JP2023543472A - ウイルスベクター及びその使用 - Google Patents

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Abstract

ウイルスベクター群を提供する。ウイルスベクター群は、第1の核酸分子を担持し、前記第1の核酸分子がエンベロープタンパク質をコードする第1のウイルスベクター;第2の核酸分子を担持し、第2の核酸分子が融合タンパク質をコードし、融合タンパク質が一本鎖抗体及びエンベロープタンパク質のC末端ドメインを含み、エンベロープタンパク質のC末端ドメインが、エンベロープタンパク質の膜貫通領域及び細胞内領域を含み、一本鎖抗体のC末端が、エンベロープタンパク質のC末端ドメインのN末端と連結し、一本鎖抗体が特定の抗原を標的とする第2のウイルスベクターを含み;第1の核酸分子及び第2の核酸分子が、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質を発現するように配置されており、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質が融合していない形態である、ウイルスベクター群である。ウイルスベクター群がレシピエント細胞に導入された後、ウイルス力価の高いウイルスをパッケージングすることができ、ウイルスは標的化感染力を有する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体を参照により本明細書に組み込まれている、2020年9月30日に中国の国家知識産権局に出願された中国特許出願第202011064132.2号の優先権及び利益を主張する。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、詳細には、本発明はウイルスベクター及びその使用に関し、より詳細には、本発明は、目的の遺伝子をレシピエント細胞に導入するためのウイルスベクター、レンチウイルス、医薬組成物、及び方法に関する。
現在、遺伝子送達ベクターとして、レンチウイルスは様々な疾患の遺伝子療法に広く使用されているが、CAR-T調製、造血幹細胞の遺伝子改変等のex vivoの分野に主に集中している。レンチウイルスベクターをin vivo分野で広く使用することができない主な理由の1つは、レンチウイルストランスフェクションが標的化できないことである。
研究者等は、レンチウイルスの標的化トランスフェクションを達成することに取り組んできた。公開された研究によると、レンチウイルスによってトランスフェクトされる宿主細胞の種類を決定するのはエンベロープタンパク質である。エンベロープタンパク質の種類又は構造を変更することによって、レンチウイルスは特定の種類の細胞にトランスフェクトする傾向を獲得するが、いくつかの欠点がある。レンチウイルスのトランスフェクションの傾向又は標的化を獲得するために、研究者等は主に次の3つの面で改善を行う。第1に、エンベロープタンパク質を特定のトランスフェクション組織を有する他のウイルスのエンベロープタンパク質と置換し、それによりレンチウイルスが新たなトランスフェクション特性を獲得するようにする;しかし、明確な機能的背景を有し、安全性が保証されたエンベロープタンパク質の数は限られており、得られた組換えレンチウイルスの力価及び安定性は低下している。第2に、抗原に特異的に結合する受容体又は抗体のscFvドメインは、エンベロープタンパク質のN末端に融合して発現されるか、又は別の膜タンパク質としてウイルスベクターに組み込まれ、それによりレンチウイルスは受容体若しくはscFvを介して抗原に結合することができ、抗原を発現する細胞にトランスフェクトする傾向を有するが、この方法ではレンチウイルスの産生力価が大幅に低下する(約100倍低下)。第3に、ウイルスをパッケージングしながらCD47タンパク質を共発現させて、膜表面にCD47を高発現するレンチウイルス(CD47hi LV)を得る。CD47はマクロファージ表面受容体と相互作用してマクロファージのレンチウイルス貪食を阻害し、それによってCD47hi LVが肝細胞により効率的に遺伝子導入されるようにし、急性炎症反応の活性化を低下させる。しかし、この方法は、ウイルスを代謝する体の能力を利用して、CD47hi LVが肝細胞に遺伝子導入される効率を受動的に高めるが、肝細胞を能動的に標的にして感染させることはできない。
現在の技術では、レンチウイルスの力価を大幅に低下させることなく、レンチウイルス感染の標的化の欠如の問題を解決することは未だにできないという事実を考慮すると、この問題を解決するために新しい技術を開発する必要がある。
Structural basis for the recognition of LDL-receptor family members by VSV glycoprotein. Nature Communications. 2018)
本発明は、関連技術における技術的課題の1つを少なくともある程度解決することを目的とする。この目的のために、本発明は、標的化感染力及び有意に改善されたウイルス力価を有するウイルスベクターを提供する。
一態様では、本明細書で提供するのはウイルスベクターの1群である。本発明の実施形態によれば、このウイルスベクター群は、第1の核酸分子を担持し、この第1の核酸分子がエンベロープタンパク質をコードする第1のウイルスベクター;第2の核酸分子を担持する少なくとも1つの第2のウイルスベクターであって、この第2の核酸分子が少なくとも1つの融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質が少なくとも1つの一本鎖抗体及びエンベロープのC末端ドメインを含み、このエンベロープタンパク質のC末端ドメインがエンベロープタンパク質の膜貫通領域及び細胞内領域を含み、この少なくとも1つの一本鎖抗体のC末端がエンベロープタンパク質のC末端ドメインのN末端と連結し、この一本鎖抗体が特定の抗原を標的とする少なくとも1つの第2のウイルスベクターを含み;第1の核酸分子及び第2の核酸分子は、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質を発現するように配置され、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質は融合していない形態である。本発明の実施形態によれば、ウイルスベクターがレシピエント細胞に導入された後、ウイルス力価の高いウイルスがパッケージングされることが可能で、ウイルスは標的化感染力を有する。
本発明の実施形態によれば、ウイルスベクターは、以下の追加の技術的特徴のうちの少なくとも1つを更に含むことができる:
本発明の実施形態によれば、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又は他のエンベロープウイルスベクターである。
本発明の実施形態によれば、エンベロープウイルスは、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、ニャマウイルス科(Nyamaviridae)、アレナウイルス科(Arenaviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、ハンタウイルス科(Hantaviridae)、ナイロウイルス科(Nairoviridae)、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、フェヌイウイルス科(Phenuiviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、トガウイルス科(Togaviridae)、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、スプーマウイルス(Spumavirus)、イリドウイルス科(Iridoviridae)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ポックスウイルス科(Poxviridae)、及びデルタウイルス(Deltavirus)から選択される少なくとも1種を含む。
本発明の実施形態によれば、エンベロープタンパク質は、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルスのエンベロープG糖タンパク質(VSV-G)又はエンベロープG糖タンパク質変異体である。水疱性口内炎ウイルスのエンベロープG糖タンパク質は、細胞膜吸着及び融合の能力を有する。したがって、本明細書で提供したウイルスベクターによってパッケージングされたウイルスは、細胞吸着及び感染の能力を有する。
本発明の実施形態によれば、エンベロープG糖タンパク質の変異体は、K47Q及びR354Q変異を有する。K47Q及びR354Q変異を有するエンベロープG糖タンパク質変異体の細胞膜吸着能は減衰しているが、その膜融合能は影響を受けない。したがって、K47Q及びR354Q変異を有するエンベロープG糖タンパク質変異体は、パッケージングによって得られたウイルスの非特異的な細胞吸着能力を弱めるが、ウイルスが細胞に感染する能力には影響を及ぼさない。
本発明の実施形態によれば、エンベロープG糖タンパク質の変異体は、配列番号1で示したアミノ酸配列を有する。
本発明の実施形態によれば、一本鎖抗体は細胞特異的抗原を標的とする。
本発明の実施形態による一本鎖抗体は、任意選択で、任意の特定の抗原を標的とするように設定することができ、例えば、腫瘍細胞特異的抗原CD19又はSiglec15を標的とし、その後、得られたウイルスを一本鎖抗体の細胞特異的抗原への標的化結合の媒介下でパッケージングし、ウイルスの細胞(腫瘍細胞及び免疫細胞等)への特異的標的化結合が実現され、それによってウイルスの細胞への特異的感染が実現される。
本発明の実施形態によれば、融合タンパク質は、第1の連結ペプチドを更に含む。それによって、一本鎖抗体領域がエンベロープタンパク質のC末端領域から分離され、2つの間の機能的干渉が低下する。
本発明の実施形態によれば、第1の連結ペプチドは、配列番号2で示したアミノ酸配列を有する。
AAATTT(配列番号2)。
本発明の実施形態によれば、エンベロープタンパク質のC末端ドメインは、配列番号3で示したアミノ酸配列を有する。
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(配列番号3)。
本発明の実施形態によれば、融合タンパク質は、配列番号4又は配列番号10で示したアミノ酸配列を有する。
本発明の実施形態によれば、ウイルスベクターは、第1の核酸分子に作動可能に連結した第1のプロモーター及び第2の核酸分子に作動可能に連結した第2のプロモーターを更に含む。それによって、第1の核酸分子及び第2の核酸分子はそれぞれ、第1のプロモーター及び第2のプロモーターの制御下にあり、第1の核酸分子及び第2の核酸分子の高効率な発現を達成する。
本発明の実施形態によれば、第1のプロモーター及び第2のプロモーターのそれぞれは、CMV、EF-1、及びRSVプロモーターから独立して選択される。
本発明の実施形態によれば、第1の核酸分子は、配列番号5で示したヌクレオチド配列を有する。
本発明の実施形態によれば、第2の核酸分子は、配列番号6で示したヌクレオチド配列を有する。
本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは同じベクターである。
本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは同じベクターであり、このベクターは内部リボソーム進入部位配列(IRES)を更に含み、細胞内リボソーム進入部位配列は第1の核酸分子と第2の核酸分子との間に配置される。細胞内リボソーム進入部位の前後での2つのタンパク質の発現は通常、比例する。細胞内リボソーム進入部位配列の導入によって、第1の核酸分子及び第2の核酸分子が独立して翻訳されて発現され、得られるエンベロープタンパク質及び融合タンパク質は融合していない。細胞内リボソーム進入部位配列の導入によって、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質の生物学的効果が効果的に保証され、したがってパッケージングによって得られたウイルスの特異的結合吸着及び感染力は優れたものになり、ウイルス力価は高くなる。
本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは同じベクターであり、このベクターは、第1の核酸分子と第2の核酸分子との間に配置される第3の核酸分子を含み、第3の核酸分子は第2の連結ペプチドをコードしており、第2の連結ペプチドは切断され得る。第3の核酸分子の導入によって、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質の融合していない形態での発現が可能になり、それによってエンベロープタンパク質及び融合タンパク質の生物学的機能が確実になり、したがってパッケージングによって得られたウイルスの特異的結合吸着及び感染能力は優れたものになり、ウイルス力価は高くなる。
本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは同じベクターであり、第1の核酸分子及び第2の核酸分子のコピー数の比は1:1～4:1である。本明細書において「第1の核酸分子及び第2の核酸分子のコピー数の比」とは、第1の核酸分子及び第2の核酸分子のタンパク質発現量の比がほぼ同じであることを確かめるために、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは同じベクターである、すなわち、第1の核酸分子及び第2の核酸分子が同じベクターにある場合、ベクターが担持する第1の核酸分子及び第2の核酸分子の数の比を意味する。本発明者等は、ベクターが担持する第1の核酸分子及び第2の核酸分子の数の比が1:1～4:1である場合、ウイルス力価及びウイルスの感染効率がともに高いことを見出した。
本発明の実施形態によれば、第1の核酸分子及び第2の核酸分子のコピー数の比は2:1～4:1である。本発明者の特定の実施形態によれば、ベクターが担持する第1の核酸分子及び第2の核酸分子の数の比が2:1～4:1である場合、ウイルス力価及びウイルスの感染効率がともに更に改善される。
本発明の実施形態によれば、第1の核酸分子及び第2の核酸分子のコピー数の比は2:1である。本発明者等は、ベクターが担持する第1の核酸分子及び第2の核酸分子の数の比が2:1である場合、ウイルス力価及びウイルスの感染効率が最適なバランスに到達することを見出した。
本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターはpMD2.G、pCMV、pMD2.G変異体、又はpCMV変異体である。本発明の実施形態によれば、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターの種類は特に限定されない。VSV-Gを発現できるベクター、又はVSV-G若しくはVSV-G変異体を発現できるベクターを使用することができる。
本発明の実施形態によれば、ウイルスベクターは、目的の遺伝子を担持する第3のウイルスベクター、並びにウイルス構造タンパク質遺伝子及びウイルスパッケージング酵素遺伝子及び任意選択で調節因子rev遺伝子を担持する第4のウイルスベクターを更に含む。
本発明の実施形態によれば、構造タンパク質遺伝子、ウイルスパッケージング酵素遺伝子、及び調節因子rev遺伝子は、同じ第4のウイルスベクター又は異なる第4のウイルスベクターに配置される。例えば、レンチウイルスベクターpsPAX2の発現産物には、構造タンパク質gag、パッケージング酵素pol(逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼを含む)、及び調節因子revなどが挙げられ、調節因子revは生成物の力価をある程度まで高めることができるが、レンチウイルスパッケージングには必要ない。Rev(pRSV-rev)及びgag-pol(pMDLg-pRRE)は、発現のために2つのプラスミドに分割することができるか、又はrev(pRSV-rev)、gag(pCMV-gag)、pol(pCMV-gag)は、発現のために3つのプラスミドに分割することができる。
本発明の実施形態によれば、ウイルスパッケージング酵素は、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼのうちの少なくとも1つを含む。
本発明の実施形態によれば、第3のウイルスベクターはトランスファーベクターである。
本発明の実施形態によれば、トランスファーベクターはレンチウイルスパッケージングシグナルを含有する。
本発明の実施形態によれば、レンチウイルスパッケージングシグナルはΨを含む。
本発明の実施形態によれば、トランスファーベクターはpLVベクターである。
本発明の実施形態によれば、第4のウイルスベクターはpsPAX2である。
他の態様では、本明細書で提供するのはレンチウイルスを得るための方法である。本発明の実施形態によれば、この方法は、本明細書で提供したウイルスベクター群を第1のレシピエント細胞に導入する工程、第1のレシピエント細胞を培養してウイルスを得る工程を含む。この方法で得られたレンチウイルスは力価が高く、標的化結合して細胞に感染する能力が大幅に改善されている。
本発明の実施形態によれば、本明細書で提供した方法は、以下の追加の技術的特徴のうちの少なくとも1つを更に含むことができる:
本発明の実施形態によれば、ウイルスはレンチウイルスであり、第1のウイルスベクター及び第2のウイルスベクターは異なるベクターであり、第3のウイルスベクター、第4のウイルスベクター、第1のウイルスベクター、及び第2のウイルスベクターの質量比は2:1:1:0.25～2:1:1:1である。本発明の実施形態のウイルスベクターの比によれば、レンチウイルスの力価及びレンチウイルス感染効率はともに高い。
本発明の実施形態によれば、第3のウイルスベクター、第4のウイルスベクター、第1のウイルスベクター、及び第2のウイルスベクターの質量比は2:1:1:0.5である。本発明者等は、第3のウイルスベクター、第4のウイルスベクター、第1のウイルスベクター、及び第2のウイルスベクターの質量比は2:1:1:0.5である場合、レンチウイルスの力価及び感染効率は最適なバランスに到達することを見出した。
本発明の実施形態によれば、第1のレシピエント細胞は293Tである。
第3の態様では、本明細書で提供するのはレンチウイルスである。本発明の実施形態によれば、レンチウイルスは本明細書で記載したようにパッケージングによって得られる。このレンチウイルスは力価が高く、標的化結合して細胞に感染する能力を有する。
第4の態様では、本明細書で提供するのはレンチウイルスである。本発明の実施形態によれば、レンチウイルスは、エンベロープタンパク質及び融合タンパク質を発現し、融合タンパク質は、一本鎖抗体及びエンベロープタンパク質のC末端ドメインを含み、エンベロープタンパク質のC末端ドメインは、エンベロープタンパク質の膜貫通及び細胞内領域を含み、一本鎖抗体のC末端は、エンベロープタンパク質のC末端ドメインのN末端に連結している。本明細書で提供されたレンチウイルスは力価が高く、標的化結合して細胞に感染する能力を有する。
本発明の実施形態によれば、エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープG糖タンパク質又はエンベロープG糖タンパク質変異体である。
第5の態様では、本明細書で提供するのは医薬組成物である。本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、本明細書で提供したウイルスベクター群又はレンチウイルスを含み、このウイルスベクター又はレンチウイルスは、目的の遺伝子を担持する。本明細書における「目的の遺伝子」とは、ウイルスベクター又はレンチウイルスが担持する必要がある外因性遺伝子を意味することに留意すべきである。ウイルスが細胞に感染した後、外因性遺伝子が標的細胞に入り、目的の遺伝子の発現が標的細胞で達成される。標的細胞における目的の遺伝子の発現が直接的又は間接的な治療効果を達成することができる場合、ウイルスベクター又はレンチウイルスによって形成された医薬組成物は、目的の遺伝子を標的細胞にもたらす効果を達成し、それによって疾患の標的化治療を達成する。
第6の態様では、本明細書で提供するのは目的の遺伝子を発現するための方法である。本発明の実施形態によれば、この方法は、目的の遺伝子が組み込まれたウイルスベクター又はレンチウイルスを第2のレシピエント細胞に導入する工程、第2のレシピエント細胞を培養して目的の遺伝子を発現する工程を含む。本発明の実施形態によれば、レシピエント細胞における目的の遺伝子の発現は効率的に実現される。例えば、本発明の実施形態では、mcherry又はBFPは担持することができる目的の遺伝子であり、標的化ベクタープラットフォームの実現可能性を検証するために、本発明者は、タグ遺伝子としてmcherry遺伝子又はBFP遺伝子を使用して蛍光タンパク質を発現させ、それによってレシピエント細胞におけるウイルス感染の陽性率を特徴づけた。
本発明の実施形態によれば、この方法は、以下の追加の技術的特徴のうちの少なくとも1つを更に含むことができる:
本発明の実施形態によれば、第2のレシピエント細胞への導入は、エレクトロトランスフェクション、トランスフェクション、又は感染によって実施される。「エレクトロトランスフェクション」又は「トランスフェクション」とは、ウイルスベクターをレシピエント細胞に導入する方法を意味し、「感染」とは、ウイルスが細胞膜に能動的に結合し融合して細胞に入る過程を意味することに注意されたい。「エレクトロトランスフェクション」とは、電気刺激によってウイルスパッケージング用ベクターをレシピエント細胞に導入する方法を意味し、「トランスフェクション」とは、リポソーム等の化学的媒介物を介してウイルスパッケージング用ベクターをレシピエント細胞に導入する方法を意味する。
本発明の実施形態によれば、第2のレシピエント細胞は体細胞である。
本発明の実施形態によれば、第2のレシピエント細胞は腫瘍細胞である。腫瘍細胞における目的の遺伝子の発現が直接的又は間接的な治療効果を達成することができる場合、本明細書で提供した方法は腫瘍細胞の特異的殺滅を達成し、腫瘍の特異的治療を達成する。
本発明の実施形態によれば、「pMD2.G変異体」又は「pMD2.G-Mut」とは、K47Q/R354Q変異部位を含有するレンチウイルスエンベロープタンパク質を発現するプラスミド(VSV-G-K47Q/R354Q)を意味する。
本発明の実施形態によるCD19抗原を標的とするエンベロープ融合タンパク質(抗CD19-G)の構造模式図であり、ここで、抗CD19 scFvは、CD19一本鎖抗体の可変領域配列を表し、VSV-G C末端は、レンチウイルスエンベロープタンパク質のC末端ドメインを表す。 本発明の実施形態によるpMD2.G変異体(pMD2.G-Mut)のマップである。 本発明の実施形態による様々な比率でpMD2.G-Mut及びpMD2.抗CD19-Gをパッケージングすることによって得られたCD19標的化レンチウイルスの力価結果の図であり、ここで、横軸は、レンチウイルスの種類を表し、各レンチウイルスに含有されたベクターの種類及び比はTable 1(表1)に示されており、縦軸は、HEK-293T-CD19細胞に感染したレンチウイルスによって測定されたレンチウイルス力価を表す。 本発明の実施形態によるパッケージングによって得られたCD19標的化レンチウイルスの力価結果の図で、ここで、横軸は、レンチウイルスの種類を表し、各レンチウイルスに含有されたベクターの種類及び比はTable 2(表2)に示されており、縦軸は、HEK-293T細胞に感染したレンチウイルスによって測定されたレンチウイルス力価を表す。 本発明の実施形態によるパッケージングによって得られたCD19標的化レンチウイルスに感染した293Tのフロー分析図であり、ここで、CD19taはCD19に結合することができるscFvである。 本発明の実施形態によるパッケージングによって得られたCD19標的化レンチウイルスに感染した293Tの能力分析図であり、ここで、横軸は、レンチウイルスの種類を表し、各レンチウイルスに含有されたベクターの種類及び比はTable 2(表2)に示されており、縦軸は、HEK-293T-CD19細胞及びHEK-293T細胞の混合系にレンチウイルスを感染させた後のHEK-293T-CD19細胞及びHEK-293T細胞のmCherry陽性率の比を表し、CD19taはCD19に結合することができるscFvである。 本発明の実施形態によるパッケージングによって得られたSiglec15標的化レンチウイルスに感染した293T細胞の能力分析図であり、ここで、横軸は、レンチウイルスの種類を表し、各レンチウイルスに含有されたベクターの種類及び比はTable 3(表3)に示されており、縦軸は、HEK-293T-HS15細胞及びHEK-293T細胞の混合系にレンチウイルスを感染させた後のHEK-293T-HS15細胞及びHEK-293T細胞のBFP陽性率の比率を表し、HEK-293T-HS15はヒトSiglec15タンパク質を安定的に発現するHEK 293T細胞を表し、5G12はSiglec15に結合することができるscFvを表す。
本発明の実施形態を以下に詳細に説明し、実施形態の実施例を図面に示す。
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書で提供されるのは、標的化トランスフェクション能力を有する新規レンチウイルスベクター群であり、このベクター群は、エンベロープタンパク質VSV-G又はVSV-G変異体を担持するコード領域、並びに一本鎖抗体scFv及びVSV-GのC末端ドメインを連結ペプチドで連結することによって得られた融合タンパク質を担持するコード領域を含む。
本明細書で提供されたレンチウイルスベクターは以下の特徴を有する。(1)VSV-G変異体は標的細胞に吸着するVSV-Gの能力が減衰しているが、細胞膜融合能力を保持している変異体であり、(2)scFvは1つ又は複数が連続していてもよく、(3)VSV-GのC末端ドメインは、少なくともVSV-Gの細胞内領域及び膜貫通領域を含み、(4)ウイルスベクターは、1つ又は複数の融合タンパク質を含有することができる。
本研究の利点は以下の通りである:(1)scFv及びVSV-GのC末端ドメインによって形成された融合タンパク質は、VSV-Gと同じ膜貫通及び細胞内領域を有するので、融合タンパク質は依然としてマトリックスタンパク質との相互作用を維持しており、ウイルス粒子の出芽を妨げることなくレンチウイルス粒子のエンベロープに効率的に組み込まれ、それによってウイルス力価に重大な影響を及ぼさない。(2)レンチウイルス粒子のエンベロープは、ウイルス粒子の安定性を維持することができる無傷のVSV-G又はその変異体を依然として含有している。(3)scFvが対応する抗原に結合することによって、レンチウイルス粒子は、対応する抗原を発現する標的細胞に能動的に感染し、同じ感染多重度条件下で標的細胞の感染効率を高めることができる。(4)scFvは明確な機能的背景を有し、安全性が保証されており、scFvへの特異的な結合について任意の抗原をスクリーニングすることができるため、レンチウイルスベクターによってパッケージングされたウイルスは、様々な種類の細胞の標的化感染に汎用的に応用可能になる。(5)VSV-Gを標的細胞への吸着能力が減衰した変異体に置換するので、scFvと対応する抗原との間の特異的結合力がウイルス粒子吸着の過程を支配し、組換えレンチウイルスの標的化を更に改善する。
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書で提供されるのは、以下の工程(例として、CD19+細胞のトランスフェクションを目標とするレンチウイルスベクターを得る工程)を含む、遺伝子トランスフェクションを目標とする能力を備えた新たな種類のレンチウイルスベクターを構築して使用するための方法である:
1.CD19及びVSV-GのC末端ドメインを標的とする一本鎖抗体によって形成される融合タンパク質(CD19 scFv-VSV-G-CT(略して抗CD19-G))の設計。構造模式図を図1に示す。ここで、VSV-Gシグナルペプチドは、VSV-G前駆体タンパク質のアミノ末端に位置し、VSV-Gタンパク質の膜局在テロペプチドである。VSV-Gシグナルペプチドは、VSV-Gタンパク質が小胞体に位置するのを助け、タンパク質が成熟した後、加水分解されて分離される。ウイルス粒子のVSV-Gタンパク質は、このシグナルペプチドを含有していない。
シグナルペプチドの代表的なアミノ酸配列を配列番号7に示す。
MKCLLYLAFLFIGVNC(配列番号7)。
抗CD19 scFvのアミノ酸配列を配列番号8に示す。
第1のリンカーペプチド(リンカー)のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
AAATTT(配列番号2)。
VSV-G C末端は、VSV-Gタンパク質のアミノ酸405～495(合計91)を含有しており、そのアミノ酸配列は:
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(配列番号3)である。
2.CG融合膜タンパク質発現プラスミドの構築
VSV-Gシグナルペプチド-scFv-リンカー-(VSV-G-CT)のモデルのDNA配列を設計し、遺伝子合成会社に合成を委託する。pMD2.Gプラスミド(VSV-Gタンパク質発現プラスミド)をベクターとして使用し、融合タンパク質発現プラスミドpMD2.抗CD19-Gを構築する。
3.VSV-G吸着減衰変異体の構築(参照:Structural basis for the recognition of LDL-receptor family members by VSV glycoprotein. Nature Communications. 2018)
K47Q及びR354Qの二重点変異体のDNA配列を設計し、遺伝子合成会社に合成を委託する。VSV-G発現プラスミドpMD2.Gをベクターとして使用し、VSV-G-K47Q/R354Q発現プラスミドpMD2.G-Mutを構築する。研究によって、K47Q及びR354Q変異はVSV-Gの膜吸着能を低下させることができるだけで、VSV-Gの膜融合能には影響を及ぼさないことがわかった。
4.レンチウイルスパッケージング及び採取
(1)レンチウイルスベクターパッケージングプラスミドを、293T細胞にコトランスフェクトした。
(2)ウイルスを含有する培養上清を、トランスフェクションの48～72時間後に収集し、0.45μmフィルターで濾過後、分注して、超低温冷蔵庫で保管した。
5.レンチウイルスベクターの標的化トランスフェクション能力の検出及び分析
(1)レンチウイルスベクターを使用してCD19+及びCD19-の混合培養細胞に感染させ、2種類の細胞の陽性率を比較する。
(2)同じ感染条件下で、感染したCD19+細胞の陽性率/感染したCD19-細胞の陽性率を使用して、レンチウイルスが感染したCD19+細胞を標的とする能力(略して標的感染力)を評価することができる。標的感染力≦1の場合、レンチウイルスはCD19+細胞を標的にする能力がなく、標的感染力>1の場合、レンチウイルスはCD19+細胞を標的とする能力があり、値が大きいほどCD19+細胞を標的とする能力が強い。
本発明の実施形態を以下に詳細に説明し、実施形態の例を図面に示す。図面を参照して以下に説明する実施形態は、例示的なものであり、本発明を説明することを意図しており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施形態で記載した「プラスミド」及び「ベクター」は同義であり、互換的に使用することができることに注意されたい。
(実施例1)
1.CD19+細胞に感染することを目標とした、様々な抗CD19-G含有物を有する一連のレンチウイルスのパッケージング
1.1.1 レンチウイルスパッケージング情報
Table 1(表1)に示したプラスミド及び質量比(各群の間でpLV-mCherry及びpsPAX2プラスミドの同じ質量を維持するため)に従って、293T細胞をコトランスフェクトしてレンチウイルスをパッケージングした。
ここで、pLV-mCherryはmCherry配列を担持するトランスファープラスミドであり、目的の遺伝子はmCherry配列であり、psPAX2はレンチウイルス構造タンパク質gag及びpol(ウイルス粒子にパッケージングされた逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ、非構造化タンパク質)を発現するプラスミドである。pMD2.G-Mutはレンチウイルス膜タンパク質変異体(VSV-G-K47Q/R354Q)を発現するプラスミドであり、pMD2.抗CD19-Gは、CD19を標的とするscFv及びVSV-Gタンパク質のC末端ドメインを含有するキメラタンパク質を発現するプラスミドであり、この実施例で使用されるpMD2.G変異体のマップを図2に示す。
1.1.2 レンチウイルスベクター収量の評価
1)細胞株構築の評価:
CD19及びGFPを安定的に共発現する293T細胞株(HEK-293T-CD19)を構築した。GFPを発現させる目的は、GFP陽性を使用してCD19陽性細胞を示すことであった。
2)レンチウイルスのパッケージング、採取、及び収量の評価
Table 1(表1)に設定した実験群に従って、293T細胞を48～72時間コトランスフェクトし、その後各群のウイルス液を収集した。各群のウイルス液を0.45μm滅菌フィルターで濾過した。HEK-293T-CD19細胞200μLを24ウェルプレートのウェルに広げた。濾過したレンチウイルスを100倍希釈し、この溶液200μL/ウェルを対応する細胞ウェルに添加し、穏やかに十分混合し、プレートを37℃、5% CO2で3～4日間インキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、感染細胞中のmCherry+細胞のパーセンテージを検出した。
3)結果及び分析
VSV-G-K47Q/R354Qタンパク質及び抗CD19-G融合タンパク質を発現するプラスミドの質量比が1:0.25～1:1(すなわち、4:1～1:1)の場合、ウイルスの力価は高くなる。ここで、1:0.5(すなわち、2:1)が最高である(結果を図3に示す)。ウイルス収量=ウイルス力価×ウイルス液体積。採取したウイルス液体積が同じ場合、ウイルス力価のレベルはウイルス収量のレベルを表し、すなわち、プラスミドが発現するVSV-G-K47Q/R354Qタンパク質及び抗CD19-G融合タンパク質の質量比が1:0.25～1:1(すなわち、4:1～1:1)の場合、ウイルスの収量は多くなり、1:0.5が最高である。
1.2 CD19+細胞の感染を目標とする一連のレンチウイルスのパッケージング。
1.2.1 レンチウイルスパッケージング情報
以下のTable 2(表2)のプラスミド及び比(各群の間でpLV-mCherry及びpsPAX2プラスミドの同じ量を維持するため)に従って、293T細胞をコトランスフェクトしてレンチウイルスをパッケージングした。
ここで、pLV-mCherryはmCherry配列を担持するトランスファープラスミドであり、目的の遺伝子はmCherry配列であり、psPAX2はレンチウイルス構造タンパク質gag及びpol(ウイルス粒子にパッケージングされた逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ、非構造化タンパク質)を発現するプラスミドである。pMD2.Gはレンチウイルスエンベロープタンパク質を発現する(VSV-Gを発現する)プラスミドであり、pMD2.G-Mutは、レンチウイルス膜タンパク質変異体(VSV-G-K47Q/R354Q)を発現するプラスミドであり、pMD2.抗CD19-Gは、CD19を標的とするscFv及びVSV-Gタンパク質のC末端ドメインを含有するキメラタンパク質を発現するプラスミドであり、この実施例で使用されるpMD2.G変異体のマップを図2に示す。
1.2.2 CD19+細胞を標的とするレンチウイルスベクターの標的化能力の評価
1)細胞株構築の評価:
CD19及びGFPを安定的に共発現する293T細胞株(HEK-293T-CD19)を構築した。GFPを発現させる目的は、GFP陽性を使用してCD19陽性細胞を示すことであった。
2)レンチウイルスパッケージング、採取、力価判定、及び標的細胞のトランスフェクション
Table 2(表2)に設定した実験群に従って、293T細胞を48～72時間コトランスフェクトした。各群のウイルス液を収集し、超低温冷蔵庫(<-75℃)で保管した。力価は293T細胞で測定した。
293T及びHEK-293T-CD19細胞を1:1の比で混合し、24ウェルプレートに広げた。凍結したレンチウイルス溶液を100倍希釈し、この溶液の200μL/ウェルを対応する細胞ウェルに添加し、穏やかに十分混合した。(2種類の細胞の混合トランスフェクションには2つの目的がある:a.2つの細胞のトランスフェクション条件が完全に同じであることを確認するため。b.標的細胞及び非標的細胞がin vivo遺伝子治療において共存する場合のトランスフェクション条件をシミュレートするため。)
プレートは37℃で5% CO2で3～4日間インキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、感染細胞中のmCherry+細胞のパーセンテージ及びGFP陽性(GFP+)細胞のパーセンテージを検出した。
3)結果及び分析
抗CD19-G融合タンパク質の発現は、レンチウイルスの産生力価の大幅な低下を引き起こさず(結果を図4に示す)、力価は107超に達することが可能で、これは先行技術における標的化ウイルスの力価よりも大幅に優れている。抗CD19-G融合タンパク質の発現は、レンチウイルスのCD19+細胞への感染力を高めることもできる(結果を図5及び図6に示す)。
変異エンベロープタンパク質(VSV-G-K47Q/R354Q)の発現は、レンチウイルスの感染力を低下させることができ(結果を図5D及び図5Bに示す)、抗CD19-G融合タンパク質の発現は、CD19+細胞を標的とするレンチウイルスの感染力を特異的に高め(結果を図5Eに示す)、したがってLVm-CD19taは、LV-CD19taよりもCD19+細胞を標的とする感染力が強い(結果を図6に示す)。
(実施例2)
2.1 ヒトSiglec15+細胞に感染することを目標とした一連のレンチウイルスのパッケージング
以下のTable 3(表3)のプラスミド及び比(各群の間でpLV-BFP及びpsPAX2プラスミドの同じ量を維持するため)に従って、HEK293T細胞をコトランスフェクトしてレンチウイルスをパッケージングした。
ここで、pLV-BFPはBFP(青色蛍光タンパク質)配列を担持するトランスファープラスミドであり、目的の遺伝子はBFP配列である。psPAX2はレンチウイルス構造タンパク質gag及びpol(ウイルス粒子に詰め込まれた逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ、非構造タンパク質)を発現するプラスミドであり、pMD2.Gはレンチウイルスエンベロープタンパク質(VSV-G)を発現するプラスミドであり、pMD2.G-Mutはレンチウイルス膜タンパク質変異体(VSV-G-K47Q/R354Q)を発現するプラスミドであり、pMD2.抗Siglec15-Gは、Siglec15を標的とするscFv及びVSV-Gタンパク質のC末端ドメインを含有するキメラタンパク質を発現するプラスミドである。この実施例で使用したpMD2.G変異体のマップを図2に示す。
抗Siglec15 scFvのアミノ酸配列を配列番号9に示す:
2.2 Siglec15+細胞を標的とするレンチウイルスベクターの標的化能力の評価
1)細胞株構築の評価:
Siglec15及びBFPを安定的に共発現する293T細胞株(293T-Siglec15+)を構築した。
2)レンチウイルスパッケージング、採取、力価判定、及び標的細胞のトランスフェクション
Table 2(表2)に設定した実験群に従って、293T細胞を48～72時間コトランスフェクトし、各群のウイルス液を収集し、超低温冷蔵庫(<-75℃)で保管した。力価は293T細胞で測定した。
293T及び293T-Siglec15+細胞を1:1の比で混合し、24ウェルプレートに広げた。凍結したレンチウイルス溶液を100倍希釈し、この溶液の200μL/ウェルを対応する細胞ウェルに添加し、穏やかに十分混合した。
混合トランスフェクトされた2種類の細胞を37℃、5% CO2で3～4日間静置して培養した。フローサイトメトリーを使用して、感染細胞中のBFP+細胞及びSiglec15陽性(Siglec15+)細胞のパーセンテージを検出した。
4)結果及び分析
特定の実験結果を図7に示す。抗Siglec15-G融合タンパク質の特異的発現は、レンチウイルスがSiglec15+細胞に感染する能力を高め、LV-BFP-5G12の標的化能力をLV-BFPよりも強力にし、LVm-BFP-5G12の標的化能力をLVm-BFPよりも強力にする。
更に、「第1」及び「第2」という用語は、説明目的のためのみに使用されており、相対的な重要性を示しているか若しくは暗示している、又は示された技術的特徴の数を暗に示していると理解することはできない。したがって、「第1」又は「第2」で定義された特徴は、少なくとも1つの特徴を明示的又は暗示的に含むことができる。本発明の説明において、「より多い」とは、特に定義しない限り、少なくとも2つ、例えば2つ、3つ等を意味する。
本明細書において「実施形態」、「一部の実施形態」、「一実施形態」、「別の実施例」、「実施例」、「特定の実施例」、又は「一部の実施例」とは、実施形態又は実施例に関連して説明された特定の特徴、構造、材料、又は特性が、本開示の少なくとも1つの実施形態又は実施例に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて上記の用語の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態又は実施例を参照しているとは限らない。更に、特定の特徴、構造、材料、又は特性は、1つ又は複数の実施形態又は実施例において任意の適切な方法で組み合わせることができる。更に、当業者は、互いに矛盾しない限り、それらの異なる実施形態、実施例、又は特徴を統合し、組み合わせることができる。
説明のための実施形態が示され、記載されているが、上記の実施形態は本開示を限定するものと解釈することはできず、本開示の精神、原則、及び範囲から逸脱することなく、実施形態において変更、代替、及び修正を行うことができることは、当業者によって理解されるであろう。

Claims (22)

  1. 第1の核酸分子を担持し、前記第1の核酸分子がエンベロープタンパク質をコードする第1のウイルスベクター;
    第2の核酸分子を担持する少なくとも1つの第2のウイルスベクターであって、前記第2の核酸分子が少なくとも1つの融合タンパク質をコードし、前記融合タンパク質が少なくとも1つの一本鎖抗体及び前記エンベロープタンパク質のC末端ドメインを含み、前記エンベロープタンパク質の前記C末端ドメインが、前記エンベロープタンパク質の膜貫通領域及び細胞内領域を含み、前記少なくとも1つの一本鎖抗体の前記C末端が、前記エンベロープタンパク質の前記C末端ドメインのN末端と連結し、前記一本鎖抗体が特定の抗原を標的とする、少なくとも1つの第2のウイルスベクター
    を含み、
    前記第1の核酸分子及び前記第2の核酸分子が、前記エンベロープタンパク質及び前記融合タンパク質を発現するように配置され、前記エンベロープタンパク質及び前記融合タンパク質が融合していない形態である、ウイルスベクター群。
  2. 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又は他のエンベロープウイルスベクターである、請求項1に記載のウイルスベクター。
  3. 前記エンベロープウイルスが、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、ニャマウイルス科(Nyamaviridae)、アレナウイルス科(Arenaviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、ハンタウイルス科(Hantaviridae)、ナイロウイルス科(Nairoviridae)、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、フェニュイウイルス科(Phenuiviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、トガウイルス科(Togaviridae)、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、スプーマウイルス(Spumavirus)、イリドウイルス科(Iridoviridae)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ポックスウイルス科(Poxviridae)、及びデルタウイルス(Deltavirus)から選択される少なくとも1種を含み、
    任意選択で、前記エンベロープタンパク質がラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルスのエンベロープG糖タンパク質又はエンベロープG糖タンパク質変異体である、請求項1に記載のウイルスベクター。
  4. 前記エンベロープG糖タンパク質の前記変異体が、K47Q及びR354Q変異を有し、
    任意選択で、前記エンベロープG糖タンパク質の前記変異体が、配列番号1で示したアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のウイルスベクター。
  5. 前記一本鎖抗体が、細胞特異的抗原を標的とする、請求項1に記載のウイルスベクター。
  6. 前記融合タンパク質が第1の連結ペプチドを更に含み、
    任意選択で、前記第1の連結ペプチドが、配列番号2で示したアミノ酸配列を有し;
    任意選択で、前記エンベロープタンパク質の前記C末端ドメインが、配列番号3で示したアミノ酸配列を有し;
    任意選択で、前記融合タンパク質が、配列番号4又は配列番号10で示したアミノ酸配列を有する、請求項3から5のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  7. 前記第1の核酸分子に作動可能に連結した第1のプロモーター、及び
    前記第2の核酸分子に作動可能に連結した第2のプロモーターを更に含む、請求項1に記載のウイルスベクター。
  8. 前記第1のプロモーター及び第2のプロモーターのそれぞれが、CMV、EF-1、及びRSVプロモーターから独立して選択される、請求項7に記載のウイルスベクター。
  9. 前記第1の核酸分子が、配列番号5で示したヌクレオチド配列を有し、
    任意選択で、前記第2の核酸分子が配列番号6で示したヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載のウイルスベクター。
  10. 前記第1のウイルスベクター及び前記第2のウイルスベクターが同じベクターである、請求項1に記載のウイルスベクター。
  11. 内部リボソーム侵入部位配列を更に含み、前記内部リボソーム侵入部位配列が前記第1の核酸分子と前記第2の核酸分子との間に配置されている、請求項10に記載のウイルスベクター。
  12. 前記第1の核酸分子と前記第2の核酸分子との間に配置されている第3の核酸分子を更に含み、前記第3の核酸分子が第2の連結ペプチドをコードしており、前記第2の連結ペプチドは切断され得る、請求項10に記載のウイルスベクター。
  13. 前記第1の核酸分子及び前記第2の核酸分子のコピー数の比が1:1～4:1であり、
    任意選択で、前記第1の核酸分子及び前記第2の核酸分子のコピー数の比は2:1～4:1であり、
    好ましくは前記第1の核酸分子及び前記第2の核酸分子のコピー数の比が2:1である、請求項10に記載のウイルスベクター。
  14. 前記第1のウイルスベクター及び前記第2のウイルスベクターが、pMD2.G、pCMV、pMD2.G変異体、又はpCMV変異体である、請求項1に記載のウイルスベクター。
  15. 目的の遺伝子を担持する第3のウイルスベクター、並びにウイルス構造タンパク質遺伝子及びウイルスパッケージング酵素遺伝子及び任意選択で調節因子rev遺伝子を担持する第4のウイルスベクターを更に含み;
    任意選択で、前記構造タンパク質遺伝子、前記ウイルスパッケージング酵素遺伝子、及び前記調節因子rev遺伝子が、同じ第4のウイルスベクター又は異なる第4のウイルスベクターに配置されており、
    任意選択で、前記ウイルスパッケージング酵素が、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載のウイルスベクター。
  16. 前記第3のウイルスベクターがトランスファーベクターであり、前記トランスファーベクターがレンチウイルスパッケージングシグナルを含有し、
    任意選択で、前記レンチウイルスパッケージングシグナルがΨを含み、
    任意選択で、前記トランスファーベクターがpLVであり、
    任意選択で、前記第4のウイルスベクターがpsPAX2である、請求項15に記載のウイルスベクター。
  17. 請求項1から16のいずれか一項に記載のウイルスベクターを第1のレシピエント細胞に導入する工程、前記第1のレシピエント細胞を培養してウイルスを得る工程を含む、レンチウイルスを得るための方法。
  18. 前記ウイルスがレンチウイルスであり、前記第1のウイルスベクター及び前記第2のウイルスベクターが異なるベクターであり、前記第3のウイルスベクター、前記第4のウイルスベクター、前記第1のウイルスベクター、及び前記第2のウイルスベクターの質量比が2:1:1:0.25～2:1:1:1であり、
    好ましくは、前記第3のウイルスベクター、前記第4のウイルスベクター、前記第1のウイルスベクター、及び前記第2のウイルスベクターの質量比が2:1:1:0.5であり、
    任意選択で、前記第1のレシピエント細胞が293Tである、請求項17に記載の方法。
  19. 請求項17又は18に記載の方法によるパッケージングによって得られるレンチウイルス。
  20. エンベロープタンパク質及び融合タンパク質を発現するレンチウイルスであって、前記融合タンパク質が、一本鎖抗体及び前記エンベロープタンパク質のC末端ドメインを含み、前記エンベロープタンパク質の前記C末端ドメインが、前記エンベロープタンパク質の膜貫通及び細胞内領域を含み、前記一本鎖抗体の前記C末端が、前記エンベロープタンパク質の前記C末端ドメインのN末端に連結されており、
    任意選択で、前記エンベロープタンパク質が水疱性口内炎ウイルスのエンベロープG糖タンパク質又はエンベロープG糖タンパク質変異体である、レンチウイルス。
  21. 請求項1から16のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は請求項19若しくは20に記載のレンチウイルスを含み、前記ウイルスベクター又はレンチウイルスが目的の遺伝子を担持する、医薬組成物。
  22. 目的の遺伝子を発現するための方法であって、
    前記目的の遺伝子が組み込まれたウイルスベクター又はレンチウイルスを第2のレシピエント細胞に導入する工程、
    前記第2のレシピエント細胞を培養して前記目的の遺伝子を発現させる工程、
    任意選択で、前記第2のレシピエント細胞への導入が、エレクトロトランスフェクション、トランスフェクション、又は感染によって行われ、
    任意選択で、前記第2のレシピエント細胞が体細胞であり、
    任意選択で、前記第2のレシピエント細胞が腫瘍細胞である、方法。
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