CN117487004B - 抗冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体及其应用。本申请提供的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的制备流程简单快速，而且获得的单克隆抗体为全人源抗体，无免疫原性；其中单克隆抗体BCoV2‑3、BCoV6‑25均能够分别结合MERS‑CoV S1和S2，单克隆抗体BCoV6‑31能够结合MERS‑CoV S1，对其余人类冠状病毒具有特异性结合活性，且能识别S蛋白线性表位，这些抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体将有助于未来针对多种冠状病毒的中和抗体和结合抗体的研究，以及针对泛冠状病毒的疫苗设计。并可以单独或组合可用于开发区分MERS‑CoV和其他冠状病毒的诊断方法。

Description

抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，尤其是提供了一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
当前对冠状病毒的检测多是基于病毒核酸的扩增技术，仅少数是免疫方法检测病毒蛋白抗原。可归纳为以下几个方面：（1）基于RNA扩增的检测，包括RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR和等温扩增方法；（2）病毒RNA生物传感器，包括电化学和光学生物传感器；（3）病毒抗体的检测；（4）全病毒或病毒蛋白抗原检测。由于冠状病毒基因组的相似性，基于核酸扩增方法的方法可能面临交叉反应或突变株的漏检问题；而基于抗体的检测方法不能应用于早期诊断，且无法鉴别康复者和新感染者，多适用于流行病学研究；此外，对抗体进行检测也发现多存在交叉反应性。基于病毒抗原的检测是对病毒表面蛋白进行鉴定，是一种可作为早期诊断和判断感染的直接、快速的手段，而不需要昂贵的设备。一旦制备了抗体就容易开发出可靠的抗原检测方法。对冠状病毒的抗原检测研究较多关注S蛋白和N蛋白靶标。然而，当病毒感染11天以后，对N蛋白的检测灵敏度降低到30%以下。因此，仍需开发更灵敏的方法来检测冠状病毒抗原蛋白。
传统的免疫检测方法包括ELISA、LFIA和Western blotting等，其中ELISA检测技术具有操作简单、结果容易判断等优点，已被应用于以S蛋白为靶标的全病毒检测。利用抗SARS-CoV S1单克隆捕获抗体和HRP标记的双特异性单抗，通过四甲基联苯胺(TMB)显色底物来检测S蛋白的S1亚基，可在2小时内检测到19 ng/ml的S蛋白。基于N蛋白单克隆抗体的检测，对SARS-CoV、OC43、229E和MERS-CoV重组病毒N蛋白检测，可在1-3小时完成。利用以上两种针对MERS-CoV重组N蛋白的特异性单克隆抗体方法，可在30分钟内快速完成对鼻咽或抽吸样品的检测，灵敏度和检出下限分别为81%和103.7 TCID50/ml。以上这些针对抗原的免疫检测，充分表明了基于单抗的免疫检测方法的快速、简单和可行性强等优点。2020年5月，FDA批准了一种基于荧光夹心LFIA的快速诊断新冠病毒抗原的检测方法，可在15分钟内从咽拭子和鼻拭子中定性检测出SARS-CoV和SARS-CoV-2蛋白，检测下限为113 TCID50/ml，检测临床样品的敏感性和特异性分别为80%和100%（WHO）。
然而，目前尚未有稳定的检测冠状病毒的免疫学方法，主要是缺乏能鉴别多种冠状病毒的抗体，以及针对特定毒株的特异性抗体。此外，制备多种病毒的靶标抗原的技术难度，也限制了抗原检测的免疫方法的发展。对人类冠状病毒的检测，特别是临床症状不明显的、早期的检测，急需研发更为可靠、快速和特异的诊断技术方法。对于如SARS-CoV-2这样最具传染性的病毒，我们需要建立一些简单、便携、现场检测的快速技术。基于广谱型或特异性抗体的病毒抗原检测技术，可以做到操作简单、成本低、速度快等优点，是替代RT-PCR或者和RT-PCR配合使用的理想方法。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体及其应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括单克隆抗体BCoV2-3、单克隆抗体BCoV6-25、单克隆抗体BCoV6-31中任意的一种；
所述单克隆抗体BCoV2-3包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为DSTISIYW的CDR1、氨基酸序列为INPDGSRA的CDR2和氨基酸序列为ARDFDRVP的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SSDIGHYNF的CDR1、氨基酸序列为DVS的CDR2和氨基酸序列为SSFTSSNTYV的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-25包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GSTFSDYY的CDR1、氨基酸序列为ITSSGSSV的CDR2和氨基酸序列为ATIRRYFIDGVNYWVDFDY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SGDVGNYNL的CDR1、氨基酸序列为EDS的CDR2和氨基酸序列为CSYAGSA的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-31包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GFPFSSYA的CDR1、氨基酸序列为ISDDGSNT的CDR2和氨基酸序列为ARGSSGWVPSEY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为QAIDTS的CDR1、氨基酸序列为AAS的CDR2和氨基酸序列为QQLNSYPIT的CDR3。
本申请的设计的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体对冠状病毒具有广谱交叉结合活性，有助于对MERS-CoV和冠状病毒以及其他冠状病毒的诊断和研究，经过实验可知本申请的单克隆抗体对冠状病毒具有特异性结合活性；其中单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25均能够分别结合MERS-CoV S1和S2，且能够结合抗原的线性表位；单克隆抗体BCoV6-31能够结合MERS-CoV S1，对其余人类冠状病毒具有特异性结合活性，且能识别S蛋白线性表位。
本申请的单克隆抗体将有助于未来针对多种冠状病毒的中和抗体和结合抗体的研究，以及针对泛冠状病毒的疫苗设计。并可以单独或组合可用于开发区分MERS-CoV和其他冠状病毒的诊断方法。
作为本申请所述抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的优选实施方式，
所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。
作为本申请所述抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的优选实施方式，
所述单克隆抗体BCoV2-3的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:12所示。
第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的核苷酸序列。
作为本申请所述核酸分子的优选实施方式，
编码所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:15所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:16所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:17所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:18所示。
第三方面，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体包含所述的核酸分子。
第四方面，本申请提供了上述抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体在制备检测抗冠状病毒S蛋白的试剂中的应用。
作为本申请所述应用的优选实施方式，所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体用于冠状病毒的免疫学检测。
作为本申请所述应用的优选实施方式，所述冠状病毒包括MERS-CoV、SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63中的至少一种。
第五方面，本申请提供了一种检测冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体。
采用含有本申请抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的试剂盒，可以有效检测冠状病毒。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的制备流程简单快速，而且获得的单克隆抗体为全人源抗体，无免疫原性；其中单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25均能够分别结合MERS-CoV S1和S2，单克隆抗体BCoV6-31能够结合MERS-CoV S1，对其余人类冠状病毒具有特异性结合活性，且能识别S蛋白线性表位，这些抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体将有助于未来针对多种冠状病毒的中和抗体和结合抗体的研究，以及针对泛冠状病毒的疫苗设计。并可以单独或组合可用于开发区分MERS-CoV和其他冠状病毒的诊断方法。
附图说明
图1为本申请实施例1的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的筛选流程图；
图2为单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区示意图；
图3为单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区示意图；
图4为单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区示意图；
图5为单克隆抗体BCoV6-25的轻链可变区示意图；
图6为单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区示意图；
图7为单克隆抗体BCoV6-31的轻链可变区示意图；
图8为单克隆抗体BCoV2-3与MERS-CoV S1、S2的结合活性结果图；
图9为单克隆抗体BCoV6-25与MERS-CoV S1、S2的结合活性结果图；
图10为单克隆抗体BCoV6-31与MERS-CoVS2的结合活性结果图；
图11为单克隆抗体BCoV2-3与其他人类冠状病毒的交叉结合活性结果图；
图12为单克隆抗体BCoV6-25与其他人类冠状病毒的交叉结合活性结果图；
图13为单克隆抗体BCoV6-31与其他人类冠状病毒的交叉结合活性结果图；
图14为单克隆抗体BCoV2-3线性表外与构象表位鉴定结果图；
图15为单克隆抗体BCoV6-25线性表外与构象表位鉴定结果图；
图16为单克隆抗体BCoV6-31线性表外与构象表位鉴定结果图；
图17为实施例3的中和抑制率结果图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的筛选
本实施例提供了一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的筛选方法，包括以下步骤：
（1）流式单细胞分选MERS-CoVS2特异的Memory B细胞
采集湖南省郴州市第一人民医院若干名冠状病毒MERS--CoV-2感染恢复患者外周血，分离得到PBMC，于液氮中冻存备用；
将收集的冠状病毒MERS--CoV-2感染恢复患者外周血PBMC从液氮复苏；
加入完全培养基37 ℃静置过夜，其中，所述完全培养基为含10%胎牛血清（Gibco，货号：10270-106）的1640（Gibco，货号：C11875500CP）培养基；
随后进行Live/dead（ThermoFisher，货号：L34962）、CD3（BD Biosciences，货号：612752）、CD19（Biolegend，货号：302230）、IgD（Biolegend，货号：348240）、CD27（Biolegend，货号：356412）、IgG（BD Biosciences，货号：555787）以及MERS-CoVS2探针的细胞染色，所述探针为Alexa Fluor™488蛋白标记试剂盒（ThermoFisher，货号：A20181）标记的MERS-CoVS2蛋白（义翘神州，货号：40070-V08B）；
流式分选Live/dead-CD3-CD19+IgD-CD27+IgG+以及MERS-CoVS2探针阳性的B细胞，获得MERS-CoVS2蛋白特异的Memory B细胞。
（2）扩增MERS-CoV特异的Memory B细胞Ig可变区序列（参照文献：Wardemann, H等，Methods Mol Biol, 2019. 1956: p. 105-125.进行）
将配好的细胞裂解液加入96孔PCR板内，体系如下表1所示；
表1（细胞裂解液）
将分选的MERS-CoVS2蛋白特异Memory B细胞添加至加有上述细胞裂解液的96孔PCR板内；
将96孔PCR板置于干冰上，速冻裂解细胞；
68 ℃温育1分钟后，冰浴；
配置cDNA合成体系，具体如下表2所示：
表2
PCR扩增获得抗体可变区cDNA，其中，PCR反应条件为：42 ℃ 5 min，25 ℃ 10min，50 ℃ 60 min，94 ℃ 5 min；
Ig可变区第一轮扩增，反应体系如下表3所示：
表3
上述5’ First PCR primer mix和3’ First PCR primer mix参照文献：Wardemann, H等，Methods Mol Biol, 2019. 1956: p. 105-125。
PCR扩增获得第一轮PCR扩增产物，其中PCR反应条件为：94 ℃ 15 min预变性；94℃ 30 s，58 ℃ 30 s（IgH和Igκ）或者60 ℃ 30 s（Igλ），72 ℃ 55 s扩增50循环；72 ℃ 10min；
Ig可变区第二轮扩增，反应体系如下表4所示：
表4
其中，上述5’ Second PCR primer mix和3’ Second PCR primer mix均参照文献：Wardemann, H等，Methods Mol Biol, 2019. 1956: p. 105-125。
PCR扩增获得第二轮PCR扩增产物，其中PCR反应条件为：94 ℃ 15 min预变性；94℃ 30 s，58 ℃ 30 s（IgH和Igκ）或者60 ℃ 30 s（Igλ），72 ℃ 45 s扩增50循环；72 ℃ 10min；
通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，货号：DP209-03）回收第二轮PCR扩增产物；
Ig可变区特异性扩增，反应体系如下表5所示：
表5
其中，上述5’ Specific PCR primer mix和3’ Specific PCR primer mix参照文献：Wardemann, H等，Methods Mol Biol, 2019. 1956: p. 105-125。
PCR反应条件：94 ℃ 15 min预变性；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s（IgH和Igκ）或者60℃ 30 s（Igλ），72 ℃ 45 s扩增50循环；72 ℃ 10 min；
琼脂糖凝胶电泳检测扩增的特异性PCR产物。
通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，货号：DP209-03）回收特异性PCR产物。
（3）构建表达质粒，体外转染、表达以及纯化单克隆抗体
1、构建表达质粒
上述特异性PCR产物（IgH，Igκ和Igλ）各取30.4 μL，分别加入3.4 μL CutSmart缓冲液（NEB，货号：B7204S）混匀，获得相应的混合料；
配置酶切体系，具体如下表6所示：
其中，上述AgeI-HF、SalI-HF、BsiWI-HF以及XhoI为NEB限制性内切酶，货号分别为R3552L（AgeI-HF）、R3138L（SalI-HF）、R3553L（BsiWI-HF）和R0146L（XhoI）。
在步骤a中的各混合料中分别加入对应的配置好的步骤b的混合料；
于37 ℃酶切2 h；
使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，货号：DP209-03）将酶切后的产物回收；
连接酶切后的特异性PCR产物与相应载体，连接体系如下表7所示：
表7
其中，上述IgH载体为AbVec2.0-IGHG1（AddGene，货号：80795），Igκ载体为AbVec1.1-IGKC（AddGene，货号：80796），Igλ载体为AbVec1.1-IGLC2-XhoI（AddGene，货号：99575））。
于16 ℃连接过夜；
将上述连接过夜的连接产物加到含有100 μL DH5α感受态细胞（天根，货号：CB101-02）的离心管中，置于冰上冰浴30 min；
将步骤h中的连接产物与感受态细胞的混合物置于42 ℃水浴锅中，热击90 s；
取出置于冰上3-5 min后加入900 μL TB培养基（ThermoFisher，货号：22711022）；
震荡培养45-60 min后，6000 rpm离心1 min；
吸去800 μL上清，并使用剩余的液体将细菌（源自前述感受态细胞）吹打混匀；
将步骤l中的细菌混悬液均匀的涂抹在加有氨苄的琼脂板上；
将琼脂板倒置于37 ℃细菌孵育箱中培养16 h；
挑取琼脂板上单个饱满的菌落与第二轮PCR产物一同送去公司测序；
选取与第二轮PCR产物序列100%匹配的菌落，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒（天根，货号：DP118-02）提取质粒，分别获得重链质粒与轻链质粒。
2、体外转染、表达
转染前一天使用FreeStyle™293表达培养基（Gibco，货号：12338018）将293 F细胞密度调整为1×106个/mL；
转染当天对细胞计数，并使用新鲜的FreeStyle™293表达培养基（Gibco，货号：12338018）将293 F细胞密度调整为2×106个/mL；
配制PEI混合液：将Polyethylenimine (PEI)（Polysciences，货号：23996-2）加入到OptiPRO™SMF培养基(ThermoFisher，货号：12309019)中，使转染时浓度为4 μg/mL;
配制质粒混合液：将提取好的配对重链质粒与轻链质粒按1：2的质量比加入到OptiPRO™SFM培养基(ThermoFisher，货号：12309019)中混匀，使转染时总质粒浓度为1 μg/mL；
最后将PEI混合液加到质粒混合液中轻柔混匀，配成转染混合体系，室温静置20min；
将步骤e中的转染混合体系加入到步骤b中的293 F细胞中，轻柔摇晃混匀；
将步骤f的293 F细胞置于含8% CO2的37 ℃悬浮培养箱中，于125 rpm条件下悬浮培养7天。
3、单克隆抗体的纯化
将所述转染后悬浮培养液于4000 rpm离心15 min收集表达上清；
上清使用0.22 μm滤器（JET，货号：FPE204030）过滤；
打开ÄKTA蛋白纯化仪，使用PBS将Protein A柱子平衡，流速3 mL/min；
随后将过滤后的表达上清加载Protein A柱，流速3 mL/min；
使用PBS洗去Protein A柱上非特异性结合蛋白，流速3 mL/min；
使用pH=3.0的甘氨酸缓冲液洗脱Protein A柱上结合的抗体，流速1 mL/min；
收集洗脱液，获得纯化后的抗体。
4、ELISA筛选与冠状病毒MERS-CoVS蛋白结合的抗体
MERS-CoVS蛋白（Sino Biological，货号：40069-V08B）按2 μg/mL (100 μL/孔)的浓度包被酶标板；
4 ℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
使用含2% FBS（Gibco，货号：10270-106）和2% BSA（Sigma，货号：V900933）的封闭液常温封闭2 h；
使用1×PBST洗去封闭液后，将上述纯化后的抗体按1 μg/mL的浓度加至酶标板中，37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗体后，加入RHP标记的抗人IgG抗体（Jacksonimmunoresearc，货号：109-035-003），37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100 μL TMB显色液（ThermoFisher，货号：002023）常温孵育5 min；
最后加入50 μL 1 M的硫酸终止反应；
使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher Scientific)测量OD值，并通过OD值来反应抗体的结合强度。
根据抗体与MERS-CoVS蛋白的结合强度筛选出本申请的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25和BCoV6-31。本申请的筛选方法流程如图1所示。
经过测序，所述单克隆抗体BCoV2-3包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为DSTISIYW的CDR1、氨基酸序列为INPDGSRA的CDR2和氨基酸序列为ARDFDRVP的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SSDIGHYNF的CDR1、氨基酸序列为DVS的CDR2和氨基酸序列为SSFTSSNTYV的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-25包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GSTFSDYY的CDR1、氨基酸序列为ITSSGSSV的CDR2和氨基酸序列为ATIRRYFIDGVNYWVDFDY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SGDVGNYNL的CDR1、氨基酸序列为EDS的CDR2和氨基酸序列为CSYAGSA的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-31包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GFPFSSYA的CDR1、氨基酸序列为ISDDGSNT的CDR2和氨基酸序列为ARGSSGWVPSEY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为QAIDTS的CDR1、氨基酸序列为AAS的CDR2和氨基酸序列为QQLNSYPIT的CDR3。
所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。
所述单克隆抗体BCoV2-3的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:12所示。
编码所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:15所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:16所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:17所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:18所示。
单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区、轻链可变区示意图如图2-3所示；
单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区、轻链可变区示意图如图4-5所示；
单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区、轻链可变区示意图如图6-7所示。
实施例2、结合实验
（1）ELISA确定单克隆抗体与MERS-CoV S蛋白结合的靶点
将MERS-CoV S1蛋白（Sino Biological，货号：40069-V08H）或MERS-CoV S2蛋白（Sino Biological，货号：40070-V08B）按2 μg/mL (100 μL/孔)的浓度包被酶标板；
4 ℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
使用含2% FBS（Gibco，货号：10270-106）和2% BSA（Sigma，货号：V900933）的封闭液常温封闭2 h；
使用1×PBST洗去封闭液后，将上述纯化后的抗体（单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25、BCoV6-31）以及对照抗体分别按10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005、0.0017以及0μg/mL的浓度加至酶标板中，37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗体后，加入RHP标记的抗人IgG抗体（Jacksonimmunoresearc，货号：109-035-003），37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100 μL TMB显色液（ThermoFisher，货号：002023）常温孵育5 min；
最后加入50 μL 1 M的硫酸终止反应；
使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher Scientific)测量OD值，并通过OD值来反应抗体的结合强度。
结果如图8所示，单克隆抗体BCoV2-3对MERS-CoVS1和S2都蛋白展现出强效的结合能力，表明该单克隆抗体BCoV2-3是靶向S1与S2的抗体。
结果如图9所示，单克隆抗体BCoV6-25对MERS-CoVS1和S2都蛋白展现出强效的结合能力，表明该单克隆抗体BCoV6-25是靶向S1与S2的抗体。
结果如图10所示，单克隆抗体BCoV6-31对MERS-CoVS1蛋白展现出强效的结合能力，表明该单克隆抗体BCoV6-31是靶向S1的抗体。
（2）ELISA检测构建抗体与其他人类冠状病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63）spike蛋白的半数效应浓度（EC50）
将SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63 spike全长蛋白（Sino Biological，货号：40589-V08B1、40634-V08B、40606-V08B、40607-V08B、40605-V08B、40604-V08B）蛋白按2 μg/mL (100 μL/孔)的浓度包被酶标板；
4 ℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
使用含2% FBS（Gibco，货号：10270-106）和2% BSA（Sigma，货号：V900933）的封闭液常温封闭2 h；
使用1×PBST洗去封闭液后，将实施例1中纯化的抗体（单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25、BCoV6-31）分别稀释稀释（使用含2% FBS（Gibco，货号：10270-106）和2% BSA（Sigma，货号：V900933）的封闭液进行稀释），获得浓度分别为10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005、0.0017以及0μg/mL的抗体溶液，将抗体溶液分别加入到酶标板中，37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗体，随后加入RHP标记的抗人IgG抗体（JacksonImmunoResearch，货号：109-035-003），37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100 μL TMB显色液（ThermoFisher，货号：002023）常温孵育5 min；
最后加入50 μL 1 M的硫酸终止反应；
使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher)测量OD值；
数据经过Prism 8.0软件(GraphPad)计算，获得抗体对人类冠状病毒的半数效浓度（EC50）。
结果如图11所示，单克隆抗体BCoV2-3对其他六种人类冠状病毒Spike都展现出强效的结合能力。
结果如图12所示，单克隆抗体BCoV6-25对其他六种人类冠状病毒Spike都展现出强效的结合能力。
结果如图13所示，单克隆抗体BCoV6-31抗体对其他六种人类冠状病毒Spike都展现出强效的结合能力。
实施例3、病毒中和实验
（1）假病毒包被
感染前一天以5×106个/孔密度将293 T细胞接种到10 cm的细胞培养皿中；
编码MERS-CoV S（GenBank：NC_019843.3）蛋白的基因序列，由南京金斯瑞公司合成并插入到pcDNA3.1载体中。
配制质粒混合液：将步骤b合成的质粒与质粒PNL4-3（Genebank：AF324493.2）按1：3的质量比加入到Opti-MEM™（ThermoFisher，货号：31985062）培养基中混匀，使总质粒浓度为1 μg/mL；
配制PEI混合液：再将Polyethylenimine (PEI)（Polysciences，货号：23996-2）加入到Opti-MEM™培养基（ThermoFisher，货号：31985062）中，使转染时浓度为4 μg/mL;
最后将PEI混合液加到质粒混合液中轻柔混匀，配成转染混合体系，室温静置20min；
弃去步骤a中的293 T细胞培养基，将步骤d中的转染混合体系加入到293 T细胞中；
将步骤f的293 T细胞置于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养6 h；
将转染混合体系吸出，置换为新鲜配置的含有10% FBS（Gibco，货号：10270-106）的DMEM培养基（Gibco，货号：11995065）；
置于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养72 h后，12000 rpm离心15 min收集上清，所述上清即为包装好的假病毒。
（2）假病毒中和实验检测抗体对冠状病毒MERS-CoV S突变株的抑制浓度
感染前一天以2×104个/mL密度将293T/hACE2细胞按每孔100 μL接种到96孔板（所用培养基为：含10%FBS的DMEM）中;
感染当天，将实施例1所得的纯化的抗体（单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25、BCoV6-31）分别与上述包装好的假病毒混合，稀释，获得多组混合液；
其中，各组混合液包括单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25、BCoV6-31的浓度分别为10和1 μg/mL等不同浓度的混合液；用含10% FBS（Gibco，货号：10270-106）的DMEM培养基（Gibco，货号：11995065）进行稀释；
将步骤b获得的抗体与假病毒的混合液置于37 ℃孵育1 h；
弃去步骤a中96孔板中的培养基，加入步骤c中的抗体与病毒的混合液，800 g离心30 min；
置于37 ℃细胞培养箱孵育6-8 h后，弃去抗体与病毒的混合液，加入新鲜配置的含10% FBS（Gibco，货号：10270-106）的DMEM培养基（Gibco，货号：11995065）；
细胞继续培养48 h后，于96孔培养板中每孔加入50 μL的细胞裂解液（Promega，货号：E153A），37 ℃裂解2 min；
随后将96孔培养板置于-40 ℃冷冻30 min；
冷冻后，将96孔培养板取出置于37 ℃裂解3 min，再2000 rpm离心1 min，获得细胞裂解液；
吸40 μL上述细胞裂解液加入96孔黑色平地板中；
再加入50 μL荧光素酶检测试剂（Promega，货号：E1501），通过Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher)测量OD值；
计算中和抑制率：抑制率＝[1－(加有抗体与病毒混合物孔OD值－空白孔OD值)/(未加抗体，只加病毒孔OD值－空白孔OD值]×100％，参考图17。
实施例4、抗体结合表位的测定
将MERS-CoVS2蛋白（Sino Biological，货号：40070-V08B）按2 μg/mL (100 μL/孔)的浓度包被酶标板；
4 ℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
用或不用变性缓冲液（50 ml/well；200 mM DTT and 4% SDS in PBS）处理包被好的S2，每孔加入50μL，37℃处理一小时。然后使用1×PBST洗涤五次；
使用含2% FBS（Gibco，货号：10270-106）和2% BSA（Sigma，货号：V900933）的封闭液常温封闭2 h；
使用1×PBST洗去封闭液后，将上述纯化后的抗体（单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25、BCoV6-31）以及对照抗体（2HCV5）分别按10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005、0.0017以及0μg/mL的浓度加至酶标板中，37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗体后，加入RHP标记的抗人IgG抗体（Jacksonimmunoresearc，货号：109-035-003），37 ℃孵育1 h；
使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100 μL TMB显色液（ThermoFisher，货号：002023）常温孵育5 min；
最后加入50 μL 1 M的硫酸终止反应；
使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher Scientific)测量OD值，并通过OD值来反应抗体的结合强度。
结果如图14所示，BCoV2-3抗体是识别S蛋白的不连续的构象表位。
结果如图15所示，BCoV6-25抗体是识别S蛋白的连续的线性表位。
结果如图16所示，BCoV6-31抗体是识别S蛋白的连续的线性表位。
本申请的单克隆抗体BCoV2-3、BCoV6-25能够分别结合MERS-CoV S1和S2,且对另外六种人类冠状病毒具有特异性结合活性。这些抗体将有助于未来针对多种冠状病毒的中和抗体和结合抗体的研究，以及针对泛冠状病毒的疫苗设计。并可以单独或组合可用于开发区分MERS-CoV和其他冠状病毒的诊断方法。
本申请的单克隆抗体BCoV6-31能够结合MERS-CoV S1，对另外六种人类冠状病毒具有特异性结合活性，且能识别S蛋白线性表位。这些抗体将有助于未来针对多种冠状病毒的中和抗体和结合抗体的研究，以及针对泛冠状病毒的疫苗设计。并可以单独或组合可用于开发区分MERS-CoV和其他冠状病毒的诊断方法。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为单克隆抗体BCoV2-3、单克隆抗体BCoV6-25、单克隆抗体BCoV6-31中的一种；
所述单克隆抗体BCoV2-3包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为DSTISIYW的CDR1、氨基酸序列为INPDGSRA的CDR2和氨基酸序列为ARDFDRVP的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SSDIGHYNF的CDR1、氨基酸序列为DVS的CDR2和氨基酸序列为SSFTSSNTYV的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-25包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GSTFSDYY的CDR1、氨基酸序列为ITSSGSSV的CDR2和氨基酸序列为ATIRRYFIDGVNYWVDFDY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为SGDVGNYNL的CDR1、氨基酸序列为EDS的CDR2和氨基酸序列为CSYAGSA的CDR3；
所述单克隆抗体BCoV6-31包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列为GFPFSSYA的CDR1、氨基酸序列为ISDDGSNT的CDR2和氨基酸序列为ARGSSGWVPSEY的CDR3；以及所述轻链可变区包括氨基酸序列为QAIDTS的CDR1、氨基酸序列为AAS的CDR2和氨基酸序列为QQLNSYPIT的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。
3.如权利要求1所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体BCoV2-3的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ IDNO:8所示；
所述单克隆抗体BCoV6-25的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示；
所述单克隆抗体BCoV6-31的重链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示；轻链全长的氨基酸序列为SEQ ID NO:12所示。
4.一种核酸分子，所述核酸分子包括编码权利要求1~3任一项所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码所述单克隆抗体BCoV2-3的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-25的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:15所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:16所示；
编码所述单克隆抗体BCoV6-31的重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:17所示；编码所述单克隆抗体BCoV2-3的轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:18所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求4或5所述的核酸分子。
7.如权利要求1~3任一项所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体在制备检测冠状病毒S蛋白的试剂中的应用，所述冠状病毒为MERS-CoV、SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63中的至少一种。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体用于冠状病毒的免疫学检测。
9.一种检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~3任一项所述的抗冠状病毒S蛋白的单克隆抗体。
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