CN113881642A - 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113881642A
CN113881642A CN202110827488.5A CN202110827488A CN113881642A CN 113881642 A CN113881642 A CN 113881642A CN 202110827488 A CN202110827488 A CN 202110827488A CN 113881642 A CN113881642 A CN 113881642A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novel coronavirus
pseudovirus
plasmid
antibody
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110827488.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王盛
邵泓
陈钢
王灿
王自强
段徐华
郑璐侠
刘荔桢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Original Assignee
SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL filed Critical SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority to CN202110827488.5A priority Critical patent/CN113881642A/zh
Publication of CN113881642A publication Critical patent/CN113881642A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用。该新型冠状病毒假病毒包括插入有新型冠状病毒外膜Spike蛋白(S蛋白)的质粒，报告基因质粒和慢病毒包装质粒；该新型冠状病毒外膜S蛋白去除了C端19氨基酸，并连接3×Flag。本发明提供的新型冠状病毒假病毒可大批量制备，操作容易；只需在P2细胞培养间操作即可，实验流程简单，且滴度可控；由于该假病毒颗粒具有与2019新型冠状病毒相近的感染机制，通过抗体中和试验可以有效筛选靶向新冠病毒突刺蛋白的抗体，评估抗体的相对生物学活性，具有较高的应用价值。

Description

一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用。
背景技术
假病毒是指病毒的一个或多个结构蛋白不是由该病毒的核酸编码，并丧失了真病毒的侵染能力病毒颗粒，具有较高的安全性。病毒依据结构分为包膜病毒和非包膜病毒，其中包膜病毒系指核衣壳外具有包膜结构的病毒，如流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等。包膜病毒假病毒具体定义为一种反转录病毒能够整合另外一种病毒的包膜蛋白，形成具有外源性病毒包膜蛋白，并且其膜蛋白的生物学活性接近于真病毒，而基因保持反转录病毒本身基因组特性的病毒。这种病毒由于本身编码包膜蛋白的基因被修饰掉，丧失了自我复制的能力，只能进行一个细胞周期的侵染，因而具有较高的生物安全性。由于高致病性和高传染性活病毒的中和抗体检测对实验室等级要求较高，一般需要在BSL-3或BSL-4级别的生物安全实验室内进行，并且部分活病毒难以培养，严重限制了相关药物的研究开发与临床应用。假病毒颗粒凭借其较高安全性及与原病毒高度相似的感染机制，可以广泛应用于中和抗体滴度的检测以及疫苗效价的评价。
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)存在较高的传染性和致病率，提示我们该类病毒对人类是很大的威胁，需加强其机制研究及特效药物开发。目前国内外均有相关疫苗及靶向药物的开发及应用，并且康复者血浆中的抗体亦可以保护未感染者和重症患者。而应用疫苗和靶向药物以及康复者血浆防治COVID-19，均需要检测效价或血浆中的抗体滴度水平。传统活病毒检测存在安全隐患，对实验室级别要求高，难以推广。而采用SARS-CoV-2假病毒替代活病毒，模拟活病毒感染机制，失去了原有的传染性，是研究高致病性病毒的理想模型，可相对安全地在BSL-2实验室通过体外抗体中和试验有效评估血浆抗体滴度或药效水平，是值得建立和推广的检测方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和在抗体中和试验中的应用，该假病毒能模拟2019新型冠状病毒感染机制，感染靶细胞产生荧光素酶信号；本发明通过检测靶细胞所表达的荧光素酶的活性可以对抗体及靶向药物活性进行定量测定。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种新型冠状病毒假病毒，其包括：插入有新型冠状病毒外膜Spike蛋白(S蛋白)的质粒，报告基因质粒和慢病毒包装质粒；该新型冠状病毒外膜S蛋白去除了C端19氨基酸，并连接3×Flag。
进一步地，上述报告基因为荧光素酶基因。
本发明的第二方面是提供上述假病毒的构建方法，包括如下步骤：
步骤一，构建携带报告基因的报告质粒；
步骤二，合成上述新型冠状病毒外膜S蛋白，并构建在真核表达质粒上；
步骤三，将上述报告质粒和真核表达质粒与慢病毒包装质粒转染细胞，培养完成后收集上清，离心即得该假病毒。
进一步地，上述构建方法包括如下步骤：
步骤一，将luciferase序列插入到慢病毒载体pLVX-Puro中，得到报告质粒 pLVX-Luc2p；
步骤二，合成上述新型冠状病毒外膜S蛋白，使用Not1和Xba1插入到 pcDNA3.1(+)载体上，得到pc3.1-S质粒；
步骤三，使用Polyetherimide试剂将pLVX-Luc2p、psPAX2和pc3.1-S三个质粒转染HEK-293T细胞，置于二氧化碳培养箱培养6小时后换液，72小时后收集上清，离心过滤，浓缩提纯即得该假病毒。
本发明的第三方面是提供一种评估新冠病毒抗体滴度或药效水平的试剂盒，包括上述假病毒和携带有新型冠状病毒外膜S蛋白识别的受体血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme2，ACE2)基因的体外培养的哺乳动物细胞株HEK-293T-ACE2；
假病毒用于在药物/抗体干扰的情况下感染细胞株HEK-293T-ACE2，通过检测发光信号，进而评估抗体滴度或药效水平。
进一步地，上述细胞株HEK-293T-ACE2的构建方法包括如下步骤：
步骤一，利用分子克隆技术构建表达ACE2基因的慢病毒载体质粒；
步骤二，利用慢病毒包装技术获得高滴度的ACE2慢病毒；
步骤三，利用慢病毒转染技术将步骤二构建的慢病毒转染HEK-293T细胞；
步骤四，在步骤三转染后的细胞中加入嘌呤霉素，经过加压筛选，富集阳性细胞，有限稀释法得到单克隆细胞株HEK-293T-ACE2，扩增并置于液氮介质中冻存。
进一步地，步骤四中嘌呤霉素的浓度为2μg/mL。
本发明第四方面是提供采用上述试剂盒评估新冠病毒抗体滴度或药效水平的方法，包括如下步骤：
(1)对稳转细胞株HEK-293T-ACE2进行复苏、传代及接种，使得细胞浓度为3×105个/mL；
(2)假病毒的稀释与感染：根据测定需求稀释假病毒至合适的滴度使得信噪比在900-1100左右；同时加入稀释后的假病毒和抗体/药物，孵育之后，加入上述稳转细胞株HEK-293T-ACE2和聚凝胺后进行培养；
(3)培养完成后，吸取上清，将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀，加至孔板，室温避光震荡一定时间；
(4)以抗体/药物浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)相对活性率作四参数逻辑回归，拟合标准曲线；比较靶向抗体/药物的相对EC50，评估效价。
进一步地，上述聚凝胺的终浓度为5μg/mL。
本发明的第五方面是提供上述假病毒在新冠病毒抗体中和试验中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的新型冠状病毒假病毒可大批量制备，操作容易；只需在P2细胞培养间操作即可，实验流程简单，且滴度可控；由于该假病毒颗粒具有与新型冠状病毒相近的感染机制，通过抗体中和试验可以有效筛选靶向新冠病毒突刺蛋白的抗体，评估抗体的相对生物学活性，具有较高的应用价值。
附图说明
图1是本发明一实施例中单克隆稳转细胞系HEK-293T-ACE2的western鉴定结果；其中，左边为阴性对照HEK-293T，右边为稳转了ACE2的HEK-293T；β-Actin为上样内参蛋白；
图2是本发明一实施例中新型冠状病毒假病毒S蛋白表达的wenstern鉴定结果；其中，单体S蛋白全长170kD，在组装时会被酶切成S1和S2两个小亚基；S2亚基大小为100kD左右，质粒中S2蛋白C端连接Flag标签，会被检测出来；
图3是本发明一实施例中新型冠状病毒假病毒活性鉴定结果；其中，MOCK 为阴性对照，SARS-COV-2S为新冠假病毒，VSV-G为阳性对照；
图4是本发明一实施例中不同包装质粒构建的新冠假病毒感染试验结果； pLVX-Luc2p实验组使用了pLVX-Luc2p，psPAX2，pc3.1-S，三质粒包装。 pNL4.3-Luc-R-E-组使用商品化的pNL4.3-Luc-R-E-质粒与pc3.1-S质粒包装；
图5是本发明一实施例中新型冠状病毒假病毒梯度稀释检测结果；
图6是本发明一实施例中抗体中和试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用，为评估新冠病毒抗体效价提供了安全可靠的手段。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供了一种稳转细胞株HEK-293T-ACE2，其构建方法包括如下步骤：
(1)嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定
HEK-293T细胞接种于24孔细胞培养板中，加入不同筛选浓度嘌呤霉素，浓度范围：0.1μg/mL～10μg/mL培养2～3天，观察细胞生长形态，确认嘌呤霉素筛选浓度为2μg/mL。
(2)质粒构建
将人源ACE2序列插入到慢病毒载体pLVX-Puro中，得到新的质粒 pLVX-ACE2-Puro。ACE2序列来源于优宝生物人ACE2(NM_021804)ORF克隆，使用Xho1和Xba1酶切位点连接到载体pLVX-Puro。测序验证得到目的质粒。
(3)慢病毒收集
HEK-293T细胞种板过夜。使用Lipofectamine 3000试剂将pLVX-ACE2-Puro、psPAX2和pMD2.G三个质粒转染HEK-293T细胞，置于二氧化碳培养箱培养6 小时后换液，48小时后收集上清，过滤浓缩，得到高滴度慢病毒。
(4)细胞转染及筛选
HEK-293T细胞种板过夜。加入不同滴度的慢病毒以及辅助感染试剂聚凝胺，置于二氧化碳培养箱培养24小时后换液，继续培养48小时，加入嘌呤霉素筛选 2～3天，扩大培养，有限稀释法得到单克隆HEK-293T-ACE2细胞。
(5)稳转细胞目的蛋白表达鉴定；
细胞裂解液RIPA处理HEK-293T-ACE2细胞，制备western蛋白上样缓冲液。采用化学发光法，使用ACE2 Monoclonal antibody(proteintech，66699-1-Ig)检测蛋白表达，结果如如图1所示，HEK-293T-ACE2细胞高表达ACE2。
实施例2
本实施例提供一种新型冠状病毒假病毒，其构建方法包括如下步骤：
(1)质粒构建；
新型冠状病毒外膜S蛋白(QHU36824.1)(去除C端19氨基酸，并连接3×Flag) 由生工合成，使用Not1和Xba1插入到pcDNA3.1(+)载体上，得到pc3.1-S质粒。将luciferase(荧光素酶)序列插入到慢病毒载体pLVX-Puro中，得到新的质粒 pLVX-Luc2p。Luciferase序列来源于promega公司pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] Vector，使用Xho1和BamH1酶切位点连接到载体pLVX-Puro。测序验证得到目的质粒。
(2)新冠假病毒和慢病毒收集；
HEK-293T细胞种板过夜。使用Polyetherimide试剂将pLVX-Luc2p、psPAX2 和pc3.1-S或pMD2.G三个质粒转染HEK-293T细胞，置于二氧化碳培养箱培养 6小时后换液，72小时后收集上清，离心过滤，浓缩提纯，-80度冻存。其中， pc3.1-S组为新冠假病毒，pMD2.G组为阳性对照。同时RIPA裂解细胞，western 蛋白上样缓冲液。采用化学发光法，使用Anti-Flag M2 antibody(Sigma，F1804) 检测S蛋白表达，结果如图2所示，HEK-293T细胞表达S蛋白的活性剪切体(分子量100kD)。
(3)新冠假病毒活性鉴定；
取HEK-293T-ACE2和HEK-293T细胞离心重悬于生长培养基中，调整密度为 3x105/mL，96孔板每孔种100μL。加入新冠假病毒、阳性慢病毒或空白对照100μL，并加上终浓度5μg/mL聚凝胺，感染靶细胞。72小时后吸取培养基，加入发光底物(Promega Bright-Glo)100μL孵育3min检测发光信号，结果如图3所示，相对HEK-293T，新冠假病毒对HEK-293T-ACE2细胞有着显著的感染能力，提示新冠假病毒构建成功。
(4)不同包装体系新冠假病毒活性鉴定比较；
HEK-293T细胞种板过夜。分别使用Polyetherimide试剂将pLVX-Luc2p、psPAX2与pc3.1-S三质粒和pNL4.3-Luc-R-E-与pc3.1-S二质粒转染HEK-293T 细胞，置于二氧化碳培养箱培养6小时后换液，72小时后收集上清，离心过滤， -80度冻存。
取HEK-293T-ACE2细胞离心重悬于生长培养基中，调整密度为3x105/mL， 96孔板每孔种100μL。加入2种包装体系新冠假病毒100μL感染靶细胞，并加上 5μg/mL聚凝胺。72小时后去除培养基，加入发光底物(Promega Bright-Glo)100μL 孵育3min检测发光信号。结果如图4所示，三质粒构建的假病毒滴度高于商品化质粒，且大于1个数量级，明显优于商品化质粒。
(5)新冠假病毒梯度稀释；
取HEK-293T-ACE2细胞离心重悬于生长培养基中，调整密度为3×105/mL， 96孔板每孔种100μL。初始加入新冠假病毒100μL，并以10倍比稀释，感染靶细胞，并加上5μg/mL聚凝胺。72小时后去除培养基，加入发光底物(Promega Bright-Glo)100μL孵育3min检测发光信号。结果如图5所示，随着假病毒体积增大，荧光信号逐渐上升，发现假病毒在合适的体积时可达信噪比在1000左右，适合接下来的抗体中和试验。
实施例3
本实施例验证实施例2提供的新型冠状病毒假病毒在抗体中和试验中的应用，具体的操作过程和结果如下：
(1)细胞传代培养和铺板：稳转细胞株HEK-293T-ACE2使用完全培养液传代培养于5％，37℃二氧化碳培养箱内，每3天换液一次，收集入无菌离心管中， 1000rpm离心2分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用新鲜的完全培养液重悬，转入细胞培养瓶，继续培养。取生长状态良好的细胞进行铺板，1000rpm离心2min，弃上清，加入维持培养液重悬细胞，调节细胞浓度为3×105个/mL。
(2)抗体与新冠假病毒孵育：
抗体稀释液的制备：将抗体(母液：1mg/mL，来自于公司，靶向S蛋白受体结合区(receptor binding domain，RBD)用DMEM梯度稀释成300μg/mL、 100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL 和0.001μg/mL共100个稀释度。取20μL加入到96孔板中，补加80μL新冠假病毒(新冠假病毒用DMAM稀释，使得80μL的信噪比在1000左右)，37℃， 5％二氧化碳条件下孵育1小时。同时补充无抗体的假病毒对照组。
(3)加样：待抗体与假病毒孵育好后，取细胞悬液100μL，加入96孔细胞培养板内，同时每孔补加终浓度5μg/mL聚凝胺，阴性对照加入DMEM 100μL， 37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时。
(4)显色和结果计算：完全吸取上清，加入发光底物(Promega Bright-Glo) 100μL孵育3min检测发光信号。化学光强度(RFU)相对活性率计算公式为
Figure RE-GDA0003397813870000071
以抗体浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)相对活性率作四参数logistic回归，拟合标准曲线。
结果如图6所示，利用本发明的测定方法得到的抗体EC50为216ng/mL。
由上述实施例可知，本发明构建了一种新型冠状病毒假病毒颗粒，该包装体系获得的假病毒滴度高于商品化的质粒系统1个数量级，由于该假病毒颗粒具有与新型冠状病毒相近的感染机制，通过抗体中和试验可以有效筛选靶向新冠突刺蛋白的抗体，评估抗体的相对生物学活性，本发明提供的假病毒测定方法操作简单、实验成本低、结果可靠。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒假病毒，其特征在于，包括插入有新型冠状病毒外膜S蛋白的质粒，报告基因质粒和慢病毒包装质粒；该新型冠状病毒外膜S蛋白去除了C端19氨基酸，并连接3×Flag。
2.根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶基因。
3.一种如权利要求1或2所述假病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，构建携带报告基因的报告质粒；
步骤二，合成所述新型冠状病毒外膜S蛋白，并构建在真核表达质粒上；
步骤三，将所述报告质粒和真核表达质粒与慢病毒包装质粒转染细胞，培养完成后收集上清，离心即得该假病毒。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将luciferase序列插入到慢病毒载体pLVX-Puro中，得到报告质粒pLVX-Luc2p；
步骤二，合成所述新型冠状病毒外膜S蛋白，使用Not1和Xba1插入到pcDNA3.1(+)载体上，得到pc3.1-S质粒；
步骤三，使用Polyetherimide试剂将pLVX-Luc2p、psPAX2和pc3.1-S三个质粒转染HEK-293T细胞，置于二氧化碳培养箱培养，培养完成后离心过滤，浓缩提纯即得该假病毒。
5.一种评估新冠病毒抗体滴度或药效水平的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述假病毒和携带有新型冠状病毒外膜S蛋白识别的ACE2基因的体外培养的哺乳动物细胞株HEK-293T-ACE2；
所述假病毒用于在药物/抗体干扰的情况下感染所述细胞株HEK-293T-ACE2，通过检测发光信号，进而评估抗体滴度或药效水平。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞株HEK-293T-ACE2的构建方法包括如下步骤：
步骤一，利用分子克隆技术构建表达ACE2基因的慢病毒载体质粒；
步骤二，利用慢病毒包装技术获得高滴度的ACE2慢病毒；
步骤三，利用慢病毒转染技术将步骤二构建的慢病毒转染HEK-293T细胞；
步骤四，在步骤三转染后的细胞中加入嘌呤霉素，经过加压筛选，富集阳性细胞，有限稀释法得到单克隆细胞株HEK-293T-ACE2，扩增并置于液氮介质中冻存。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，步骤四中所述嘌呤霉素的浓度为2μg/mL。
8.采用如权利要求5-7任一项所述试剂盒的评估新冠病毒抗体滴度或药效水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对所述细胞株HEK-293T-ACE2进行复苏、传代及接种，使得细胞浓度为3×105个/mL；
(2)假病毒的稀释与感染：根据测定需求稀释假病毒至合适的滴度使得信噪比在900-1100左右；同时加入稀释后的假病毒和抗体/药物，孵育之后，加入所述稳转细胞株HEK-293T-ACE2和聚凝胺后进行培养；
(3)培养完成后，吸取上清，将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀，加至孔板，室温避光震荡一定时间；
(4)以抗体/药物浓度的对数对其相应的化学光强度相对活性率作四参数逻辑回归，拟合标准曲线；比较靶向抗体/药物的相对EC50，评估效价。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚凝胺的终浓度为5μg/mL。
10.如权利要求1或2所述假病毒在新冠病毒抗体中和试验中的应用。
CN202110827488.5A 2021-07-21 2021-07-21 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用 Pending CN113881642A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110827488.5A CN113881642A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110827488.5A CN113881642A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113881642A true CN113881642A (zh) 2022-01-04

Family

ID=79010800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110827488.5A Pending CN113881642A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113881642A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115287271A (zh) * 2022-06-30 2022-11-04 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
WO2024103579A1 (zh) * 2022-11-18 2024-05-23 复百澳(苏州)生物医药科技有限公司 一种冠状病毒假病毒颗粒的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136084A1 (fr) * 2005-06-20 2006-12-28 Chinese Academy Of Medical Sciences, Institute Of Basic Medical Sciences Proteines de fusion de proteines structurales recombinantes du coronavirus sars, leur production et leurs utilisations
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136084A1 (fr) * 2005-06-20 2006-12-28 Chinese Academy Of Medical Sciences, Institute Of Basic Medical Sciences Proteines de fusion de proteines structurales recombinantes du coronavirus sars, leur production et leurs utilisations
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
闫克夏: "SARS2CoV 假病毒中和试验技术的建立及评价", 病毒学报, vol. 23, no. 6, pages 440 - 446 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115287271A (zh) * 2022-06-30 2022-11-04 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
CN115287271B (zh) * 2022-06-30 2024-04-09 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
WO2024103579A1 (zh) * 2022-11-18 2024-05-23 复百澳(苏州)生物医药科技有限公司 一种冠状病毒假病毒颗粒的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113881642A (zh) 一种新型冠状病毒假病毒及其构建方法和应用
CN112553172B (zh) 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途
CN112430581B (zh) 一种表达ace2蛋白的外泌体的制备方法及应用
CN110760001B (zh) Gm-csf敲低及其中和单链抗体分泌的嵌合抗原受体t细胞构建与应用
CN113817753B (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
Michaud et al. The SARS-CoV-2 Spike mutation D614G increases entry fitness across a range of ACE2 levels, directly outcompetes the wild type, and is preferentially incorporated into trimers
US20230416692A1 (en) Reverse genetic system for sars-cov-2
CN109913423A (zh) 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用
US20230366877A1 (en) Ebiv nucleic acid composition and application thereof
US8652483B2 (en) Viral infection enhancing peptide
CN110129272B (zh) 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN116622779A (zh) Ifitm3基因的应用
US9421167B2 (en) Preparation of microvesicle-siRNA complexes and use thereof in AIDS treatment
CA2541872A1 (en) H5 pseudotyped viruses and uses thereof
CN112048477B (zh) Ebv病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法
CN115820693A (zh) 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用
CN106119207B (zh) 一种基于反向遗传技术构建的IBV Vero细胞适应株
CN114410593A (zh) 一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺
CN112852751A (zh) 一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法
CN102168061B (zh) 一种人肺细胞beas-2b/cyp2a13及其制备方法与应用
CN113881692A (zh) 宿主细胞针对新冠病毒侵入的防御分子筛选评价方法
CN117100755B (zh) 化合物imb44-16在制备抗新冠病毒药物中的应用
CN117487004B (zh) 抗冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用
JP2004503252A (ja) Ｈｉｖ−１リポーターウイルスおよび抗ウイルス性化合物をアッセイするうえでのその使用
US20230273209A1 (en) Method for determining whether or not virus-neutralizing antibodies are present and in vitro method for screening compounds for their ability to neutralize a virus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination