CN117801097A - 一种广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种广谱抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的抗体及其应用，所述广谱抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的抗体包括重链和轻链，所述广谱抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的抗体至少具有如下技术特征之一：(1)所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：GFTFSRYA；(2)所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IYGGPNTT；(3)所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；(4)所述轻链包括轻链CDR1，其氨基酸序列为：SSNIGKNA；(5)所述轻链包括轻链CDR2，其氨基酸序列为：FDN；(6)所述轻链包括轻链CDR3，其氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的抗体能够有效阻断新型冠状病毒RBD与宿主受体蛋白ACE2的结合，且对多种新型冠状病毒具有强效的结合能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体及其应用，属于生物医药领域。
背景技术
SARS-CoV-2属β型冠状病毒，与SARS-CoV的核酸同源性为79.6％，其天然宿主尚不清楚。SARS-CoV-2可通过病毒外壳上的Spike糖蛋白S1亚基的受体识别结构域(receptorbinding domain，RBD)与ACE2结合，从而入侵宿主细胞。该病毒传染性强，传播途径广，能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂。
目前，全球各国已有多种疫苗经批准紧急投入使用中，然而根据前期冠状病毒感染研究经验，冠状病毒疫苗诱导的抗体可能难以提供长期的保护，对于迅速突变的新型冠状病毒感染，其保护范围及保护时间均相当有限。同时，在尚未有效治疗药物的流行早期，就有给予重症患者使用康复期患者的血浆治疗的案例，且具有明显的效果。恢复期血浆治疗由于缺乏随机对照临床试验，导致其疗效一直没有下定论。此外，为了确保血浆的安全性，血浆输注前必须进行肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒和寄生虫等血液传播病原体的筛查，还需要考虑批次间的变异性和血型的匹配等，十分复杂。因此，在康复者外周血筛选具有中和作用的人源单克隆抗体，是预防和治疗COVID-19的另一切实可行的方法。其中从恢复期病人体内获得的全人源单克隆抗体更具有成药潜能。高亲和力和高中和活性的人源抗体对新型冠状病毒疫情控制和重症患者治疗方面都具有重大的应用价值。
SARS-CoV-2是一种正链单股RNA病毒，RNA病毒的特点是突变率高，并且随着时间的推移会积累突变，而这种突变累积是驱动病毒进化和基因组变异，从而逃避宿主免疫并产生耐药性的主要驱动力(Duffy S，PLoS Biol,2018 08；16(8))。最近研究表明SARS-CoV-2仍在全世界范围内进化，Korber B等研究发现了SARS-CoV-2 13个正在累积的S蛋白突变，其中614位的显性突变体(天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)取代，D614G突变)远在COVID-19大流行初期就已经出现，该突变体已在世界许多地方占据主导地位，呈全球大流行趋势(Korber B等,Cell,2020 08 20；182(4))。随后，Cassia W等发现相比D614，G614感染患者的临床样本具有更高水平的病毒RNA，并且感染患者年龄趋于年轻化。目前已经有五种新冠突变株被世卫组织列为值得关注的突变株(VOC)，除了正在流行的Omicron突变株外，还有Alpha、Beta、Gamma和Delta突变株。新冠突变株的最大特点是会对疫苗免疫和中和抗体产生逃逸，目前新冠Omicron突变株已经对多株上市以及处于临床实验的新冠中和抗体产生了抵抗。因此需要发掘能抵抗新冠突变株逃逸的强效广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体以应对当前流行的Omicron突变株。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种强效广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体(SCM15-45)，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体包括重链和轻链，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体至少具有如下技术特征之一：
(1)所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：GFTFSRYA；
(2)所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IYGGPNTT；
(3)所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；
(4)所述轻链包括轻链CDR1，其氨基酸序列为：SSNIGKNA；
(5)所述轻链包括轻链CDR2，其氨基酸序列为：FDN；
(6)所述轻链包括轻链CDR3，其氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。
进一步地，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体至少具有如下技术特征之一：
(a)所述重链包括重链CDR1-3，重链CDR1的氨基酸序列为：GFTFSRYA，重链CDR2的氨基酸序列为：IYGGPNTT，重链CDR3的氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；
(b)所述轻链包括轻链CDR1-3，轻链CDR1的氨基酸序列为：SSNIGKNA，轻链CDR2的氨基酸序列为：FDN，轻链CDR3的氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。
进一步地，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体具有如下技术特征：所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：GFTFSRYA；所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IYGGPNTT；所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；所述轻链包括轻链CDR1，其氨基酸序列为：SSNIGKNA；所述轻链包括轻链CDR2，其氨基酸序列为：FDN；所述轻链包括轻链CDR3，其氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。
进一步地，所述重链还包括重链FR1-4，重链FR1的氨基酸序列为
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS，重链FR2的氨基酸序列为MSWVRQAPGKGLEWVSV，重链FR3的氨基酸序列为YYADSVKGRFSISRDNSKSTLYLQMNSLRVEDTAVYYC，重链FR4的氨基酸序列为WGQGSLVTVSS。
进一步地，所述轻链还包括轻链FR1-4，轻链FR1的氨基酸序列为
QSALTQPPSVSEAPTQRVTISCSGG，轻链FR2的氨基酸序列为VSWYQQLPGKAPRLLIY，轻链FR3的氨基酸序列为LLPSGVSHRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC，轻链FR4的氨基酸序列为FGTGTKVTVL。
进一步地，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，编码广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO：3所示；编码广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO：4所示。
编码如上所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子包括核苷酸序列SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4。
如上所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体在制备用于诊断试剂或诊断试剂盒或药物中的应用。
进一步地，所述药物具有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和作用；优选地，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2包括新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1病毒株、新型冠状病毒Alpha突变株、新型冠状病毒Beta突变株、新型冠状病毒Gamma突变株、新型冠状病毒Delta突变株、新型冠状病毒Omicron突变株中的一种或几种。
如上所述的核酸分子在制备广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体或药物中的应用。
进一步地，所述药物具有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和作用；优选地，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2包括新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1病毒株、新型冠状病毒Alpha突变株(B.1.1.7)、新型冠状病毒Beta突变株(B.1.351)、新型冠状病毒Gamma突变株(P1)、新型冠状病毒Delta突变株(B.1.617.2)、新型冠状病毒Omicron突变株(B.1.1.529)中的一种或几种。
含有如上所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
可选地，本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的制备方法包括如下步骤：
S1、从新型冠状病毒SARS-CoV-2感染恢复患者外周血中分选获得SARS-CoV-2特异的Memory B细胞；
S2、扩增SARS-CoV-2特异的Memory B细胞的Ig可变序列，获得特异性扩增产物；
S3、构建表达质粒，体外转染、表达、纯化，获得广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体。
本发明通过流式单细胞分析分选技术、单个B细胞PCR扩增抗体制备技术，从新冠康复患者PBMC中分选棘突蛋白(Spike)特异的单个记忆性B细胞，并直接克隆抗体重链以及轻链可变区序列，构建成表达质粒并表达纯化得到新型冠状病毒SARS-CoV-2的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体(SCM15-45)。
本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体是特异性靶向RBD的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体，能够特异性结合多种新型冠状病毒突变株，具有强结合力，该特异性广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体能够有效阻断多种新型冠状病毒突变株与受体蛋白的结合，是有效的广谱中和活性单抗。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1)本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的制备流程简单快速，而且获得的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体为全人源抗体，无免疫原性。
2)本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体能够有效阻断新型冠状病毒RBD与宿主受体蛋白ACE2的结合，且对多种新型冠状病毒具有强效的结合能力。
3)本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体对流行的新冠突变株(Alpha，Beta，Gamma，Delta以及Omicron)，特别是Omicron突变株，具有强效广谱的中和作用。
附图说明
图1是本发明中流式细胞术分选SARS-CoV-2 S蛋白特异性记忆B细胞的流程图。
图2是本发明的抗体基因PCR产物凝胶电泳图。
图3是本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的序列图。
图4是本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链可变区的序列图。
图5是本发明的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体与新型冠状病毒株、突变株的结合情况图。
图6是本发明的不同浓度广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体与新型冠状病毒Omicron突变株的结合情况图。
图7是本发明的不同浓度广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体与新型冠状病毒Wuhan-hu-1、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron突变株的中和情况图。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
参见图1，获得新型冠状病毒SARS-CoV-2的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体(SCM15-45)的具体方法如下：
(1)流式单细胞分选SARS-CoV-2特异的Memory B细胞
a.采集若干名新型冠状病毒SARS-CoV-2感染恢复患者外周血，分离得到PBMC，于液氮中冻存备用；
b.将收集的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染恢复患者外周血PBMC从液氮复苏；
c.加入完全培养基37℃静置过夜，其中，所述完全培养基为含10％胎牛血清(Gibco，货号：10270-106)的1640(Gibco，货号：C11875500CP)培养基；
d.随后进行Live/dead(ThermoFisher，货号：L34962)、CD3(BD Biosciences，货号：612752)、CD19(Biolegend，货号：302230)、IgD(Biolegend，货号：348240)、CD27(Biolegend，货号：356412)、IgG(BD Biosciences，货号：555787)以及SARS-CoV-2 S探针的细胞染色，其中，所述探针为Alexa FluorTM 488蛋白标记试剂盒(ThermoFisher，货号：A20181)标记的SARS-CoV-2 S ECD蛋白(义翘神州，货号：40589-V08B1)；
e.流式分选Live/dead-CD3-CD19+IgD-CD27+IgG+以及SARS-CoV-2 S探针阳性的B细胞，获得SARS-CoV-2 S蛋白特异的Memory B细胞。
(2)扩增SARS-CoV-2特异的Memory B细胞Ig可变区序列(参照文献：Wardemann,H等，Methods Mol Biol,2019.1956:p.105-125.进行)
a.将配好的细胞裂解液加入96孔PCR板内，体系如下；
b.将分选的SARS-CoV-2 S蛋白特异Memory B细胞添加至加有上述细胞裂解液的96孔PCR板内；
c.将96孔PCR板置于干冰上，速冻裂解细胞；
d.68℃温育1分钟后，冰浴；
e.配置cDNA合成体系，具体如下表所示：
f.PCR扩增获得抗体可变区cDNA，其中，PCR反应条件为：42℃5min，25℃10min，50℃60min，94℃5min；
g.Ig可变区第一轮扩增，反应体系如下：
其中，上述5’First PCR primer mix和3’First PCR primer mix均参照文献：Wardemann,H等，Methods Mol Biol,2019.1956:p.105-125。
h.PCR扩增获得第一轮PCR扩增产物，其中PCR反应条件为：94℃15min预变性；94℃30s，58℃30s(IgH和Igκ)或者60℃30s(Igλ)，72℃55s扩增50循环；72℃10min；
i.Ig可变区第二轮扩增，反应体系如下：
其中，上述5’Second PCR primer mix和3’Second PCR primer mix均参照文献：Wardemann,H等，Methods Mol Biol,2019.1956:p.105-125。
j.PCR扩增获得第二轮PCR扩增产物，其中PCR反应条件为：94℃15min预变性；94℃30s，58℃30s(IgH和Igκ)或者60℃30s(Igλ)，72℃45s扩增50循环；72℃10min；
k.通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，货号：DP209-03)回收第二轮PCR扩增产物；
l.Ig可变区特异性扩增，反应体系如下：
其中，上述5’Specific PCR primer mix和3’Specific PCR primer mix均参照文献：Wardemann,H等，Methods Mol Biol,2019.1956:p.105-125。
m.PCR反应条件：94℃15min预变性；94℃30s，58℃30s(IgH和Igκ)或者60℃30s(Igλ)，72℃45s扩增50循环；72℃10min；
n.琼脂糖凝胶电泳检测扩增的特异性PCR产物，结果如图2所示；
o.通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，货号：DP209-03)回收特异性PCR产物。
(3)构建表达质粒，体外转染、表达以及纯化抗体
3.1构建表达质粒
a.上述特异性PCR产物(IgH，Igκ和Igλ)各取30.4μL，分别加入3.4μL CutSmart缓冲液(NEB，货号：B7204S)混匀，获得相应的混合料；
b.配置酶切体系，具体如下：
其中，上述AgeI-HF、SalI-HF、BsiWI-HF以及XhoI为NEB限制性内切酶，货号分别为R3552L(AgeI-HF)、R3138L(SalI-HF)、R3553L(BsiWI-HF)和R0146L(XhoI)。
c.在步骤a中的相应混合料中分别加入对应的配置好的步骤b的混合料；
d.于37℃酶切2h；
e.使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，货号：DP209-03)将酶切后的产物回收；
f.连接酶切后的特异性PCR产物与相应载体，连接体系如下：
其中，上述IgH载体为AbVec2.0-IGHG1(AddGene，货号：80795)，Igκ载体为AbVec1.1-IGKC(AddGene，货号：80796)，Igλ载体为AbVec1.1-IGLC2-XhoI(AddGene，货号：99575))。
g.于16℃连接过夜；
h.将上述连接过夜的连接产物加到含有100μL DH5α感受态细胞(天根，货号：CB101-02)的离心管中，置于冰上冰浴30min；
i.将步骤h中的连接产物与感受态细胞的混合物置于42℃水浴锅中，热击90s；
j.取出置于冰上3-5min后加入900μL TB培养基(ThermoFisher，货号：22711022)；
k.震荡培养45-60min后，6000rpm离心1min；
l.吸去800μL上清，并使用剩余的液体将细菌(源自前述感受态细胞)吹打混匀；
m.将步骤l中的细菌混悬液均匀的涂抹在加有氨苄的琼脂板上；
n.琼脂板倒置于37℃细菌孵育箱中培养16h；
o.挑取琼脂板上单个饱满的菌落与第二轮PCR产物一同送去公司测序；
p.选取与第二轮PCR产物序列100％匹配的菌落，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根，货号：DP118-02)提取质粒，分别获得重链质粒与轻链质粒。
3.2体外转染、表达
a.转染前一天使用FreeStyleTM 293表达培养基(Gibco，货号：12338018)将293F细胞密度调整为1×106个/mL；
b.转染当天对细胞计数，并使用新鲜的FreeStyleTM 293表达培养基(Gibco，货号：12338018)将293F细胞密度调整为2×106个/mL；
c.配制PEI混合液：将Polyethylenimine(PEI)(Polysciences，货号：23996-2)加入到OptiPROTM SMF培养基(ThermoFisher，货号：12309019)中，使转染时浓度为4μg/mL；
d.配制质粒混合液：将提取好的配对重链质粒与轻链质粒按1：2的质量比加入到OptiPROTM SFM培养基(ThermoFisher，货号：12309019)中混匀，使转染时总质粒浓度为1μg/mL；
e.最后将PEI混合液加到质粒混合液中轻柔混匀，配成转染混合体系，室温静置20min；
f.将步骤e中的转染混合体系加入到步骤b中的293F细胞中，轻柔摇晃混匀；
g.将步骤f的293F细胞置于含8％ CO2的37℃悬浮培养箱中，于125rpm条件下悬浮培养7天。
3.3抗体的纯化
a.将所述转染后悬浮培养液于4000rpm离心15min，收集表达上清；
b.上清使用0.22μm滤器(JET，货号：FPE204030)过滤；
c.打开蛋白纯化仪，使用PBS将Protein A柱子平衡，流速3mL/min；
d.随后将过滤后的表达上清加载Protein A柱，流速3mL/min；
e.使用PBS洗去Protein A柱上非特异性结合蛋白，流速3mL/min；
f.使用pH＝3.0的甘氨酸缓冲液洗脱Protein A柱上结合的抗体，流速1mL/min；
g.收集洗脱液，获得纯化后的抗体。
(4)ELISA筛选与新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 S蛋白结合的抗体
a.将SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 S蛋白按2μg/mL(100μL/孔)的浓度包被酶标板；
b.4℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
c.使用含2％ FBS(Gibco，货号：10270-106)和2％ BSA(Sigma，货号：V900933)的封闭液常温封闭2h；
d.使用1×PBST洗去封闭液后，将上述纯化后的抗体按1μg/mL的浓度加至酶标板中，37℃孵育1h；
e.使用1×PBST洗去未结合的抗体后，加入RHP标记的抗人IgG抗体(Jacksonimmunoresearc，货号：109-035-003)，37℃孵育1h；
f.使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100μL TMB显色液(ThermoFisher，货号：002023)常温孵育5min；
g.最后加入50μL 1M的硫酸终止反应；
h.使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisherScientific)测量OD值，并通过OD值来反应抗体的结合强度。
根据抗体与SARS-CoV-2 S蛋白的结合强度选出广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体(SCM15-45)。
经测序鉴定，该广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO：3所示；编码广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO：4所示。广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
SEQ ID NO：1：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGGPNTTYYADSVKGRFSISRDNSKSTLYLQMNSLRVEDTAVYYCFLGGSGAFDYWGQGSLVTVSS。
SEQ ID NO：2：
QSALTQPPSVSEAPTQRVTISCSGGSSNIGKNAVSWYQQLPGKAPRLLIYFDNLLPSGVSHRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNVYVFGTGTKVTVL。
SEQ ID NO：3：
GAAGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGATCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTTAGTAGATATGCCATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATGGCGGTCCTAATACCACATACTACGCAGACTCCGTTAAGGGCCGATTCAGCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTTTCTTGGGAGGGTCGGGAGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAGTCTGGTCACCGTCTCCTCA。
SEQ ID NO：4：
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCTGAAGCCCCCACACAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAGGCAGCTCCAATATCGGAAAAAATGCTGTAAGCTGGTACCAACAACTCCCAGGAAAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATTTTGATAATCTGCTGCCCTCAGGGGTCTCTCACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGAATGTTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA。
SEQ ID NO：5：
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGGPNTTYYADSVKGRFSISRDNSKSTLYLQMNSLRVEDTAVYYCFLGGSGAFDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
SEQ ID NO：6：
MGWSCIILFLVATATGSWAQSALTQPPSVSEAPTQRVTISCSGGSSNIGKNAVSWYQQLPGKAPRLLIYFDNLLPSGVSHRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNVYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
实施例2：结合实验
(1)ELISA检测构建抗体与新型冠状病毒突变株S蛋白的结合能力
a.将SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或Alpha突变株(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或Beta突变株(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或Gamma突变株(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或Delta突变株(SinoBiological，货号：40589-V08B1)或者Omicron BA.1突变株(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或者Omicron BA.2突变株(Sino Biological，货号：40589-V08B1)S蛋白按2μg/mL(100μL/孔)的浓度包被酶标板；
b.4℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
c.使用含2％ FBS(Gibco，货号：10270-106)和2％ BSA(Sigma，货号：V900933)的封闭液常温封闭2h；
d.使用1×PBST洗去封闭液后，加入1μg/mL实施例1所得的纯化后的抗体，37℃孵育1h；
e.使用1×PBST洗去未结合的抗体，随后加入RHP标记的抗人IgG抗体(JacksonImmunoResearch，货号：109-035-003)，37℃孵育1h；
f.使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100μL TMB显色液(ThermoFisher，货号：002023)常温孵育5min；
g.最后加入50μL 1M的硫酸终止反应；
h.使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisherScientific)测量OD值。
结果如图5所示，SCM15-45对所有新型冠状病毒VOC突变株展现出强效的结合能力。
(2)ELISA检测构建抗体与新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1和Omicron突变株S蛋白的半数效应浓度(EC50)
a.将SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(Sino Biological，货号：40589-V08B1)或OmicronBA.1(Sino Biological，货号：40589-V08B33)或Omicron BA.2(Sino Biological，货号：40589-V08H28)突变株S蛋白按2μg/mL(100μL/孔)的浓度包被酶标板；
b.4℃孵育过夜之后使用1×PBST洗去未结合蛋白；
c.使用含2％ FBS(Gibco，货号：10270-106)和2％ BSA(Sigma，货号：V900933)的封闭液常温封闭2h；
d.使用1×PBST洗去封闭液后，将实施例1所得的纯化的抗体稀释(使用含2％ FBS(Gibco，货号：10270-106)和2％ BSA(Sigma，货号：V900933)的封闭液进行稀释)，获得浓度分别为10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046、0.0015、0.0005、0.0017以及0μg/mL的抗体溶液，将抗体溶液分别加入到酶标板中，37℃孵育1h；
e.使用1×PBST洗去未结合的抗体后，随后加入RHP标记的抗人IgG抗体(JacksonImmunoResearch，货号：109-035-003)，37℃孵育1h；
f.使用1×PBST洗去未结合的抗人IgG抗体后，加入100μL TMB显色液(ThermoFisher，货号：002023)常温孵育5min；
g.最后加入50μL 1M的硫酸终止反应；
h.使用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher)测量OD值；
i.数据经过Prism 8.0软件(GraphPad)计算，获得抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1和Omicron突变株的半数效浓度(EC50)。
结果如图6所示，SCM15-45抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1和Omicron BA.2展现出强效的结合能力，特别是对SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1的EC50达到纳克级别，而对SARS-CoV-2 Omicron BA.1则具有中等强度的结合能力，EC50达到微克级别。
实施例3：病毒中和实验
(1)假病毒包被
a.感染前一天以5×106个/孔密度将293T细胞接种到10cm的细胞培养皿中；
b.编码SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1或Alpha突变株或Beta突变株或Gamma突变株或Delta突变株或者Omicron突变株S蛋白的基因序列，由南京金斯瑞公司合成并插入到pcDNA3.1载体中。其中，上述突变株的基因编号为：SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(Genebank：YP_009724390.1)、SARS-CoV-2 Alpha(Genebank：OV054768.1)、SARS-CoV-2 Beta(Genebank：MZ433432.1)、SARS-CoV-2 Gamm(Genebank：MZ427312.1)、SARS-CoV-2 Delta(Genebank：OK091006.1)、SARS-CoV-2 Omicron BA.1(GISAID ID：EPI_ISL_6590782.2)和SARS-CoV-2Omicron BA.2(Genebank：UKS51680.1)、SARS-CoV-2 Omicron BA.3 spike(GISAID：EPI_ISL_7605589)和SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5 spike(GISAID:EPI_ISL_12268493.2)；
c.配制质粒混合液：将步骤b合成的质粒与质粒PNL4-3(Genebank：AF324493.2)按1：3的质量比加入到Opti-MEMTM(ThermoFisher，货号：31985062)培养基中混匀，使总质粒浓度浓度为1μg/mL；
d.配制PEI混合液：再将Polyethylenimine(PEI)(Polysciences，货号：23996-2)加入到Opti-MEMTM培养基(ThermoFisher，货号：31985062)中，使转染时浓度为4μg/mL；
e.最后将PEI混合液加到质粒混合液中轻柔混匀，配成转染混合体系，室温静置20min；
f.弃去步骤a中的293T细胞培养基，将步骤d中的转染混合体系加入到293T细胞中；
g.将步骤f的293T细胞置于含5％ CO2的37℃细胞培养箱中培养6h；
h.将转染混合体系吸出，置换为新鲜配置的含有10％ FBS(Gibco，货号：10270-106)的DMEM培养基(Gibco，货号：11995065)；
i.置于含5％ CO2的37℃细胞培养箱中培养72h后，12000rpm离心15min收集上清，所述上清即为包装好的假病毒。
(2)假病毒中和实验检测抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.2、Omicron BA.3、Omicron BA.4/5的半数抑制浓度(IC50)
a.感染前一天以0.8×105个/mL密度将293T/hACE2细胞按每孔100μL接种到96孔板(所用培养基为：含10％FBS的DMEM)中；
b.感染当天，将实施例1所得的纯化的抗体分别与上述包装好的假病毒混合，稀释，获得多组混合液；
其中，各组混合液包括抗体浓度分别为100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、0.137、0.046、0.015、
0.005、0.017以及0μg/mL等不同浓度的混合液；用含10％ FBS(Gibco，货号：10270-106)的DMEM培养基(Gibco，货号：11995065)进行稀释；
c.将步骤b获得的抗体与假病毒的混合液置于37℃孵育1h；
d.弃去步骤a中96孔板中的培养基，加入步骤c中的抗体与病毒的混合液，800g离心30min；
e.置于37℃细胞培养箱孵育6-8h后，弃去抗体与病毒的混合液，加入新鲜配置的含10％ FBS(Gibco，货号：10270-106)的DMEM培养基(Gibco，货号：11995065)；
f.细胞继续培养48h后，于96孔培养板中每孔加入50μL的细胞裂解液(Promega，货号：E153A)，37℃裂解2min；
g.随后将96孔培养板置于-40℃冷冻30min；
h.冷冻后，将96孔培养板取出置于37℃裂解3min，再2000rpm离心1min，获得细胞裂解液；
i.吸40μL上述细胞裂解液加入96孔黑色平地板中；
j.再加入50μL荧光素酶检测试剂(Promega，货号：E1501)，通过Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(ThermoFisher)测量OD值；
k.计算中和抑制率：抑制率＝[1－(加有抗体与病毒混合物孔OD值－空白孔OD值)/(未加抗体，只加病毒孔OD值－空白孔OD值]×100％。
l.根据中和抑制率的结果，利用Prism 8.0软件(GraphPad)计算抗体的IC50。
结果如图7所示，SCM15-45对新型冠状病毒SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1以及Alpha、Beta、Gamma、Delta突变株假病毒展现出强效的中和能力，IC50达到纳克级别，此外SCM15-45还对Omicron突变株BA.1、BA.2、BA.3以及BA.4/5都有强有力的中和作用，相比许多上市以及正进行临床实验的新型冠状病毒中和抗体对多种新冠突变株出现逃逸(PMID:35594867,34237773,35790190,35921836,35772405,35714668)，SCM15-45对所有的新型冠状病毒VOC突变株都具有很好的中和活性。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。
Claims (10)
1.一种广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体包括重链和轻链，其特征在于，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体至少具有如下技术特征之一：
(1)所述重链包括重链CDR1，其氨基酸序列为：GFTFSRYA；
(2)所述重链包括重链CDR2，其氨基酸序列为：IYGGPNTT；
(3)所述重链包括重链CDR3，其氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；
(4)所述轻链包括轻链CDR1，其氨基酸序列为：SSNIGKNA；
(5)所述轻链包括轻链CDR2，其氨基酸序列为：FDN；
(6)所述轻链包括轻链CDR3，其氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。
2.根据权利要求1所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体，其特征在于，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体至少具有如下技术特征之一：
(a)所述重链包括重链CDR1-3，重链CDR1的氨基酸序列为：GFTFSRYA，重链CDR2的氨基酸序列为：IYGGPNTT，重链CDR3的氨基酸序列为：FLGGSGAFDY；
(b)所述轻链包括轻链CDR1-3，轻链CDR1的氨基酸序列为：SSNIGKNA，轻链CDR2的氨基酸序列为：FDN，轻链CDR3的氨基酸序列为：ATWDDSLNVYV。
3.根据权利要求1所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体，其特征在于，所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.编码如权利要求1-3任一项所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括核苷酸序列SEQ IDNO：3和/或核苷酸序列SEQ ID NO：4。
6.如权利要求1-3任一项所述的广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体在制备用于诊断试剂或诊断试剂盒或药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物具有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和性抗病毒作用；优选地，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2包括新型冠状病毒SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1病毒株、新型冠状病毒Alpha突变株、新型冠状病毒Beta突变株、新型冠状病毒Gamma突变株、新型冠状病毒Delta突变株、新型冠状病毒Omicron突变株中的一种或几种。
8.如权利要求4或5所述的核酸分子在制备广谱抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体或药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物具有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和作用；优选地，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2包括新型冠状病毒SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1病毒株、新型冠状病毒Alpha突变株、新型冠状病毒Beta突变株、新型冠状病毒Gamma突变株、新型冠状病毒Delta突变株、新型冠状病毒Omicron突变株中的一种或几种。
10.含有如权利要求4或5所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
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