL培养上清，剩余50-100μL用移液器混匀后均匀涂布于含50μg/mL氨苄抗性的LB平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。
1.3挑取1个单菌落接种于含5mL，50μg/mL氨苄抗性的LB培养液中，220rpm，37℃恒温摇床培养12h。之后提质粒，以其为模板做PCR扩增；利用1％琼脂糖凝胶电泳，经跑胶鉴定正确的菌落，测序鉴定；使用去内毒素提取试剂提取质粒，质粒浓度>500ng/ml。
实施例2
转染：
2.1取293T细胞铺板：胰酶消化细胞离心后重悬进行铺板，铺板的要求使细胞均匀的平铺于六孔板中，放置孵育箱中培养过夜；
2.2将实施例1中获得目的质粒pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP以及pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3/EGFP分别与包装质粒pMDLg/pRRE，PMD2.G，pRSV-Rev，按比例8：8：2：2混匀；将混匀后质粒稀释液加入到Lipo 2000稀释液中轻轻混匀并在室温下静置10分钟；
2.3用1ml新的未含抗生素的完全培养基更换2.1中六孔板的培养基，然后向六孔板的每个孔中加2.2获得的混合液并前后轻轻摇动细胞板，使混合液与孔中的培养液混匀，置37℃细胞CO2培养箱中培养1-3天并观察转染后的效率并做好相应记录，见如下表1；
2.4分别在48小时与72小时收集病毒上清颗粒，并进行浓度测试，达>108TU/ml后收集保存，每50ul分装保存；病毒液经离心处理后放置-80度保存。
表1转染效率比较
Figure BDA0002733134280000031
Figure BDA0002733134280000041
转染效率高低，出病毒颗料多少决定最后转导阶段的效果，通过不同比例的目的基因，包装病毒，最后效率不同，如表1所示，本次实验室优选出最佳转染效率的浓度比例。通过连续三天实验效果观测，最后确定目前8：8：2：2，转率效率最佳。
实施例3
转导：
3.1将细胞密度1-2*105/ml的293T细胞悬液接种至六孔板中(转导时靶细胞的融合度应为30％-50％)，放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养18-20小时；
3.2转导细胞的初始MOI设为5；在冰上融解冻结的病毒液，混匀融解后的病毒颗粒，用6孔板进行转导；分别取10ul>108TU/ml的病毒液至1ml培养基中，然后轻柔混匀；同时加入5μg/ml的Polybrene，来增强假病毒衣壳和细胞膜的结合；同时加入0.02g/ml色甘酸钠溶液，来维持细胞膜的稳定性，减少细胞炎性反应；
3.3 24小时后吸出3.1中的原有培养基，然后向细胞中加入3.2中含有病毒的培养基，轻柔地摇动培养板以使病毒液都能覆盖每一处细胞，然后放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜培养；
3.4 24小时后换液。吸出含有病毒的培养基，加入新鲜的完全培养基，放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜培养；
3.5抗性筛选：设置一孔不加病毒的细胞作为阴性对照，在第2天开始向培养基中加入0.2ug的嘌呤霉素，后续每天加大抗生素量，当对照细胞及未表过细胞全部死亡时，记录药筛浓度，保留药筛后感染细胞继续每天更换培养液直至长满，计算此时细胞浓度，按1：10传代培养，并保存于液氮罐中。
实施例4
抗体检测：
4.1吸取稳转的转染细胞铺片24孔板，添加多聚甲醛后固定20min；
4.2去除多聚甲醛，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，续添加牛血清白蛋白和TritonX-100进行封闭、通透2h；
4.3去除牛血清白蛋白和TritonX-100，取待测200ul血清稀释液或脑脊液，待测血清包括阳性血清和阴性血清，按1:10用BSA稀释待测血清，脑脊液直接检测，添加在已封闭的的转染细胞和中，室温20-28度下孵育45min～60mi；
4.4用磷酸盐缓冲液洗涤3次，之后加入Alexa Fluor 555标记的羊抗人IgG，24～28℃下孵育45min～60min；
4.5去除孔内的二抗孵育液，用磷酸盐缓冲液洗涤后，使用荧光显微镜的红色激发光和绿色激发光激发，观察结果并记录，如图3所示，图中上左为转染细胞，是绿色荧光图，表示转染细胞的表达；上右为抗人抗体，是红色荧光图，表示抗人抗体的表达；图中下左Merge，是红色荧光、绿色荧光叠加合图；通过合图的橙色能够看出红色绿色有荧光重叠。
实施例5
特异性与灵敏度试验
通过对30份正常健康人血清与各15份阳性血清进行实验，结果如下表2和表3，结果符合预期，一致性高，分别得出NF155\NF186的特异性及灵敏度均为100％，结果良好。
表2
Figure BDA0002733134280000051
Figure BDA0002733134280000061
表3
Figure BDA0002733134280000062
Figure BDA0002733134280000071
上述结果说明本发明通过构建合适的质粒并转染到细胞中，采用特殊的培养基进行筛选，产生稳定表达蛋白，能够准确的检测有无相应抗体，提升检测灵敏度及准确性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、质粒的构建：将目的基因NF155和NF186分别与载体连接，获得目的质粒；
S2、将步骤S1获得的质粒转染293T细胞，获得病毒；
S3、将步骤S2获得的病毒感染293T细胞，获得转染细胞；
S4、利用转染细胞表达蛋白对血清和脑脊液中抗体进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S1具体步骤如下：1)将纯化的目的基因NF155和NF186分别与载体连接，连接产物分别命名为pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP以及pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3]/EGFP；2)分别取连接产物转化超级感受态细胞；3)挑取菌落接种培养，提取质粒，得到目的质粒pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001160331.1]/EGFP和pLV[Exp]-Puro-CMV>hNFASC[NM_001005388.3]/EGFP。
3.根据权利要求1所述的一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S2具体步骤如下：1)取293T细胞铺板；2)取目的质粒分别与质粒pMDLg/pRRE，PMD2.G，pRSV-Rev，按比例8：8：2：2混匀；3)将2)的混合液加入1)细胞孔板中培养；3)收集病毒上清颗粒保存。
4.根据权利要求1所述的一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S3具体步骤如下：1)取293T细胞培养；2)向细胞中加入含有病毒的培养基；3)设置不加病毒的细胞作为阴性对照，在第2天开始向培养基中加入嘌呤霉素，后续每天加大抗生素量，当对照细胞及未表过细胞全部死亡时，记录药筛浓度，保留药筛后感染细胞。
5.根据权利要求1所述的一种血清及脑脊液中神经束蛋白NF155和NF186抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤S4具体步骤如下：1)去转染细胞进行铺片培养、固定、封闭、通透；2)向细胞中加入待检测样本反应；3)加入Alexa Fluor 555标记的羊抗人IgG反应；4)使用荧光显微镜。
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